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Articolo metodologico

Impronta proteica radicale idrossile senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine

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DOI:

10.3791/61861

⸱

4 giugno 2021

 ,  ,  , 
1GenNext Technologies Inc., 2Department of Biomolecular Sciences, School of Pharmacy, University of Mississippi, 3Department of Chemistry and Biochemistry, University of Mississippi

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo presenta un metodo per utilizzare la dosimetria radicale in linea e una sorgente di luce plasmatica per eseguire l'impronta proteica di ossidazione flash. Questo metodo sostituisce il pericoloso laser UV per semplificare e migliorare la riproducibilità dell'ossidazione fotochimica veloce degli studi sulle proteine.

Abstract

L'impronta proteica radicale idrossile (HRPF) è una tecnica di analisi strutturale emergente e promettente di ordine superiore che fornisce informazioni sui cambiamenti nella struttura proteica, sulle interazioni proteina-proteina o sulle interazioni proteina-ligando. HRPF utilizza radicali idrossilici(▪OH) per etichettare irreversibilmente la superficie accessibile al solvente di una proteina. La complessità intrinseca, i costi e la natura pericolosa delle prestazioni hrpf hanno sostanzialmente limitato l'adozione su larga scala in biofarmacia. Questi fattori includono: 1) l'uso di laser complicati, pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezza sostanziali; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studi comparativi. Questa pubblicazione fornisce un protocollo per il funzionamento di un sistema HRPF senza laser. Questo sistema HRPF senza laser utilizza una tecnologia di ossidazione flash sorgente di luce al plasma ad alta energia e alta pressione con dosimetria radicale in linea. La sorgente luminosa al plasma è più sicura, più facile da usare e più efficiente nella generazione di radicali idrossili rispetto ai sistemi HRPF basati su laser, e il dosimetro radicale in linea aumenta la riproducibilità degli studi. Combinato, il sistema HRPF senza laser risolve e supera le carenze e i limiti menzionati delle tecniche basate su laser.

Introduzione

La conformazione proteica e la struttura di ordine superiore associata (HOS) sono i principali determinanti della corretta funzione biologica e del comportamento aberrante1. Lo stesso vale per i biofarmaci, la cui struttura e attività funzionale dipendono da vari aspetti della loro produzione e del loro ambiente. Il cambiamento biofarmaceutico nell'HOS è stato collegato a reazioni avverse ai farmaci (ADR) attribuite alla farmacologia indesiderabile e alla risposta immunologicadel paziente 2,3. La comparsa di ADR ha allertato l'industria biofarmaceutica sul ruolo critico che la proteina HOS svolge nella sicurezza e nell'efficacia della bioterapia e hanno stabilito la necessità di nuove e migliorate analisi HOS4.

L'ingombro di proteine radicali idrossili (HRPF) è una tecnica promettente per tenere traccia del cambiamento nella proteina HOS. HRPF comporta l'etichettatura irreversibile dell'esterno di una proteina con ▪OH seguita da analisi di spettrometria di massa (MS) per identificare la superficie accessibile al solventedella proteina 5,6,7. HRPF è stato utilizzato con successo per rilevare difetti nella proteina HOS e la suafunzione 8,9, caratterizzano l'HOS degli anticorpi monoclonali (mAb)10,11,12,13,determinare il Kd legante di un ligando14,e molto altro15,16,17,18,19. Un metodo comune per generare il ▪OH per HRPF è l'ossidazione fotochimica veloce delle proteine (FPOP), che impiega laser UV veloci ad alta energia per produrre ▪ OH dallafotolisi di H2O2. Per la maggior parte, FPOP utilizza costosi laser ad eccimeri che impiegano gas pericoloso (KrF) che richiede garanzie sostanziali per evitare lesioni respiratorie eoculari 20. Per evitare rischi di inalazione, altri hanno utilizzato laser in alluminio al neodimio yttrium alluminio quadruplicati a frequenza (Nd:YAG)21, che eliminano l'uso di gas tossici ma sono ancora costosi, richiedono una significativa competenza operativa e richiedono ampi controlli della luce vagante per proteggere gli utenti dalle lesioni agli occhi.

