Articolo metodologico

Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana

DOI:

10.3791/61871

⸱

22 settembre 2020

 , 
1Graduate School of Medicine, Ehime University, 2Proteo-Science Center, Ehime University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo efficiente privo di cellule per la produzione di proteoliosomi di alta qualità mediante metodo di dialisi a doppio strato utilizzando un sistema privo di cellule di grano e liposomi. Questo metodo fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening dei bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le proteine di membrana svolgono ruoli essenziali in una varietà di processi cellulari e svolgono funzioni vitali. Le proteine di membrana sono importanti dal punto di vista medico nella scoperta di farmaci perché sono gli obiettivi di oltre la metà di tutti i farmaci. Un ostacolo alla conduzione di studi biochimici, biofisici e strutturali sulle proteine di membrana e sullo sviluppo di anticorpi è stata la difficoltà di produrre grandi quantità di proteine di membrana di alta qualità con corretta conformazione e attività. Qui descriviamo un "metodo di dialisi a doppio strato" che utilizza un sistema privo di cellule di germe di grano, liposomi e coppette di dialisi per sintetizzare efficacemente le proteine di membrana e preparare proteoliposomi purificati in breve tempo con un alto tasso di successo. Le proteine di membrana possono essere prodotte tanto quanto in diversi milligrammi, come GPCR, canali ionici, trasportatori e tetraspanine. Questo metodo privo di cellule contribuisce a ridurre i tempi, i costi e gli sforzi per la preparazione di proteoliposomi di alta qualità e fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening di bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

Introduzione

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Le proteine di membrana sono uno dei bersagli farmacologici più importanti nella diagnosi e nella terapia. Infatti, metà dei piccoli farmaci composti bersaglio sono proteine di membrana, come i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) e i canali ionici1. Nel corso degli anni, i ricercatori hanno lavorato su studi biochimici, biofisici e strutturali delle proteine di membrana per chiarire la loro struttura e funzione 2,3. Anche lo sviluppo di anticorpi monoclonali contro le proteine di membrana viene eseguito attivamente al fine di accelerare gli studi funzionali e strutturali e sviluppa....

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Protocollo

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1. Preparazione del plasmide di espressione pEU

NOTA: il plasmide di espressione pEU deve includere il codone iniziale, il frame di lettura aperto della proteina di membrana bersaglio e il codone di arresto nel frammento (vedere Figura 1). Aggiungere sequenze di tag di rilevamento/purificazione nella posizione appropriata quando necessario. Per la subclonazione è applicabile la digestione enzimatica di restrizione o la clonazione senza soluzione di continuità. Qui descriviamo un protocollo che utilizza un metodo di clonazione senza soluzione di continuità.

  1. Preparare inserire un frammento di DNA.

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    Risultati

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    Utilizzando questo protocollo, i proteoliposomi parzialmente purificati possono essere ottenuti in breve tempo. I risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2A. Venticinque GPCR di Classe A, B e C sono stati sintetizzati con successo utilizzando il metodo della dialisi a doppio strato (piccola scala) e parzialmente purificati mediante centrifugazione e lavaggio tampone. Sebbene la quantità di proteine sintetizzate vari a seconda del tipo di proteina, da 50 a 400 μg di proteine di m.......

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    Discussione

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Il protocollo presentato fornisce un metodo per produrre proteine di membrana ad un alto tasso di successo. Questo protocollo è semplice, altamente riproducibile e facile da scalare. Ha anche il potenziale per ridurre i tempi e i costi degli esperimenti che consumano una grande quantità di proteine di membrana. Il metodo di dialisi a doppio strato migliora la produttività di 4-10 volte rispetto al metodo a doppio strato o al metodo di dialisi (Figura 2B)45. In un caso.......

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    Dichiarazioni

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Gli autori non hanno nulla da rivelare.

    Ringraziamenti

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Questa ricerca è stata supportata dal Platform Project for Supporting Drug Discovery and Life Science Research (Basis for Supporting Innovative Drug Discovery and Life Science Research (BINDS)) di AMED con il numero di sovvenzione JP20am0101077. Questo lavoro è stato anche parzialmente supportato dal JSPS KAKENHI Grant Number 20K05709.

    ....

