Questo protocollo presenta un metodo per utilizzare la dosimetria radicale in linea e una sorgente di luce plasmatica per eseguire l'impronta proteica di ossidazione flash. Questo metodo sostituisce il pericoloso laser UV per semplificare e migliorare la riproducibilità dell'ossidazione fotochimica veloce degli studi sulle proteine.
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Articolo metodologico
Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'impronta proteica radicale idrossile (HRPF) è una tecnica di analisi strutturale emergente e promettente di ordine superiore che fornisce informazioni sui cambiamenti nella struttura proteica, sulle interazioni proteina-proteina o sulle interazioni proteina-ligando. HRPF utilizza radicali idrossilici(▪OH) per etichettare irreversibilmente la superficie accessibile al solvente di una proteina. La complessità intrinseca, i costi e la natura pericolosa delle prestazioni hrpf hanno sostanzialmente limitato l'adozione su larga scala in biofarmacia. Questi fattori includono: 1) l'uso di laser complicati, pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezza sostanziali; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studi comparativi. Questa pubblicazione fornisce un protocollo per il funzionamento di un sistema HRPF senza laser. Questo sistema HRPF senza laser utilizza una tecnologia di ossidazione flash sorgente di luce al plasma ad alta energia e alta pressione con dosimetria radicale in linea. La sorgente luminosa al plasma è più sicura, più facile da usare e più efficiente nella generazione di radicali idrossili rispetto ai sistemi HRPF basati su laser, e il dosimetro radicale in linea aumenta la riproducibilità degli studi. Combinato, il sistema HRPF senza laser risolve e supera le carenze e i limiti menzionati delle tecniche basate su laser.
Introduzione
La conformazione proteica e la struttura di ordine superiore associata (HOS) sono i principali determinanti della corretta funzione biologica e del comportamento aberrante1. Lo stesso vale per i biofarmaci, la cui struttura e attività funzionale dipendono da vari aspetti della loro produzione e del loro ambiente. Il cambiamento biofarmaceutico nell'HOS è stato collegato a reazioni avverse ai farmaci (ADR) attribuite alla farmacologia indesiderabile e alla risposta immunologicadel paziente 2,3. La comparsa di ADR ha allertato l'industria biofarmaceutica sul ruolo critico che la proteina ....
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Protocollo
1. Installazione del tubo capillare
- Utilizzando una pietra di scissione della silice, scindere il capillare di silice di diametro interno (ID) di 250 μm a 27 pollici. Controllare le estremità capillari per un taglio pulito e dritto.
- Creare due finestre di circa 15 mm di lunghezza bruciando via il rivestimento in poliimmide. Partendo dall'"estremità inferiore" si fa la prima finestra di fotolisi a 90 mm di distanza dall'"estremità inferiore" e la seconda finestra del dosimetro a 225 mm di distanza dall'"estremità inferiore".
NOTA: Una volta bruciato il rivestimento, il capillare è molto fragile. - Svitare il dado e il ferrule alla porta 5....
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Risultati
La sorgente plasmatica ad alta pressione accoppiata con la dosimetria in tempo reale consente un migliore controllo della resa di ▪OH per osservare i cambiamenti nella struttura proteica di ordine superiore in modo più accurato. L'aggiunta di adenina consente un dosimetro radicale efficace in tempo reale. Al momento dell'ossidazione, l'adenina perde assorbanza UV a 265 nm (Figura 2A). Il cambiamento nell'assorbanza dell'adenina è direttamente correlato alla concentrazione di radic.......
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Discussione
Ci sono diversi passaggi critici per garantire una corretta etichettatura delle proteine durante qualsiasi esperimento HRPF. In primo luogo, vengono selezionate una portata appropriata e una velocità di infiammamento della sorgente per assicurarsi che ogni bolo del campione sia irradiato una volta. Ciò garantisce che la proteina sia esposta a un singolo bolo di nuovo ▪OH. Una volta che una proteina viene ossidata, la struttura proteica di ordine superiore può essere alterata. Per essere sicuri che la struttura.......
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Dichiarazioni
E.E.C., J.S.S. e S.R.W. rivelano un significativo interesse finanziario in GenNext Technologies, Inc., una società in fase iniziale che cerca di commercializzare tecnologie per l'analisi della struttura proteica di ordine superiore. I dati rappresentativi forniti sono stati esaminati da S.K.M., che non ha alcun conflitto di interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 e R44GM125420).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da centrifuga coniche da 15 ml | Fisher Scientific | 14-959-53A | qualsiasi marca è sufficiente |
| 50 µ L SGE Siringhe a tenuta di gas | Fisher Scientific | SG-00723 | |
| Acclaim PepMap 100 C18 nanocolonna (0,75 mm X 150 mm, 2 &; m) | Thermo Scientific | ||
| Acetonitrile con 0,1% di acido formico (v/v), grado LC/MS | Fisher Scientific | LS120-500 | |
| Apomioglobina | Sigma-Aldrich | ||
| Catalasi | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Centrifuga | Eppendorf | 022625501 | |
| Tergicristalli per compiti delicati | Fisher Scientific | 06-666A | |
| Perossido di idrogeno | Fisher Scientific | H325-100 | qualsiasi 30% di perossido di idrogeno è sufficiente |
| Metionina ammide | Chem-Impex | 03109 | |
| Microcentrifuga | Thermo Scientific | 75002436 | |
| Orbitrap Fusion Spettrometro di massa tribrido | Lumos Thermo Scientific | Spettrometro di massa tribrido Orbitrap Fusion Lumos | altri strumenti ad alta risoluzione (ad es. Q exactive, Orbitrap o Orbitrap Fusion) possono essere utilizzati |
| Pierce Trypsin Proteasi, MS Grade | Thermo Scientific | 90058 | |
| Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1/32" | Molex | 1068680064 | qualsiasi tagliatubi capillare è sufficiente |
| UPLC | Thermo Scientific | ||
| Water con 0,1% di acido formico (v/v), LC/MS Grade | Fisher Scientific | LS118-500 | |
| Water, LC/MS Grade | Fisher Scientific | W6-4 |
Riferimenti
- Nagarkar, R. P., Murphy, B. M., Yu, X., Manning, M. C., Al-Azzam, W. A. Characterization of protein higher order structure using vibrational circular dichroism spectroscopy. Current Pharmaceutical Biotechnology. 14 (2), 199-208 (2013).
- Giezen, T. J., Schneider, C. K.
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Ristampe e permessi
