Articolo metodologico

Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana

DOI:

10.3791/61871

⸱

22 settembre 2020

 , 
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo efficiente privo di cellule per la produzione di proteoliosomi di alta qualità mediante metodo di dialisi a doppio strato utilizzando un sistema privo di cellule di grano e liposomi. Questo metodo fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening dei bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le proteine di membrana svolgono ruoli essenziali in una varietà di processi cellulari e svolgono funzioni vitali. Le proteine di membrana sono importanti dal punto di vista medico nella scoperta di farmaci perché sono gli obiettivi di oltre la metà di tutti i farmaci. Un ostacolo alla conduzione di studi biochimici, biofisici e strutturali sulle proteine di membrana e sullo sviluppo di anticorpi è stata la difficoltà di produrre grandi quantità di proteine di membrana di alta qualità con corretta conformazione e attività. Qui descriviamo un "metodo di dialisi a doppio strato" che utilizza un sistema privo di cellule di germe di grano, liposomi e coppette di dialisi per sintetizzare efficacemente le proteine di membrana e preparare proteoliposomi purificati in breve tempo con un alto tasso di successo. Le proteine di membrana possono essere prodotte tanto quanto in diversi milligrammi, come GPCR, canali ionici, trasportatori e tetraspanine. Questo metodo privo di cellule contribuisce a ridurre i tempi, i costi e gli sforzi per la preparazione di proteoliposomi di alta qualità e fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening di bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le proteine di membrana sono uno dei bersagli farmacologici più importanti nella diagnosi e nella terapia. Infatti, metà dei piccoli farmaci composti bersaglio sono proteine di membrana, come i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e i canali ionici1. Nel corso degli anni, i ricercatori hanno lavorato su studi biochimici, biofisici e strutturali delle proteine di membrana per chiarire la loro struttura e funzione 2,3. Anche lo sviluppo di anticorpi monoclonali contro le proteine di membrana viene eseguito attivamente al fine di accelerare gli studi funzionali e strutturali e sviluppare applicazioni terapeutiche e diagnostiche 4,5,6,7,8,9. Tutti questi studi richiedono una grande quantità di proteine di membrana di alta qualità10. Ad esempio, sono necessari diversi milligrammi di proteine di membrana purificate con conformazione naturale per lo sviluppo di anticorpi. Una quantità molto maggiore di proteine di membrana altamente purificate è necessaria per la cristallografia a raggi X. Tuttavia, la produzione di massa di proteine di membrana rimane un collo di bottiglia nella ricerca sulle proteine di membrana11. Le proteine di membrana hanno strutture complicate con una o più eliche transmembrana e svolgono un ruolo importante nell'omeostasi cellulare. La sovraespressione eterologa delle proteine di membrana porta a molteplici ostacoli come l'aggregazione di proteine di membrana che si accumulano ad alte concentrazioni locali o il disturbo delle vie del segnale cellulare. Anche se l'espressione ha successo, anche le fasi successive della preparazione del campione incontrano difficoltà. Ad esempio, la preparazione del proteoliposoma, richiede competenze di alto livello ed esperienze professionali nella solubilizzazione, purificazione e stabilizzazione delle proteine di membrana, e costa molto sforzo e tempo anche12,13.

D'altra parte, alcune tecnologie avanzate sono emerse negli ultimi decenni per produrre proteine senza l'uso di cellule viventi 14,15,16,17,18. La tecnologia di sintesi proteica priva di cellule ricostituisce la reazione di traduzione in una provetta. Poiché non ci sono limitazioni che il sistema di espressione cellulare ha, i sistemi privi di cellule hanno il potenziale per sintetizzare una varietà di proteine che sono difficili da esprimere o mostrano tossicità nelle cellule. L'estratto cellulare purificato o il macchinario traslazionale ricostituito viene mescolato con mRNA modello, amminoacidi e fonti di energia e le proteine ricombinanti vengono sintetizzate in breve tempo. Per quanto riguarda la sintesi proteica di membrana, alcuni tipi di scaffold composti da lipidi o anfifili, come liposomi, bicelle, nanodischi o copolimeri vengono aggiunti alla reazione cell-free 19,20,21,22,23,24. Le proteine di membrana sintetizzate interagiscono con gli scaffold e possono essere stabilizzate in acqua. Le proteine di membrana sintetizzate prive di cellule sono ampiamente utilizzate negli studi funzionali e nella produzione di anticorpi 25,26,27,28,29,30,31.