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    Materiali

    Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
    NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
    &volte; 3 tamponeContenente il 10% di 2-mercaptoetanolo
    5-20% di gel SDS-PAGE gradienteATTOE-D520L
    70% di etanoloEtanolo diluito con acqua ultrapura.
    AgarosioTakara Bio
    Acetato di ammonioNakalai tesque02406-95Poiché questo reagente è deliquescente, scioglierlo tutto in acqua una volta aperto e conservarlo a -30°C.
    Ampicillina SodiumNakalai tesque02739-74
    Liposoma di asolectina, liofilizzatoCellFree SciencesCFS-PLE-ASLUna fiala contiene 10 mg di liposomi liofilizzati.
    Standard BSA1000 ng, 500 ng, 250 ng, 125 ng BSA / 10 & micro; L &volte; 1 tampone campione SDS-PAGE
    Clone di cDNA
    CloroformioNakalai tesque08402-84
    C o più largo.
    Creatina chinasiRoche Diagnostics04524977190
    Tazza per dialisi (0,1 mL)Thermo Fisher Scientific69570Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo per dialisi, 10K MWCO, 0,1 mL
    Tazza per dialisi (2 mL)Thermo Fisher Scientific88404Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo per dialisi, 10K MWCO, 2 mL
    Marcatore a scala di DNAThermo Fisher ScientificSM0311GeneRuler 1 kb DNA Ladder
    DpnIThermo Fisher ScientificFD1703FastDigest DpnI
    Ceppo di E. coli JM109
    Camera di elettroforesiATTO
    Etanolo (99,5%)Nakalai tesque14713-95
    Bromuro
    Pallone di evaporazione, 100 mL
    Gel imager
    Gel scannerUtilizziamo scanner di documenti e immuninatore LED come sostituto.
    Brodo
    Lipidi di interesseAvanti Polar Lipids
    Micro centrifugaTOMYMX-307
    Miscela NTPCellFree SciencesCFS-TSC-NTPMiscela di ATP, GTP, CTP, UTP, a 25 mM ciascuno
    Provetta da 25 mL senza nucleasiIWAKI362-025-MYP
    Provette in plastica senza nucreasiWatson bio labsNon sterilizzare in autoclave. Usali separatamente dagli altri esperimenti.
    Punte prive di nucreasiWatson bio labsNon sterilizzare in autoclave. Usali separatamente dagli altri esperimenti.
    Kit di purificazione PCR
    Clean-up vettore pEU-E01-MCSCellFree SciencesCFS-11
    Fenolo/cloroformio/alcol isoamilico (25:24:1)Nippon Gene311-90151
    Kit midi per la preparazione dei plasmidiMACHEREY-NAGEL740410NucleoBond Xtra Midi
    Primer 1Thermo Fisher Scientific Sintesioligo personalizzata5'-CCAAGATATCACTAGnnnnnnnnnn-3'
    Primer specifico per il gene, in avanti. Le lettere maiuscole mostrano la sequenza di sovrapposizione da aggiungere per una clonazione senza soluzione di continuità. Minuscolo nnnn…. (20-30 bp) mostra la sequenza genica specifica.
    Primer 2Thermo Fisher Scientific Sintesioligo personalizzata5'-CCATGGGACGTCGACnnnnnnnnnn-3'
    Primer specifico per gene, inverso. Le lettere maiuscole mostrano la sequenza di sovrapposizione da aggiungere per una clonazione senza soluzione di continuità. Minuscolo nnnn…. (20-30 bp) mostra la sequenza genica specifica.
    Primer 3Thermo Fisher ScientificSintesi oligo personalizzata5'-GTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAAT-3'
    Primer diretto per la linearizzazione vettoriale. La sottolineatura funziona come sovrapposizione nella clonazione senza soluzione di continuità.
    Primer 4Thermo Fisher ScientificSintesi oligo personalizzata5'-CTAGTGATATCTTGGTGATGTAGATAGGTG-3'
    Primer inverso per la linearizzazione vettoriale. La sottolineatura funziona come sovrapposizione nella clonazione senza soluzione di continuità.
    Primer 5Thermo Fisher Scientific Sintesioligo personalizzata5'-CAGTAAGCCAGATGCTACAC-3'
    Primer per sequenziamento, Primer in avanti
    6Thermo Fisher Scientific Sintesioligo personalizzata5'- CCTGCGCTGGGAAGATAAAC-3'
    Primer per sequenziamento, inverso
    Marcatore dimensionale delle proteineBio-Rad1610394Precision Plus Protein Standard
    Evaporatore
    Miscela di enzimi di clonazione senza soluzione di continuitàNew England BioLabsE2611LGibson Assembly Master Mix
    Sono disponibili anche altri reagenti di clonazione senza soluzione di continuità.
    SP6 RNA polimerasi & Cellula inibitrice della RNasiFreeSciencesCFS-TSC-ENZ
    elettroforesi sottomarina
    Tampone TAE Tampone
    di trascrizione LMCellFree SciencesCFS-TSC-5TB-LM
    Tampone di traduzioneCellFree SciencesCFS-SUB-SGCSUB-AMIX SGC (&volte; 40) soluzione madre (S1, S2, S3, S4).
    Preparare &volte; 1 tampone di traslazione prima dell'uso miscelando il brodo S1, S2, S3, S4 e l'acqua ultrapura.
    AcquaSi consiglia di preparare l'acqua ultrapura utilizzando un sistema di produzione di acqua ultrapura ogni volta che si esegue un esperimento. Non sterilizzare in autoclave.
    Abbiamo preparato acqua ultrapura utilizzando Milli-Q Reference e il sistema Elix10.
    L'acqua priva di nucleasi disponibile in commercio (non l'acqua trattata con DEPC) può essere utilizzata come sostituto. Prendersi cura della contaminazione dopo aver aperto il flacone.
    Omogeneizzatore ad ultrasuoniBransonSONIFIER modello 450D-AdvancedIl pulitore ad ultrasuoni può essere utilizzato come sostituto.
    Transilluminatore
    Essiccatore
    Estratto di germe di granoCellFree SciencesCFS-WGE-7240WEPRO7240
    campione SDS-PAGE colorante in gel CBB di interesse Plasmide che ospita un clone di cDNA o un frammento di DNA sintetico Incubatore raffreddato Temperatura compresa tra 0 e 40 °di etidioLB tampone PBS MACHEREY-NAGEL 740609 NucleoSpin Gel e PCR rotanteSistema di ultrapura UVsottovuoto

    Riferimenti

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews. Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
    2. Gusach, A., et al. Beyond structure: emerging approaches to study GPCR dynamics. Current Opinion in Structural Biology

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    Sintesi proteica cell freeproduzione di proteine di membranapreparazione di proteoliposomimetodo della dialisi del doppio stratosistema a germe di granoformazione di liposomianalisi SDS PAGEpurificazione per centrifugazione

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