Caratterizzazione e predizione funzionale dei batteri nei tessuti ovarici

Summary

La colorazione immunoistochimica e il sequenziamento del gene dell'RNA ribosomiale 16S (gene rRNA 16S) sono stati eseguiti al fine di scoprire e distinguere i batteri nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi in situ. Le differenze compositiva e funzionale dei batteri sono state previste utilizzando BugBase e Phylogenetic Investigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt).

Abstract

La teoria di un tratto riproduttivo superiore femminile "sterile" ha incontrato una crescente opposizione a causa dei progressi nel rilevamento batterico. Tuttavia, se le ovaie contengono batteri non è stato ancora confermato. Qui è stato introdotto un esperimento per rilevare i batteri nei tessuti ovarici. Abbiamo scelto pazienti con cancro ovarico nel gruppo oncologico e pazienti non cancerose nel gruppo di controllo. Il sequenziamento del gene rRNA 16S è stato utilizzato per differenziare i batteri nei tessuti ovarici dal cancro e dai gruppi di controllo. Inoltre, abbiamo previsto la composizione funzionale dei batteri identificati utilizzando BugBase e PICRUSt. Questo metodo può essere utilizzato anche in altri visceri e tessuti poiché molti organi hanno dimostrato di ospitare batteri negli ultimi anni. La presenza di batteri nei visceri e nei tessuti può aiutare gli scienziati a valutare i tessuti cancerosi e normali e può essere di aiuto nel trattamento del cancro.

Introduction

Recentemente, è stato pubblicato un numero crescente di articoli che dimostrano l'esistenza di batteri nei visceri solidi addominali, come il rene, la milza, il fegato e l'ovaio^1,2. Geller et al. hanno trovato batteri nei tumori pancreatici e questi batteri erano resistenti alla gemcitabina, un farmaco chemioterapico^2. S. Manfredo Vieira et al. hanno concluso che Enterococcus gallinarum era portatile ai linfonodi, al fegato e alla milza e poteva guidare l'autoimmunità³.

Poiché la cervice svolge un ruolo di difensore, i batteri nel tratto riproduttivo femminile superiore, che contiene l'utero, le tube di Falloppio e le ovaie, sono stati minimamente studiati. Tuttavia, alcune nuove teorie sono state stabilite negli ultimi anni. I batteri possono avere accesso alla cavità uterina durante il ciclo mestruale a causa di cambiamenti nelle mucine^4,5. Inoltre, Zervomanolakis et al. hanno confermato che l'utero, insieme alle tube di Falloppio, è una pompa peristaltica controllata dal sistema endocrino delle ovaie e questa disposizione consente ai batteri di entrare nell'endometrio, nelle tube di Falloppio e nelle ovaie⁶.

Il tratto riproduttivo superiore non è più un mistero grazie allo sviluppo di metodi di rilevamento batterico. Verstraelen et al. hanno utilizzato un metodo di sequenziamento accoppiato con codice a barre per scoprire i batteri uterini prendendo di mira la regione ipervariabile V1-2 del gene RNA 16S⁷. Fang et al. hanno impiegato il sequenziamento con codice a barre in pazienti con polipi endometriali e hanno rivelato la presenza di diversi batteri intrauterini^8. Inoltre, utilizzando il gene RNA 16S, Miles et al. e Chen et al. hanno trovato batteri nel sistema genitale di donne che erano sottoposte a salpingo-ovariectomia e isterectomia, rispettivamente^5,9.

I batteri nei tessuti tumorali hanno guadagnato crescente attenzione negli ultimi anni. Banerjee et al. hanno scoperto che la firma del microbioma differiva tra le pazienti con cancro ovarico e i controlli¹⁰. Unnoxynatronum sibiricum è stato associato allo stadio tumorale e Methanosarcina vacuolata potrebbe essere usato per diagnosticare il cancro ovarico¹¹. Oltre al cancro ovarico, altri tumori, come stomaco, polmone, prostata, seno, cervice ed endometrio, hanno dimostrato di essere associati ai batteri^{12,13,14,15,16,17,18.} Poore et al. hanno proposto una nuova classe di diagnostica oncologica basata su microbi, prevedendo lo screening del cancro in fase iniziale¹⁹. In questo protocollo, abbiamo studiato le differenze tra tessuti ovarici cancerosi e normali confrontando la composizione e la funzione dei batteri in questi due tessuti.