In questo protocollo, descriviamo un metodo efficiente di produzione di proteoliposomi senza cellule utilizzando il sistema privo di cellule di grano e liposomi. Il sistema di sintesi proteica senza cellule di grano è un potente sistema di traduzione in vitro che utilizza l'estratto del germe di grano 15,32,33. Il germe di grano contiene una grande quantità di macchinari traslazionali e pochi inibitori della traduzione. Il meccanismo traslazionale nel grano, un membro degli eucarioti, è adatto per tradurre le proteine eucariotiche e la sua efficienza di traduzione è difficilmente influenzata dall'uso del codone del modello mRNA. Utilizzando il sistema privo di cellule di grano, abbiamo sintetizzato una varietà di proteine tra cui protein chinasi 34,35, ubiquitina ligasi36, fattori di trascrizione37 e proteine di membrana con alti tassi di successo. Per la produzione di proteine di membrana, aggiungiamo liposomi di vescicole lipidiche nella miscela di traduzione come scaffold19,38. I domini idrofobici delle proteine di membrana interagiscono con il doppio strato lipidico e sono spontaneamente integrati con il liposoma. La centrifugazione a gradiente di densità viene utilizzata per separare rigorosamente il proteoliosoma dalle proteine endogene del grano, anche se una centrifugazione comune della miscela della reazione di traduzione è sufficiente per una semplice purificazione del proteoliposomia20. Molti tipi di proteine integrali di membrana sono stati sintetizzati utilizzando il sistema privo di cellule di grano e applicati per varie ricerche e sviluppi 25,38,39,40,41,42,43,44. Inoltre, abbiamo sviluppato il "metodo di dialisi a doppio strato" per la produzione su larga scala45,46. In questo metodo, il dispositivo di dialisi a coppa viene immerso nel tampone di alimentazione del substrato e nella tazza si formano due strati di miscela di reazione di traslazione e tampone di alimentazione del substrato, come mostrato nella Figura 1. La fornitura continua di substrati e la rimozione del sottoprodotto possono essere condotte in modo efficiente sia nella parte superiore che in quella inferiore della miscela di reazione per lungo tempo, il che porta a un'eccellente efficacia di traduzione (Figura 2A e Figura 2B)45.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione del plasmide di espressione pEU

NOTA: il plasmide di espressione pEU deve includere il codone iniziale, il frame di lettura aperto della proteina di membrana bersaglio e il codone di arresto nel frammento (vedere Figura 1). Aggiungere sequenze di tag di rilevamento/purificazione nella posizione appropriata quando necessario. Per la subclonazione è applicabile la digestione enzimatica di restrizione o la clonazione senza soluzione di continuità. Qui descriviamo un protocollo che utilizza un metodo di clonazione senza soluzione di continuità.

