Presentiamo un modello in vitro per valutare la capacità neuroregenerativa olfattiva di glia (OEG), dopo la lesione neurale. Si basa su una cocultura di neuroni ganglionali della retina adulta assotomizzati (RGN) su monostrati OEG e sul successivo studio della rigenerazione assonale, analizzando marcatori assonali e somatodendritici RGN.
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Articolo metodologico
Cocultura di neuroni ganglionali retini di ratto axotomizzati con glia ensheathing olfattiva, come modello in vitro di rigenerazione assionale adulta
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule olfattive di glia ensheathing (OEG) sono localizzate dalla mucosa olfattiva a e nello strato nervoso olfattivo (ONL) del bulbo olfattivo. Per tutta la vita adulta, sono fondamentali per la crescita assonale dei neuroni olfattivi appena generati, dalla lamina propria all'ONL. A causa delle loro proprietà pro-rigenerative, queste cellule sono state utilizzate per favorire la rigenerazione assonale nel midollo spinale o nei modelli di lesione del nervo ottico.
Presentiamo un modello in vitro per testare e misurare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neurale. In questo modello, l'OEG umano reversibilmente immortalato (ihOEG) è coltivato come monostrato, le retine vengono estratte da ratti adulti e i neuroni ganglionari retinali (RGN) sono coculati sul monostrato OEG. Dopo 96 ore, i marcatori assonali e somatodendritici nelle RGN vengono analizzati per immunofluorescenza e il numero di RGN con assone e la lunghezza assionale media / neurone vengono quantificati.
Questo protocollo ha il vantaggio rispetto ad altri saggi in vitro che si basano su neuroni embrionali o postnatali, che valuta le proprietà neuroregenerative OEG nel tessuto adulto. Inoltre, non è solo utile per valutare il potenziale neuroregenerativo di ihOEG, ma può essere esteso a diverse fonti di OEG o altre cellule gliali.
Introduzione
I neuroni del sistema nervoso centrale adulto (SNC) hanno una capacità rigenerativa limitata dopo lesioni o malattie. Una strategia comune per promuovere la rigenerazione del SNC è il trapianto, nel sito delle lesioni, di tipi cellulari che inducono la crescita assonale come cellule staminali, cellule di Schwann, astrociti o cellule olfattive glia (OEG)1,2,3,4,5.
OEG deriva dalla cresta neurale6 e si trova nella mucosa olfattiva e nel bulbo olfatt....
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Protocollo
NOTA: La sperimentazione animale è stata approvata dai comitati nazionali e istituzionali di bioetica.
1. cultura ihOEG (Ts12 e Ts14)
NOTA: Questa procedura viene eseguita in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza per la coltura tissutale.
- Preparare un supporto di coltura OEG ME10 da 50 mL come previsto nella tabella 1.
- Preparare 5 ml di DMEM/F12-FBS, come previsto nella tabella 1, in un tubo conico da 15 ml.
- Riscaldare entrambi i supporti a 37 °C in un bagno d'acqua pulita, per 15 minuti.
- Scongelare le fiale delle cellule Ts12 e ....
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Risultati
In questo protocollo, presentiamo un modello in vitro per testare la capacità neuroregenerativa OEG dopo la lesione neuronale. Come mostrato nella Figura 1, la sorgente OEG è una linea cellulare clonale OEG immortalata reversibile -Ts14 e Ts12-, che deriva da colture primarie, preparate da bulbi olfattivi ottenuti in autopsie15,17,18. Il tessuto retinale viene estratto da ratti adulti, digerito e la.......
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Discussione
Il trapianto OEG nei siti di lesione del SNC è considerato una terapia promettente per la lesione del SNC a causa delle sue proprietà pro-neuroregenerative costitutive7,8,9. Tuttavia, a seconda della sorgente tissutale — mucosa olfattiva (OM-OEG) rispetto al bulbo olfattivo (OB-OEG) — o dell'età del donatore, esistono notevoli variazioni in talecapacità 26,31,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal progetto SAF2017-82736-C2-1-R dal Ministerio de Ciencia e Innovación al MTM-F e dalla Fundación Universidad Francisco de Vitoria a JS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| anticorpo 514 | Riferimento 34 | Antisiero policlonale di coniglio, che riconosce MAP2A e B. | |
| anticorpo SMI-31 | BioLegend | 801601 | Anticorpo monoclonale contro le proteine MAP1B e NF-H |
| anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpo | ThermoFisher | A-21202 | |
| anti-coniglio Alexa Fluor 594 anticorpo | ThermoFisher | A-21207 | |
| B-27 Integratore | Gibco | 17504044 | |
| D,L-2-ammino-5-acido fosfonovalerico | Sigma | 283967 | inibitore del recettore NMDA |
| DAPI Sigma | D9542 | Colorazione fluorescente dei nuclei | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320033 | Terreno di coltura cellulare |
| FBS | Gibco | 11573397 | Siero fetale bovino |
| FBS-Hyclone | Fisher Scientific | 16291082 | Siero fetale bovino |
| Fluoromount | Southern Biotech | 0100-01 | Supporto di montaggio |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH-USA) | Software di immagine | |
| L-Glutammina | Lonza | BE17-605F | |
| Medium neurobasale | Gibco | 21103049 | Terreno di coltura di cellule neuronali |
| Sistema di dissociazione della papaina | Worthington Biochemical Corporation | LK003150 | Per l'uso nell'isolamento delle cellule neurali |
| PBS | Home made | ||
| PBS-EDTA | Lonza | H3BE02-017F | |
| Penicillina/Streptomicina/Amfotericina B | Lonza | 17-745E | Estratto ipofisario batteriostatico e battericida |
| Gibco | 13028014 | Estratto ipofisario bovino | |
| Poli-L-lisina (PLL) | Sigma | A-003-M |
Riferimenti
- Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: Its significant therapeutic potential and prospectus. Reviews in the Neurosciences. 26 (2), 121-128 (2015).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W.
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Ristampe e permessi