La colorazione immunoistochimica e il sequenziamento del gene rRNA 16S sono stati eseguiti per confermare la presenza di batteri nelle ovaie. Sono state studiate le differenze e le funzioni previste dei batteri ovarici nei tessuti ovarici cancerosi e non cancerosi. I risultati hanno mostrato l'esistenza di batteri nei tessuti ovarici. Anoxynatronum sibiricum e Methanosarcina vacuolata erano correlati rispettivamente allo stadio e alla diagnosi di cancro ovarico. Sono stati confrontati quarantasei percorsi KEGG significativamente diversi che erano presenti in entrambi i gruppi.

Protocol

Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Medico Istituzionale del Primo Ospedale Affiliato dell'Università di Xi'an Jiaotong (No. XJTUIAF2018LSK-139). Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i pazienti arruolati.

1. Criteri per l'ingresso nel gruppo oncologico e nel gruppo di controllo

1. Per il gruppo di cancro, arruolare pazienti a cui viene diagnosticato principalmente il cancro ovarico e, dopo laparotomia, è dimostrato che hanno un cancro ovarico sieroso da reperti patologici.
2. Per il gruppo di controllo, arruolare pazienti a cui viene diagnosticato principalmente un mioma uterino o un'adenomiosi uterina, senza presentare alcuna condizione ovarica e che hanno subito isterectomia e salpingo-ovariectomia.
   NOTA: questo standard non è definito. Possono essere arruolati anche pazienti con malattie che non colpiscono le ovaie che si sottopongono a isterectomia e salpingo-ovariectomia.
3. Escludere i pazienti con uno o più dei seguenti criteri:
   Donne incinte o che allattano.
   Assunzione di antibiotici 2 mesi prima dell'intervento chirurgico.
   Avere febbre o marcatori infiammatori elevati.
   Avere infiammazioni di qualsiasi tipo.
   Aver subito la chemioterapia neoadiuvante.

2. Raccogli campioni

1. Durante l'intervento chirurgico, posizionare le ovaie resecate in un tubo sterile e posizionare il tubo in azoto liquido per il trasporto. Evitare di toccare qualsiasi altra cosa durante l'intera procedura.
2. Separare le ovaie in campioni di tessuto di circa 1 cm di spessore con un paio di nuove pinzette sterili sotto un armadio a flusso laminare. Dopo la separazione, conservare i campioni a -80 °C.
   NOTA: Tutte le procedure per la raccolta dei campioni sono asettiche, compresa la separazione delle ovaie.

3. Sequenziare il gene rRNA 16S

1. Estrarre il DNA.
   1. Aggiungere 1,2 mL di tampone EX inibitore in un tubo centrifugo da 2 mL. Quindi, aggiungere 180-220 mg di campioni nel tubo. Lasciare mescolare completamente il campione (70 °C a bagnomaria per 5 minuti e poi vortice per 15 s).
   2. Centrifugare il tubo per 1 min a 600 x g.
   3. Posizionare 550 μL del surnatante in un nuovo tubo da 1,5 mL e centrifugare per 1 minuto a 600 x g.
   4. Trasferire 400 μL del surnatante con 30 μL di proteinasi K in un altro tubo da 1,5 mL.
   5. Aggiungere 400 μL di buffer AL e utilizzare un miscelatore a vortice per 15 s.
   6. Incubare a 70 °C per 10 min.
   7. Aggiungere 400 μL di alcol al 96-100%. Utilizzare un mixer a vortice per 15 s.
   8. Trasferire 600 μL di miscela in una colonna di assorbimento e centrifugare per 1 minuto a 13700 g. Sostituire il tubo inferiore. Ripetere questo passaggio 11 volte.
   9. Aggiungere 500 μL di tampone AW1, centrifugare per 1 minuto a 13.700 x g e cambiare il tubo inferiore.
   10. Aggiungere 500 μL di tampone AW2, centrifugare per 3 minuti a 13.700 x g e cambiare il tubo inferiore.
   11. Centrifuga per 3 min a 13.700 x g.
   12. Trasferire la miscela in un nuovo tubo da 1,5 mL, aggiungere 200 μL di tampone ATE, incubare a temperatura ambiente per 5 minuti e centrifugare per 1 minuto a 13.700 x g.
2. Test di qualità. Utilizzare l'elettroforesi su gel di sefarosi all'1% per testare la qualità. Aggiungere 400 ng di campione, 120 V, 30 minuti. Risultato ideale: concentrazione di DNA: ≥ 10 ng/μL, purezza del DNA: A260/A280 = 1,8-2,0, DNA lordo: ≥ 300 ng.
3. Preparare le librerie utilizzando un kit di sequenziamento metagenomico 16S secondo il protocollo del produttore.
   1. Eseguire la PCR. In breve, ogni reazione PCR da 25 μL contiene 12,5 ng di DNA campione come input, 12,5 μL di 2x KAPA HiFi HotStart ReadyMix e 5 μL di ciascun primer a 1 μM.
   2. Effettuare la PCR utilizzando il seguente protocollo: una fase iniziale di denaturazione eseguita a 95°C per 3 min seguita da 25 cicli di denaturazione (95°C, 30 s), ricottura (55°C, 30 s) ed estensione (72°C, 30 s), e un allungamento finale di 5 min a 72°C.
   3. Pulire il prodotto PCR dalla miscela di reazione con perle magnetiche utilizzando le istruzioni del produttore.
   4. Ripetere i passaggi 3.3.1 e 3.3.2.
   5. Test di qualità. Fare riferimento al passaggio 3.2.
   6. Ripetere il passaggio 3.3.3.
   7. Test di qualità. Utilizzare l'elettroforesi su gel di sefarosio all'1% per testare l'impurità, uno spettrofotometro per testare la purezza, un fluorometro per testare la concentrazione e un kit di analisi dell'RNA per testare l'integrità. Seguire il protocollo del produttore. Normalizzare e mettere in comune le librerie; quindi sequenza (2 x 300 bp paired-end read setting) utilizzando celle a flusso standard V3 a 600 cicli, producendo circa 100.000 letture di base 2 x 300.
      NOTA: Le sequenze di primer a lunghezza intera: 16S Amplicon polymerase chain reaction (PCR) Forward primer: 5' TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGA GACAG-[CCTACGGGNGGCWGCAG] e 16S Amplicon PCR Primer inverso: 5' GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-[GACTACHVGGGTATCTAATCC].