  1. Preparare inserire un frammento di DNA.
    1. Amplificare il gene di interesse mediante PCR utilizzando il modello di cDNA, primer 1 e primer 2. Il primer 1 e il primer 2 contengono rispettivamente sovrapposizioni di 15 bp per una clonazione senza soluzione di continuità (vedere la tabella dei materiali).
      NOTA: Non includere sequenze da elaborare e rimuovere da proteine mature nelle cellule (ad esempio, sequenza di segnali). L'elaborazione delle proteine sintetizzate non viene eseguita nel sistema privo di cellule di grano. Non aggiungere la sequenza Kozak. Il vettore pEU-E01-MCS ha un potenziatore di traduzione E01.
    2. Aggiungere 1/25 di volume dell'enzima di restrizione DpnI al prodotto PCR per rimuovere il DNA plasmidico modello. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
    3. Utilizzare un kit di purificazione PCR per purificare il prodotto PCR e regolare la concentrazione a 20-50 ng / μL.
  2. Linearizzare il vettore pEU-E01-MCS.
    1. Condurre la PCR inversa utilizzando pEU-E01-MCS, primer 3 e primer 4.
    2. Aggiungere 1/25 di volume dell'enzima di restrizione DpnI al prodotto PCR inverso. Incubare per 30 minuti a 37 °C.
    3. Utilizzare un kit di purificazione PCR per purificare il prodotto PCR secondo la raccomandazione del produttore. Regolare la concentrazione a 20–50 ng/μL.
  3. Mescolare 2 μL di frammento di DNA inserito, 2 μL di vettore linearizzato e 4 μL di miscela enzimatica di clonazione 2x senza soluzione di continuità.
  4. Trasforma Escherichia coli ceppo JM109 con il prodotto di clonazione senza soluzione di continuità. Utilizzando uno spargitore, distribuire la sospensione batterica su una piastra di agar di ampicillina LB.
    NOTA: il vettore pEU ha un marcatore di resistenza all'ampicillina.
  5. Confermare la sequenza del plasmide di espressione costruita utilizzando primer 5 e primer 6 dal lato 5' e 3' di MCS nel plasmide pEU, rispettivamente.
  6. Amplificare e purificare i plasmidi di espressione.
    1. Coltura del ceppo di E. coli trasformato plasmidico JM109 in 150 mL di mezzo di ampicillina LB a 37 °C e agitazione di 125 colpi al minuto durante la notte.
    2. Estrarre e purificare i plasmidi utilizzando il kit midi di preparazione del plasmide disponibile in commercio. Sciogliere i plasmidi in 500 μL di tampone TE.
      ATTENZIONE: Non utilizzare un mini kit di preparazione per l'estrazione del plasmide. Non fornisce sufficiente qualità e quantità di plasmide.
    3. Aggiungere 500 μL di fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1). Mescolare energicamente per 5 minuti e centrifugare per 5 minuti a 17.800 x g e temperatura ambiente. Trasferire la soluzione plasmidica superiore in un nuovo tubo.
      ATTENZIONE: Indossare guanti monouso per proteggere la pelle da fenolo e cloroformio.
      NOTA: Al fine di rimuovere la contaminazione della RNasi dal kit di estrazione del plasmide, purificare i plasmidi utilizzando la purificazione fenolo-cloroformio.
    4. Aggiungere 500 μL di cloroformio per rimuovere completamente il fenolo. Mescolare energicamente per 5 minuti e centrifugare per 5 minuti a 17.800 x g e temperatura ambiente. Trasferire la soluzione plasmidica superiore in un nuovo tubo.
    5. Aggiungere 2,5 volume di etanolo e 1/8 di volume di acetato di ammonio 7,5 M e conservare a -30 °C per 1 ora.
    6. Centrifugare a 17.800 x g a 4 °C per 10 min. Lavare il pellet con 500 μL di etanolo al 70%. Rimuovere accuratamente il surnatante e lasciare asciugare il pellet per 5 minuti.
    7. Sciogliere completamente i plasmidi di espressione in 100 μL di acqua ultrapura. Misurare la concentrazione di plasmidi con assorbanza a 260 nm. Regolare la concentrazione a 1 mg/ml.

2. Trascrizione in vitro

ATTENZIONE: Utilizzare tubi e punte di plastica privi di DNasi e nucleasi nelle fasi di trascrizione e traduzione. Evitare l'autoclave di articoli di plastica per prevenire la contaminazione.