Sebbene sia possibile ottenere ampie informazioni utilizzando HRPF, non è stata soddisfatta un'ampia adozione in biofarmacia. Due ostacoli per la limitata adozione dell'HRPF comprendono: 1) l'uso di laser pericolosi e costosi che richiedono precauzioni di sicurezzasostanziali 20; e 2) l'irriducibilità dell'HRPF causata dallo scavenging di fondo di ▪OH che limitano gli studicomparativi 22. Per soppiantare l'uso del laser, è stata sviluppata un'unità di fotolisi flash al plasma ad alta velocità e ad alta energia per eseguire in modo sicuro FPOP in modo semplice. Per migliorare l'irriducibilità degli esperimenti HRPF, viene implementata la dosimetria radicale in tempo reale.

La pratica dell'HRPF è stata limitata dall'irriducibilità attribuita allo scavenging di fondo ▪OH22. Mentre ▪OH sono eccellenti sonde di topografia proteica, reagiscono anche con molti costituenti trovati nei preparati, rendendo necessario misurare l'effettiva concentrazione di radicale disponibile per ossidare una proteina bersaglio. Variazioni nella preparazione del tampone, concentrazione di perossido di idrogeno, proprietà del ligando o fotolisi possono causare differenze di ossidazione tra il controllo e gruppi sperimentali che creano ambiguità negli studi differenziali HOS. L'aggiunta della dosimetria radicale in tempo reale consente la regolazione dell'effetto ▪carico OH e quindi aumenta la confidenza e la riproducibilità durante un esperimento HRPF. L'uso della dosimetria radicale nell'FPOP è stato descritto altrove23,24,25, ed è ulteriormente discusso in dettaglio in una recente pubblicazione26. Qui descriviamo l'uso di un nuovo sistema di fotolisi flash e dosimetria in tempo reale per etichettare l'apo-mioglobina equina (aMb), confrontando i livelli di ossidazione peptidica in un esperimento FPOP con quello ottenuto quando si utilizza un laser ad eccimeri.

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Protocollo

1. Installazione del tubo capillare

  1. Utilizzando una pietra di scissione della silice, scindere il capillare di silice di diametro interno (ID) di 250 μm a 27 pollici. Controllare le estremità capillari per un taglio pulito e dritto.
  2. Creare due finestre di circa 15 mm di lunghezza bruciando via il rivestimento in poliimmide. Partendo dall'"estremità inferiore" si fa la prima finestra di fotolisi a 90 mm di distanza dall'"estremità inferiore" e la seconda finestra del dosimetro a 225 mm di distanza dall'"estremità inferiore".
    NOTA: Una volta bruciato il rivestimento, il capillare è molto fragile.
  3. Svitare il dado e il ferrule alla porta 5 e inserire l'"estremità inferiore" del capillare appena oltre l'estremità conica del ferrule(Figura 1A).
  4. Sul modulo di fotolisi, rimuovere il cappuccio della cella di fotolisi tirandolo direttamente fuori e quindi rimuovere la maschera metallica montata magneticamente che terrà il capillare in posizione.
    ATTENZIONE: All'interno del cappuccio della cella di fotolisi c'è uno specchio curvo, non permettere a nulla di toccare lo specchio.
  5. Sul modulo dosimetro aprire la cella del dosimetro spingendo sulla linguetta a sinistra e aprire la cella del dosimetro a destra. Rimuovere le clip montate magneticamente che tratteneranno il capillare in posizione.
  6. Posizionare il capillare nel canale scanalato nella base della cella di fotolisi. Centrare la finestra capillare con la finestra della cella di fotolisi. Tenendo il capillare in posizione con una mano, aggiungere la maschera magnetica per tenere il capillare in posizione. Riposizionare il cappuccio della fotolisi.
  7. Posizionare il capillare nel canale scanalato nella base della cella del dosimetro. Centrare la seconda finestra capillare sulla piccola apertura al centro della base cellulare del dosimetro. Tenendo il capillare in posizione con una mano, posizionare le due clip magnetiche in posizione per mantenere il capillare in posizione. Chiudere la cella del dosimetro fino a quando non fa clic su chiuso.
  8. Inserire il capillare attraverso il dado zigrinato in cima al sollevatore capillare del raccoglitore di prodotti(Figura 1B). Estendere il capillare appena sopra il fondo del flaconcino.
    NOTA: È importante che il capillare raggiunga il fondo del flaconcino per assicurarsi che il capillare sia immerso nella soluzione di tempra durante l'esecuzione di un esperimento.