4. Analizza i dati di sequenziamento del gene rRNA 16S

1. Filtra le letture grezze di ogni campione in base alla qualità del sequenziamento con il pacchetto software QIIME 2-201802²⁰.
   1. Copiare tre file nella directory: emp-paired-end-sequences_01
      un file forward.fastq.gz che contiene la sequenza forward legge,
      un file reverse..gz che contiene la sequenza inversa legge,
      un file barcodes.fastq.gz che contiene le letture dei codici a barre associate
   2. Eseguire
      qiime tools import \
      --type EMPPairedEndSequences \
      --input-path emp-paired-end-sequences_01 \--output-path emp-paired-end-sequences_02.qza
2. Rimuovere le sequenze di primer e adattatore.
   qiime cutadapt trim-paired \
   --i-demultiplexed-sequences demultiplexed-seqs_02.qza \
   --p-front-f GCTACGGGGGG \
   --p-front-r GCTACGGGGGG \
   --p-error-rate 0 \
   --quality-cutoff 25 \
   --o-trimmed-sequences trimmed-seqs_03.qza \
   --verboso
3. Accorciare le letture della sequenza in cui entrambe le qualità di estremità accoppiate sono inferiori a 25. Vedi sopra --quality-cutoff 25
4. Analizzare i dati di sequenziazione.
   1. Raccogli sequenze per formare unità tassonomiche operative (OTU) con un cutoff di somiglianza al 97%.
      qiime vsearch dereplicate-sequences \
      --i-sequences trimmed-seqs_03.qza \
      --o-dereplicated-table table_04.qza \
      --o-dereplicated-sequences rep-seqs_04.qza
      ​
      qiime vsearch cluster-features-closed-reference \
      --i-table table_04.qza \
      --i-sequences rep-seqs_04.qza \
      --i-reference-sequences 97_otus.qza \
      --p-perc-identity 0,97 \
      --o-clustered-table table-cr-97.qza \
      --o-clustered-sequences rep-seqs-cr-97.qza \
      --o-unmatched-sequences unmatched-cr-97.qza
   2. Per le OTA, calcolare l'abbondanza relativa in ciascun campione. Le informazioni sull'abbondanza sono in table-cr-97.qza
5. Utilizzare un classificatore bayesiano nativo, che mira al set di formazione RDP (versione 9; http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/), per ordinare tutte le sequenze. Le informazioni sui taxon mappati sono in table-cr-97.qza
6. All'interno dell'OTU data, assegnare una classificazione che rifletta la maggiore coerenza delle sequenze alle OTU. Quindi, allineare le OTA. Vedere table-cr-97.qza e rep-seqs-cr-97.qza
7. Sulla base delle informazioni del gruppo campione, eseguire la diversità alfa (inclusi gli indici Chao 1, ACE, Shannon, Simpson e Evenness) e l'analisi delle coordinate principali basata su UniFrac (PCoA).
   qiime strumenti esportazione \
   --input-path table-cr-97.qza \
   --output-path exported-feature-table
   exported-feature-table
   
   qiime diversità alfa \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-metrico observed_otus \
   --o-alpha-diversity observed_otus_vector.qza
   
   qiime diversità beta \
   --i-table table-cr-97.qza \
   --p-metrica braycurtis \
   --o-matrice di distanza unweighted_unifrac_distance_matrix.qza