  1. Raccogliere acqua ultrapura in un nuovo tubo di plastica.
    ATTENZIONE: Non utilizzare acqua trattata con DEPC perché il DEPC residuo inibisce fortemente la reazione. Utilizzare acqua ultrapura appena purificata per la trascrizione e la traduzione.
  2. Preparare la miscela di reazione di trascrizione miscelando 115,2 μL di acqua ultrapura, 40 μL di Tampone Trascrizionale LM, 20 μL di miscela NTP, 2,4 μL di 80 U/μL di inibitore della RNasi, 2,4 μL di 80 U/μL SP6 polimerasi e 20 μL di plasmidi di espressione pEU da 1 mg/ml. Mescolare delicatamente i reagenti capovolgendo. Esegui un giro veloce.
  3. Incubare la reazione di trascrizione a 37 °C per 6 ore.
  4. Mescolare delicatamente la reazione capovolgendo e ruotare rapidamente verso il basso. Utilizzarlo immediatamente per la traduzione, altrimenti congelare e conservare a -80 °C.
  5. Confermare il prodotto di trascrizione mediante elettroforesi.
    1. Mescolare 100 ml di 1x tampone TAE e 1 g di agarosio. Riscaldare la sospensione in un forno a microonde per preparare il gel TAE di agarosio all'1%.
    2. Prelevare 1 μL di reazione di trascrizione e mescolare con 3 μL di acqua e 4 μL di colorante di carico 2x.
      NOTA: La denaturazione dell'RNA non è richiesta.
    3. Caricare 4 μL della miscela e 2 μL del marcatore della scala del DNA sul gel TAE dell'agarosio.
    4. Elettroforesi a 100 V per 20 min.
    5. Colorare il gel in bromuro di etidio per 30 min. Controllare il modello di banda della scala di mRNA utilizzando il transilluminatore UV e l'imager del gel.
      NOTA: Quando si osserva una banda spalmata inferiore a 500 bp, si sospetta una degradazione dell'mRNA.

3. Preparazione dei materiali per la traduzione

  1. Preparare il buffer di traduzione.
    1. Mescolare 27 ml di acqua ultrapura appena preparata e 0,75 ml di ciascuna soluzione madre 40x per S1, S2, S3 e S4, rispettivamente in un tubo da 50 ml.
      NOTA: modulare la quantità di materiali in base alla quantità finale richiesta di 1x buffer di traduzione.
      ATTENZIONE: non conservare o ricongelare il buffer di conversione 1x in eccesso dopo l'uso.
  2. Preparare la soluzione madre di creatinchinasi. Sciogliere la creatinchinasi liofilizzata in acqua ultrapura fino a una concentrazione finale di 20 mg/ml. Erogare la soluzione in piccole quantità (da 10 a 50 μL ciascuna) in provette PCR a 8 strisce da 0,2 ml. Congelare i tubi in azoto liquido e conservare a -80 °C.
    ATTENZIONE: Non ricongelare la soluzione di creatinchinasi dopo lo scongelamento.
  3. Lavare le coppette di dialisi (dimensioni 0,1 ml) per rimuovere il glicerolo dalla membrana di dialisi.
    NOTA: Ci sono diverse coppe di dialisi di dimensioni diverse. Tazze di piccole dimensioni (0,1 ml) sono utilizzate rispettivamente per test su piccola scala (sezione 5.4) e tazze di grandi dimensioni (2 ml) per la produzione su larga scala (sezione 5.5). La fase di lavaggio della membrana di dialisi di coppette di grandi dimensioni è evitabile.
    1. Mettere 1 mL di acqua ultrapura in un nuovo tubo da 1,5 mL. Inserire una coppa di dialisi di piccole dimensioni (0,1 ml) nel tubo. Aggiungere 0,5 ml di acqua ultrapura nella tazza.
    2. Incubare per più di 30 minuti a temperatura ambiente.

4. Preparazione dei liposomi

NOTA: Qui descriviamo due protocolli per la preparazione dei liposomi. Uno utilizza liposomi liofilizzati pronti all'uso (sezione 4.1), mentre l'altro produce liposomi idratando un sottile film lipidico (paragrafo 4.2).