2. Installazione di un ciclo di iniezione

  1. Utilizzare tubi in teflon con un diametro esterno di 1/16" e un diametro interno di 0,015" (381 μm). Seguire l'equazione 1 per calcolare la lunghezza dei tubi necessari per il volume desiderato utilizzando l'equazione 1.
    figure-protocol-1
    Dove L è la lunghezza del tubo in millimetri, V è il volume desiderato nei microlitri e d è il diametro interno del tubo in millimetri. Per un volume di iniezione di 25 μL e un diametro interno di 381 μm, la lunghezza del tubo deve essere di circa 219,3 mm.
    NOTA: Per volumi inferiori a 20 μL, utilizzare tubi PTFE con diametro interno di 0,01".
  2. Tagliare i tubi in teflon alla lunghezza necessaria utilizzando una fresa a tubo. Controllare le estremità del tubo per un taglio pulito e dritto.
  3. Inserire un'estremità del nuovo ciclo di iniezione attraverso uno dei dadi e posizionare un nuovo ferrule sull'estremità del tubo. Tenere il ferrule e il dado in posizione e inserire il tubo nella porta 3 della valvola di iniezione fino a quando non si escola nella valvola. Tenere saldamente il tubo e stringere il dito del dado stretto. Utilizzando una chiave inglese, stringere ulteriormente il dado 1/4 di giro. Rimuovere e ispezionare l'assieme.
    NOTA: Se il ferrule non è fissato in posizione, reinstallare e stringere ulteriormente 1/8. Ripetere con l'altra estremità del ciclo.
  4. Una volta che entrambe le estremità hanno un dado e un ferrule fisso, avvitare liberamente un'estremità alla porta 3 e l'altra estremità alla porta 6 (Figura 1C). Una volta in posizione stringere entrambi i lati a dito stretto, quindi 1/4 girare oltre il dito stretto con una chiave inglese.

3. Inizializzare il sistema di fotolisi

  1. Accendere i moduli di fotolisi nel seguente ordine: (1) Modulo fluidics (2) Modulo di fotolisi (3) Modulo dosimetrico (4) Raccoglitore prodotti, e infine (5) il computer di sistema e avviare il software di controllo
    NOTA: Lasciare che il modulo dosimetro almeno mezz'ora si il riscaldamento da un avvio a freddo.
  2. Immergere completamente i tubi dalla posizione "Valve" sulla pompa della siringa (Figura 1D) in 10 ml di tampone. Posizionare i tubi dalla posizione "Rifiuti"(figura 1D)e i tubi della porta 2 sulla porta della siringa (Figura 1C) in un contenitore vuoto per raccogliere i rifiuti.
    NOTA: Usa il buffer in cui la tua proteina verrà sospesa. Un buffer consigliato è 10 mM NaPO4.
  3. Sulla giostra Del Collettore di Prodotto, posizionare tubi a microcentrifugo da 1,5 ml nella posizione contrassegnata con H e 6.
  4. Se si utilizza un capillare ID 250 μm, impostare la portata di carico su 500 μL/min, la portata di elaborazione a 7,5 μL/min e la portata di scarto a 500 μL/min.
  5. Calcola il ritardo del flash, il tempo del prodotto e il tempo di perdita per utilizzare la modalità semiautomatica usando l'equazione 2.
    figure-protocol-2
    Dove t è il tempo in minuti, s è la distanza capillare in millimetri, d è il diametro interno del capillare in millimetri, e f è la portata in μL/min.
    1. Per il ritardo del flash, la distanza è dall'"estremità inferiore" del capillare alla prima finestra, che dovrebbe essere di circa 90 mm. Utilizzando un capillare ID 250 μm e una portata di elaborazione di 7,5 μL/min, il campione arriverà alla finestra di fotolisi in circa 35 secondi. Consentire due flash a 1 Hz prima dell'arrivo dei campioni, quindi impostare il ritardo del flash su 33 secondi.
    2. Per il tempo del prodotto, inserire la quantità di tempo che la soluzione iniettata richiederà per fluire dalla valvola di iniezione alla fine del capillare. Per un capillare ID lungo 27" da 250 μm, impostare il tempo di prodotto su 4,5 minuti.
    3. Per il tempo di perdita, immettere il tempo necessario per raccogliere il volume totale della soluzione iniettata. In questo momento, il collettore di prodotti si sposterà dalla posizione del prodotto al flaconcino di scarto. Per un volume di iniezione di 25 μL e una portata di 7,5 μL/min, impostare il tempo di perdita su 7,8 minuti.
  6. Risciacquare il circuito di iniezione cinque volte iniettando 25 μL di acqua di grado HPLC nella porta di iniezione con la valvola di iniezione impostata sulla posizione di carico.
  7. Ruotare manualmente la valvola di iniezione fino a "posizione di iniezione" per scaricare il resto del sistema. Selezionare Processo (Out) sul software di controllo per iniziare a scorrere l'acqua. Durante il flusso, sollevare il sollevatore capillare del collettore di prodotto selezionando Su sotto il raccoglitore di prodotti in modo da poter vedere la fine del capillare. Scorrere l'acqua attraverso il capillare fino a regolare una goccia.
    NOTA: Se una goccia non si forma, controllare la presenza di perdite nella valvola dell'iniettore. Se c'è una perdita, allentare il dado, risediare il capillare e il retighten.