5. Prevedere la funzione batterica

1. Per prevedere la rappresentazione correlata delle caratteristiche dei batteri, utilizzare BugBase²¹. La tabella OTU di input per BugBase viene preparata utilizzando i seguenti comandi.
   biom convert -i otu_table.biom -o otu_table.txt --to-tsv
   biom convert -i otu_table.txt -o otu_table_json.biom --table-type="OTU table" --to-json
   NOTA: La previsione si basa su sei categorie di fenotipi (Ward et al. non pubblicati) (https://bugbase.cs.umn.edu/): colorazione di Gram, tolleranza all'ossigeno, capacità di formare biofilm, contenuto di elementi mobili, patogenicità e tolleranza allo stress ossidativo.
2. Predire la composizione funzionale di un metagenoma da picrust con l'uso di dati genetici marcatori e un database contenente genomi di riferimento²².
   make_otu_table.py -i microbiome_97/uclust_ref_picked_otus/test_paired_otus.txt -t /mnt/nas_bioinfo/ref/qiime2_ref/97_otu_taxonomy.txt -o otu_table.biom &
   normalize_by_copy_number.py -i otu_table.biom -o normalized_otus.biom
   predict_metagenomes.py -i normalized_otus.biom -o metagenome_predictions.biom
   categorize_by_function.py -i metagenome_predictions.biom -c "KEGG_Pathways" -l 1 -o picrust_L1.biom
   categorize_by_function.py -f -i metagenome_predictions.biom -c KEGG_Pathways -l 1 -o metagenome_predictions. L1.txt
3. Analizza le differenze di funzioni tra ogni gruppo con l'aiuto di STAMP^23,24. Si prega di fare riferimento alle citazioni per utilizzare il software.

6. Dati

1. Utilizzare un software statistico per calcolare la significatività dei risultati. L'indicazione della significatività statistica deve essere impostata come P < 0,05.
2. Valuta le differenze di età e parità con il t-test dello studente. Valutare le differenze nello stato della menopausa, la storia di ipertensione e diabete dal test del chi quadrato. Valutare le differenze nel numero di taxa batterici ovarici dal test Mann-Whitney U.

Results

Pazienti
Un totale di 16 pazienti qualificati sono stati inclusi nello studio. Il gruppo di controllo comprendeva 10 donne con una diagnosi di tumore uterino benigno (tra queste, a 3 pazienti è stato diagnosticato un mioma uterino e a 7 pazienti è stata diagnosticata l'adenomiosi uterina). Nel frattempo, il gruppo oncologico conteneva 6 donne con una diagnosi di carcinoma ovarico sieroso (tra queste, a 2 pazienti è stato diagnosticato lo stadio II e a 2 di loro è stato diagnosticato lo stadio III). Le...

Discussion

Il cancro ovarico ha una notevole influenza sulla fertilità delle donne²⁵. La maggior parte delle pazienti con cancro ovarico viene diagnosticata in fasi avanzate e il tasso di sopravvivenza a 5 anni è inferiore al 30%¹⁸. È stata pubblicata la conferma dei batteri nei visceri solidi addominali, tra cui fegato, pancreas e milza. L'esistenza di batteri nel tratto riproduttivo femminile superiore si verifica perché la cervice non è racchiusa^2,

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2200 TapeStation Software	Agilgent Stati Uniti
AmpliSeq per Illumina Preparazione della libreria, indici e accessori	Illumina
Image-pro plus 7	Media Cybernetics
Leica ASP 300S	Leica Biosystems Division di Leica Microsystems
Leica EG 1150	Leica Biosystems Division of Leica Microsystems
Leica RM2235	Leica Biosystems Divisione di Leica Microsystems
LPS Core anticorpo monoclonale, clone WN1 222-5	Hycult Biotech
Mag-Bind RxnPure Plus perle magnetiche	Omega Biotek	M1386-00
Mag-Bind Universal Pathogen 96 Kit	Omega Biotek	M4029-01
MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Banca dati Silva	Max Planck Institute for Marine Microbiology e Jacobs University
il QuantiFluor dsDNA System	Promega	E2670
Trimmomatic	Bjö rn Usadel
ZytoChem Plus (HRP) Kit Anti-Coniglio (DAB)	Sistemi Zytomed	HRP008DAB-RB