  1. Preparare liposomi usando liposomi liofilizzati.
    NOTA: Un modo più semplice per produrre proteoliposomi è quello di utilizzare liposoma Asolectin disponibile in commercio. L'asolectina è un tipo di lipide naturale estratto dalla soia.
    1. Aprire il flaconcino contenente 10 mg di liposomi di asolectina liofilizzati (vedere la tabella dei materiali) e aggiungere 200 μL di tampone di traduzione (paragrafo 3.1) sul fondo del flaconcino. Sigillare il flaconcino e incubare per 10 min.
    2. Mescolare energicamente mettendo il flaconcino sul miscelatore a vortice per 1 minuto.
    3. Inserire il flaconcino in un tubo da 50 ml. Centrifugare il tubo centrifugando a 500 x g per 1 minuto.
    4. Utilizzando una pipetta, trasferire la sospensione liposomica di asolectina (50 mg lipidi/ml) in una nuova provetta da 1,5 ml. Utilizzare immediatamente il liposoma per la traduzione, altrimenti congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.
  2. Preparare i liposomi idratando un sottile film lipidico.
    1. Se un lipide viene venduto in polvere, sciogliere in cloroformio o solvente organico appropriato a 10-100 mg / mL concentrazione.
      NOTA: Un sottile film lipidico può essere preparato utilizzando lipidi anfifilici purificati e/o sintetizzati. Il metodo di purificazione dell'asolectina è precedentemente descritto38. I lipidi funzionalmente modificati, come i lipidi biotinilati, i lipidi fluorescenti e i lipidi adiuvanti, possono essere aggiunti ai lipidi basali per produrre liposomi funzionali.
    2. Trasferire la soluzione lipidica contenente 50 mg di lipidi in un matraccio di evaporazione.
    3. Utilizzando un evaporatore rotante, far evaporare il solvente e distribuire uniformemente il lipide sulla parete del fondo del pallone per formare un sottile film di lipidi.
    4. Mettere il pallone in un essiccatore sottovuoto e lasciarlo sotto pressione negativa per una notte per rimuovere completamente il solvente.
    5. Aggiungere 1 mL di tampone di traslazione al matraccio di evaporazione. Ruotare il matraccio per distribuire il tampone sul sottile film lipidico. Incubare per 5 minuti per idratare il film.
    6. Sonicare il pallone con un omogeneizzatore ad ultrasuoni o un pulitore ad ultrasuoni. Cambiare di tanto in tanto l'angolazione del matraccio per consentire alla soluzione di toccare completamente la pellicola. Assicurarsi che il sottile film lipidico venga staccato dal fondo ed emulsionato in modo completo e omogeneo.
      NOTA: La micrografia elettronica dei lipidi biotinilati contenenti liposomi è mostrata nella Figura 1.
    7. Trasferire la sospensione liposomica (50 mg lipidi/ml) in un nuovo tubo da 1,5 ml. Se non deve essere utilizzato immediatamente, congelare i liposomi in azoto liquido e conservare a -80 °C.