4. Determinare l'▪o rendimento OH per testare gli effetti di scavenging radicale dal buffer.

  1. Nel software di controllo avviare il flusso selezionando Processo (Out). Nella scheda impostazioni impostare la tensione flash su 0 V. Nella scheda Controllo manuale della sezione dati del dosimetro selezionare Avvia dati + AutoZero.
  2. Selezionare la posizione per il flaconcino del prodotto (H) e il flaconcino di scarto (6).
  3. Selezionare Pronto, abbassare manualmente la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 μL di 1 mM di Adenine con 100 mM H2O2 nella porta di iniezione. Una volta iniettato, ruotare manualmente la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione.
    NOTA: Questo attiva automaticamente il sistema per iniziare il flusso, accendere la sorgente plasmatica e acquisire i dati di dosimetria.
  4. Aumentare la tensione navigando verso la scheda impostazioni e modificando la tensione del flash. Ripetere i passaggi 4.2 e 4.3 utilizzando 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Eseguire la lettura dell'assorbanza di adenina ad ogni tensione in triplicati.
  5. Selezionare la scheda calcoli per determinare l'assorbanza media di ogni campione. Fare innanzitutto clic su Seleziona, quindi selezionare manualmente l'inizio e la fine dell'assorbanza del picco. Nello spazio disponibile scrivere in una descrizione dell'esempio. Ripetere l'evento per tutti i dati acquisiti.
    NOTA: Le bolle possono formarsi causando un picco nella lettura del dosimetro. Quando si selezionano i dati per determinare l'assorbanza media, omettere le aree con bolle.
  6. Copiare e incollare i dati in Excel per calcolare la variazione media dell'assorbanza dell'adenina per ogni tensione, determinando così l'effettiva ▪di OH.
  7. Ripetere i passaggi 4.1-4.6 se vengono utilizzate più condizioni del campione (buffer/additivi diversi) per normalizzare l'efficace ▪OH per ogni condizione.