5. Traduzione in vitro

  1. Scongelare rapidamente l'estratto di germe di grano facendo galleggiare i tubi sull'acqua a temperatura ambiente per alcuni minuti. Dopo lo scongelamento, mescolare immediatamente delicatamente capovolgendo i tubi, girare verso il basso e raffreddare sul ghiaccio fino all'uso.
    NOTA: Congelare l'estratto di germe di grano in azoto liquido dopo l'uso e conservare a -80 °C. Resiste a diversi cicli di congelamento/scongelamento.
  2. Scongelare 20 mg/mL di soluzione madre di creatinchinasi. Miscelare 5 μL di soluzione madre e 45 μL di tampone di traduzione per preparare 2 mg/mL di soluzione di lavoro di creatinchinasi.
    ATTENZIONE: Il ricongelamento della creatinchinasi non è raccomandato.
  3. Scongelare liposomi o mRNA quando necessario.
  4. Condurre una traduzione proteica su piccola scala.
    1. Rimuovere l'acqua sia dal tubo che dalla coppa di dialisi (0,1 ml), come preparato al punto 3.3.2.
    2. Iniettare 1 mL e 300 μL di tampone di traslazione rispettivamente nel tubo e nella coppa di dialisi.
      ATTENZIONE: Nel caso in cui il fondo della coppa di dialisi non raggiunga la superficie del tampone di traslazione nel tubo da 1,5 ml, iniettare altri 50-100 μL di tampone nel tubo.
    3. Preparare la miscela della reazione di traduzione miscelando 15,6 μL di tampone di traduzione, 2,4 μL di 2 mg/ml di creatina chinasi, 12 μL di 50 mg/ml di liposomi, 15 μL di estratto di germe di grano e 15 μL di mRNA. Mescolare delicatamente capovolgendo i tubi e ruotare verso il basso.
    4. Aspirare 60 μL della miscela della reazione di traslazione utilizzando una pipetta da 200 μL.
    5. Inserire la punta della pipetta nella superficie inferiore del tampone di traslazione nella coppa di dialisi. Pipettare la miscela di reazione lentamente e delicatamente. Coprire la coppa di dialisi con un coperchio per evitare l'evaporazione.
      NOTA: La miscela di reazione affonda naturalmente sul fondo della tazza e forma un doppio strato. Non disturbare il doppio strato mescolando o agitando la tazza.
  5. Eseguire una traduzione su larga scala (Figura 1).
    1. Versare 22 mL di tampone di traslazione in una provetta da 25 mL. Inserire una coppa di dialisi di grandi dimensioni (2 ml) nel tubo e aggiungere 2 ml di tampone di traslazione nella tazza.
    2. Preparare una miscela di reazione di traduzione mescolando 130 μL di tampone di traduzione, 20 μL di 2 mg/mL di creatina chinasi, 100 μL di 50 mg/ml di liposoma, 125 μL di estratto di germe di grano e 125 μL di mRNA. Mescolare delicatamente mediante pipettaggio.
    3. Aspirare tutta la miscela di reazione di traslazione (500 μL) utilizzando una pipetta da 1.000 μL. Iniettare la miscela della reazione di traslazione nella coppa di dialisi nello stesso modo descritto al punto 5.4.5. Coprire la coppa di dialisi con un coperchio per evitare l'evaporazione.
  6. Incubare le reazioni a 15 °C per 24 ore.
  7. Mescolare bene la reazione nella coppa di dialisi mediante pipettaggio. Trasferire la sospensione grezza di proteoliosoma in un nuovo tubo.
    NOTA: Si consiglia un tubo piatto da 1,5 ml per raccogliere il proteoliposoma dalla traduzione su piccola scala. Dopo la centrifugazione, i liposomi formano pellet compatto e facilmente visibile nell'angolo inferiore del tubo.

6. Purificazione dei proteoliposomi

  1. Centrifugare la provetta contenente la sospensione di proteoliosoma grezzo a 17.800 x g a 4 °C per 10 minuti.
  2. Rimuovere il surnatante. Sospendere il pellet proteoliosoma in PBS (piccola scala: 1 mL, grande scala: 10 ml) mediante pipettaggio.
  3. Ripetere la centrifugazione e il lavaggio dei proteoliposomi per altri due cerchi.
  4. Dopo il lavaggio, aggiungere una piccola quantità di PBS e risospendere bene il pellet di proteoliposomia mediante pipettaggio. Misurare il volume della sospensione utilizzando una micro pipetta. Aggiungere PBS per regolare il volume a 60 μL (piccola scala) o 500 μL (grande scala). Trasferire la sospensione in un nuovo tubo da 1,5 ml.
  5. Trasferire 10 μL di sospensione di proteoliposomia in una nuova provetta PCR per SDS-PAGE. Dividere il resto dei campioni in porzioni più piccole da utilizzare quando necessario. Congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.

7. Colorazione SDS-PAGE e CBB

  1. Aggiungere 70 μL di acqua e 40 μL di 3x tampone campione SDS-PAGE a 10 μL di sospensione di proteoliposomi.
    ATTENZIONE: Non far bollire il campione SDS-PAGE, poiché le proteine di membrana si aggregano e difficilmente penetrano nel gel di acrilammide in elettroforesi. Inoltre, aggiungere abbastanza agente riducente al tampone campione SDS-PAGE (ad esempio, 2-mercaptoetanolo al 3% di concentrazione finale) per prevenire l'ossidazione.
  2. Impostare un gel SDS-PAGE con gradiente del 5%–20% in una camera di elettroforesi. Carico 3 μL, 6 μL, 12 μL di campioni di proteoliposomi, 2 μL di marcatore di dimensione proteica e serie standard BSA.
  3. Elettroforesi a 52 mA, 400 V per 30 min.
  4. Macchiare il gel con colorante CBB per 1 ora. Decolorare in acqua calda e scansionare l'immagine del gel.
  5. Utilizzando il software NIH Image J (https://imagej.nih.gov/ij/), quantificare l'intensità della banda della proteina di membrana in ciascuna corsia. Stimare la quantità di proteine di membrana sintetizzate con la serie standard BSA.