5. Modifica delle proteine per rilevare i cambiamenti nella struttura di ordine superiore.

  1. Mescolare 4 mM di adenina con 20 μM di proteine in un rapporto uno a uno per creare una soluzione contenente 2 mM di adenina e 10 μM di proteine.
  2. Fare la soluzione di tempra utilizzando 0,3 mg/mL di catalasi per abbattere il perossido di idrogeno in eccesso e l'ammide metoionina da 35 mM per spegnere eventuali radicali rimanenti. Aliquota 25 μL di soluzione di tempra in un microtubo da 200 μL in modo che un volume uguale di tempra e il prodotto etichettato sia miscelato.
  3. Diluire H2Oda 2 a 200 mM e tenere sul ghiaccio.
  4. Nel software di controllo nella scheda impostazioni, avviare la tensione flash a 0 V per determinare eventuali ossidazioni di fondo.
  5. Nella scheda controllo manuale selezionare Avvia dati + AutoZero, seguito da Processo (Out),quindi Pronto, e infine abbassare la valvola di iniezione nella posizione di carico.
  6. Posizionare una soluzione di tempra nella posizione 1 sul carosello di raccolta del prodotto. Nel software di controllo del sistema cambiare il flaconcino del prodotto su 1.
  7. Immediatamente prima dell'iniezione, mescolare 12,5 μL della miscela di adenina e proteine con 12,5 μL di H2O2 per ottenere una concentrazione finale di 1 mM di Adenina, 5 μM di proteina e 100 mM H2O2. Pipettare delicatamente su e giù per mescolare, girare rapidamente verso il basso e iniettare 25 μL utilizzando la porta di iniezione entro 10 secondi dalla miscelazione.
  8. Passare alla valvola di iniezione nella posizione di iniezione e attendere durante l'elaborazione del campione.
  9. Ripetere l'acquisizione con 500 V, 750 V, 1000 V e 1250 V. Eseguire ogni misurazione della tensione in triplice copia.
  10. Calcolare l'assorbanza media descritta nel passaggio 4.5. Copiare e incollare tutti i dati in Excel.

6. Arrestare il sistema

  1. Dopo aver raccolto tutti i campioni, sciacquare la porta della siringa e il ciclo del campione impostando la valvola di iniezione nella posizione di carico e iniettare 25 μL di acqua HPLC cinque volte.
  2. Ruotare la valvola di iniezione fino alla posizione di iniezione per scaricare il resto del sistema con acqua HPLC.
  3. Interrompere il flusso, chiudere il software di controllo del sistema e spegnere i moduli a partire dal raccoglitore di prodotti, modulo dosimetro, modulo di fotolisi, quindi infine il modulo fluidico.

7. Preparazione del campione e cromatografia liquida-spettrometria di massa

  1. Denaturare la proteina incubando campioni a 80 °C per 20 min in presenza di Tris da 50 mM e 1 mM CaCl2. Raffreddare i campioni a temperatura ambiente e aggiungere 1:20 tripina alle proteine. Digerire la proteina durante la notte a 37 °C con miscelazione del campione. La mattina successiva, terminare la digestione della tripina riscaldando i campioni a 95 °C per 10 minuti.
  2. Rilevare peptidi utilizzando un sistema LC-MS/MS ad alta risoluzione collegato a un sistema UPLC.
  3. Caricare prima il campione sulla colonna trappola (ID X 5 mm 5 mm 100 Å pore, dimensione delle particelle di 5 μm) e lavare a 5,0 μL/mL per 3 minuti con acqua contenente il 2% di solvente B (acetonitrile e 0,1% di acido formico).
  4. Separare i peptidi su una nanocolonna C18 (0,75 mm x 150 mm, dimensione delle particelle di 2 μm, dimensione del poro 100 Å) ad una portata di 300 nL/min con un gradiente tra il solvente A (acqua contenente lo 0,1% di acido formico) e il solvente B. Il gradiente per l'eluizione peptidica consiste in un aumento lineare dal 2 al 35% B su 22 min, rampato al 95% B su 5 min e tenuto per 3 minuti per lavare la colonna, per poi tornare al 2% B su 3 min e tenuto per 9 minuti per ri-equilibrare la colonna.
  5. Acquisire i dati in modalità ioni positivi. Impostare la tensione di spruzzatura su 2400 V e la temperatura del tubo di trasferimento ionino a 300 °C.
  6. Acquisire le scansioni MS complete da 250-2000 m/z seguite da otto successive scansioni MS/MS dipendenti dai dati sui primi otto ioni peptidici più abbondanti. Usa la dissociazione indotta da collisione al 35% di energia normalizzata per frammentare i peptidi.
  7. Identificare tutti i peptidi non modificati rilevati dall'analisi MS/MS utilizzando un software di analisi proteica disponibile rispetto al file FASTA necessario contenente la sequenza proteica e l'enzima proteolitico pertinente.
  8. Ricercare e quantificare peptidi modificati utilizzando un software di elaborazione dati HRPF. L'estensione di ossidazione per ogni peptide identificato è calcolata dividendo l'area di picco cromatografica sommata di un peptide modificato per l'area di picco cromatografica totale di quel peptide modificata e non modificata usando l'equazione 3.
    P = [I(singolarmente ossidato) X 1 + I (doppiamente ossidato) X 2 + I(tripli ossidato) X 3 + .../[Iunoxidizzato + I(singolarmente ossidato) + I(doppiamente ossidato) + I(tripli ossidato)...]
    dove P denota il numero medio di eventi di ossidazione per molecola peptidica, e I rappresenta l'area di picco del peptide non idrossizzato(Iunoxidizzato)e il peptide con n eventi di ossidazione.