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Risultati

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Utilizzando questo protocollo, i proteoliposomi parzialmente purificati possono essere ottenuti in breve tempo. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A. Venticinque GPCR di Classe A, B e C sono stati sintetizzati con successo utilizzando il metodo della dialisi a doppio strato (piccola scala) e parzialmente purificati mediante centrifugazione e lavaggio tampone. Sebbene la quantità di proteine sintetizzate vari a seconda del tipo di proteina, da 50 a 400 μg di proteine di m...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo presentato fornisce un metodo per produrre proteine di membrana ad un alto tasso di successo. Questo protocollo è semplice, altamente riproducibile e facile da scalare. Ha anche il potenziale per ridurre i tempi e i costi degli esperimenti che consumano una grande quantità di proteine di membrana. Il metodo di dialisi a doppio strato migliora la produttività di 4-10 volte rispetto al metodo a doppio strato o al metodo di dialisi (Figura 2B)45. In un caso...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata supportata dal Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) di AMED con il numero di sovvenzione JP20am0101077. Questo lavoro è stato anche parzialmente supportato dal JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
&volte; 3 tamponeContenente il 10% di 2-mercaptoetanolo
5-20% di gel SDS-PAGE gradienteATTOE-D520L
70% di etanoloEtanolo diluito con acqua ultrapura.
AgarosioTakara Bio
Acetato di ammonioNakalai tesque02406-95Poiché questo reagente è deliquescente, scioglierlo tutto in acqua una volta aperto e conservarlo a -30°C.
Ampicillina SodiumNakalai tesque02739-74
Liposoma di asolectina, liofilizzatoCellFree SciencesCFS-PLE-ASLUna fiala contiene 10 mg di liposomi liofilizzati.
Standard BSA1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 & micro; L &volte; 1 tampone campione SDS-PAGE
Clone di cDNA
CloroformioNakalai tesque08402-84
C o più largo.
Creatina chinasiRoche Diagnostics04524977190
Tazza per dialisi (0,1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo per dialisi, 10K MWCO, 0,1 mL
Tazza per dialisi (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo per dialisi, 10K MWCO, 2 mL
Marcatore a scala di DNAThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Ladder
DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
Ceppo di E. coli JM109
Camera di elettroforesiATTO
Etanolo (99,5%)Nakalai tesque14713-95
Bromuro
Pallone di evaporazione, 100 mL
Gel imager
Gel scannerUtilizziamo scanner di documenti e immuninatore LED come sostituto.
Brodo
Lipidi di interesseAvanti Polar Lipids
Micro centrifugaTOMYMX-307
Miscela NTPCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMiscela di ATP, GTP, CTP, UTP, a 25 mM ciascuno
Provetta da 25 mL senza nucleasiIWAKI362-025-MYP
Provette in plastica senza nucreasiWatson bio labsNon sterilizzare in autoclave. Usali separatamente dagli altri esperimenti.
Punte prive di nucreasiWatson bio labsNon sterilizzare in autoclave. Usali separatamente dagli altri esperimenti.
Kit di purificazione PCR
Clean-up vettore pEU-E01-MCSCellFree SciencesCFS-11
Fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25:24:1)Nippon Gene311-90151
Kit midi per la preparazione dei plasmidiMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
Primer 1Thermo Fisher Scientific Sintesioligo personalizzata5'-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnn-3'
Primer specifico per il gene, in avanti. Le lettere maiuscole mostrano la sequenza di sovrapposizione da aggiungere per una clonazione senza soluzione di continuità. Minuscolo nnnn…. (20-30 bp) mostra la sequenza genica specifica.
Primer 2Thermo Fisher Scientific Sintesioligo personalizzata5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnn-3'
Primer specifico per gene, inverso. Le lettere maiuscole mostrano la sequenza di sovrapposizione da aggiungere per una clonazione senza soluzione di continuità. Minuscolo nnnn…. (20-30 bp) mostra la sequenza genica specifica.
Primer 3Thermo Fisher ScientificSintesi oligo personalizzata5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
Primer diretto per la linearizzazione vettoriale. La sottolineatura funziona come sovrapposizione nella clonazione senza soluzione di continuità.
Primer 4Thermo Fisher ScientificSintesi oligo personalizzata5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
Primer inverso per la linearizzazione vettoriale. La sottolineatura funziona come sovrapposizione nella clonazione senza soluzione di continuità.
Primer 5Thermo Fisher Scientific Sintesioligo personalizzata5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3'
Primer per sequenziamento, Primer in avanti
6Thermo Fisher Scientific Sintesioligo personalizzata5'- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3'
Primer per sequenziamento, inverso
Marcatore dimensionale delle proteineBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
Evaporatore
Miscela di enzimi di clonazione senza soluzione di continuitàNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
Sono disponibili anche altri reagenti di clonazione senza soluzione di continuità.
SP6 RNA polimerasi & Cellula inibitrice della RNasiFreeSciencesCFS-TSC-ENZ
elettroforesi sottomarina
Tampone TAE Tampone
di trascrizione LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
Tampone di traduzioneCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (&volte; 40) soluzione madre (S1, S2, S3, S4).
Preparare &volte; 1 tampone di traslazione prima dell'uso miscelando il brodo S1, S2, S3, S4 e l'acqua ultrapura.
AcquaSi consiglia di preparare l'acqua ultrapura utilizzando un sistema di produzione di acqua ultrapura ogni volta che si esegue un esperimento. Non sterilizzare in autoclave.
Abbiamo preparato acqua ultrapura utilizzando Milli-Q Reference e il sistema Elix10.
L'acqua priva di nucleasi disponibile in commercio (non l'acqua trattata con DEPC) può essere utilizzata come sostituto. Prendersi cura della contaminazione dopo aver aperto il flacone.
Omogeneizzatore ad ultrasuoniBransonSONIFIER modello 450D-AdvancedIl pulitore ad ultrasuoni può essere utilizzato come sostituto.
Transilluminatore
Essiccatore
Estratto di germe di granoCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240
campione SDS-PAGE colorante in gel CBB di interesse Plasmide che ospita un clone di cDNA o un frammento di DNA sintetico Incubatore raffreddato Temperatura compresa tra 0 e 40 °di etidioLB tampone PBS MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel e PCR rotanteSistema di ultrapura UVsottovuoto

Riferimenti

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