8. Per uno studio differenziale, ripetere i passaggi 5-7 sulla seconda condizione.

NOTA: Per confermare la riproducibilità, si raccomandano due repliche biologiche oltre a triplicati tecnici per ogni condizione.

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Risultati

La sorgente plasmatica ad alta pressione accoppiata con la dosimetria in tempo reale consente un migliore controllo della resa di ▪OH per osservare i cambiamenti nella struttura proteica di ordine superiore in modo più accurato. L'aggiunta di adenina consente un dosimetro radicale efficace in tempo reale. Al momento dell'ossidazione, l'adenina perde assorbanza UV a 265 nm (Figura 2A). Il cambiamento nell'assorbanza dell'adenina è direttamente correlato alla concentrazione di radic...

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Discussione

Ci sono diversi passaggi critici per garantire una corretta etichettatura delle proteine durante qualsiasi esperimento HRPF. In primo luogo, vengono selezionate una portata appropriata e una velocità di infiammamento della sorgente per assicurarsi che ogni bolo del campione sia irradiato una volta. Ciò garantisce che la proteina sia esposta a un singolo bolo di nuovo ▪OH. Una volta che una proteina viene ossidata, la struttura proteica di ordine superiore può essere alterata. Per essere sicuri che la struttura...

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Dichiarazioni

E.E.C., J.S.S. e S.R.W. rivelano un significativo interesse finanziario in GenNext Technologies, Inc., una società in fase iniziale che cerca di commercializzare tecnologie per l'analisi della struttura proteica di ordine superiore. I dati rappresentativi forniti sono stati esaminati da S.K.M., che non ha alcun conflitto di interessi finanziari.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of General Medical Sciences (R43GM125420 e R44GM125420).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette da centrifuga coniche da 15 mlFisher Scientific14-959-53Aqualsiasi marca è sufficiente
50 µ L SGE Siringhe a tenuta di gasFisher ScientificSG-00723
Acclaim PepMap 100 C18 nanocolonna (0,75 mm X 150 mm, 2 &; m)Thermo Scientific
Acetonitrile con 0,1% di acido formico (v/v), grado LC/MSFisher ScientificLS120-500
ApomioglobinaSigma-Aldrich
CatalasiSigma-AldrichC9322
CentrifugaEppendorf022625501
Tergicristalli per compiti delicatiFisher Scientific06-666A
Perossido di idrogenoFisher ScientificH325-100qualsiasi 30% di perossido di idrogeno è sufficiente
Metionina ammideChem-Impex03109
MicrocentrifugaThermo Scientific75002436
Orbitrap Fusion Spettrometro di massa tribridoLumos Thermo ScientificSpettrometro di massa tribrido Orbitrap Fusion Lumosaltri strumenti ad alta risoluzione (ad es. Q exactive, Orbitrap o Orbitrap Fusion) possono essere utilizzati
Pierce Trypsin Proteasi, MS GradeThermo Scientific90058
Polymicro Cleaving Stone, 1" x 1/32"Molex1068680064qualsiasi tagliatubi capillare è sufficiente
UPLCThermo Scientific
Water con 0,1% di acido formico (v/v), LC/MS GradeFisher ScientificLS118-500
Water, LC/MS GradeFisher ScientificW6-4

Riferimenti

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