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Articolo metodologico

Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi

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⸱

DOI:

10.3791/61884

⸱

27 ottobre 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente di digestione della collagenasi per l'isolamento di adipociti vitali e cellule di frazione vascolare stromale-SVF dal grasso viscerale umano in un unico processo, compresa la metodologia per ottenere RNA di alta qualità dagli adipociti e la fenotipizzazione dei macrofagi SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per l'analisi mediante citometria a flusso.

Abstract

Il tessuto adiposo viscerale (VAT) è un organo metabolico attivo composto principalmente da adipociti maturi e cellule della frazione vascolare stromale (SVF), che rilasciano diverse molecole bioattive che controllano i processi metabolici, ormonali e immunitari; Attualmente, non è chiaro come questi processi siano regolati all'interno del tessuto adiposo. Pertanto, lo sviluppo di metodi che valutino il contributo di ciascuna popolazione cellulare alla fisiopatologia del tessuto adiposo è cruciale. Questo protocollo descrive le fasi di isolamento e fornisce le linee guida necessarie per la risoluzione dei problemi per un isolamento efficiente di adipociti maturi vitali e SVF da biopsie umane di VAT in un unico processo, utilizzando una tecnica di digestione enzimatica della collagenasi. Inoltre, il protocollo è anche ottimizzato per identificare sottogruppi di macrofagi ed eseguire l'isolamento dell'RNA degli adipociti maturi per studi di espressione genica, che consente di eseguire studi che sezionano l'interazione tra queste popolazioni cellulari. In breve, le biopsie VAT vengono lavate, tritate meccanicamente e digerite per generare una sospensione unicellulare. Dopo la centrifugazione, gli adipociti maturi vengono isolati mediante flottazione dal pellet SVF. Il protocollo di estrazione dell'RNA garantisce un'elevata resa di RNA totale (compresi i miRNA) dagli adipociti per i saggi di espressione a valle. Allo stesso tempo, le cellule SVF vengono utilizzate per caratterizzare sottogruppi di macrofagi (fenotipo pro- e anti-infiammatorio) attraverso l'analisi della citometria a flusso.

Introduzione

Il tessuto adiposo bianco è composto non solo da cellule adipose o adipociti, ma anche da una frazione di cellule non adipose nota come frazione vascolare stromale (SVF), che contiene una popolazione cellulare eterogenea costituita da macrofagi, altre cellule immunitarie come cellule T regolatorie (Treg) ed eosinofili, preadipociti e fibroblasti, circondati da tessuto vascolare e connettivo 1,2. Il tessuto adiposo (AT) è oggi considerato un organo che regola i processi fisiologici legati al metabolismo e all'infiammazione attraverso adipochine, citochine e microRNA prodotti e rilasciati da diverse cellule nel tessuto, con effetti autocrini, paracrini ed endocrini 3,4. Nell'uomo, il tessuto adiposo bianco comprende il tessuto adiposo sottocutaneo (SAT) e il tessuto adiposo viscerale (VAT), con importanti differenze anatomiche, molecolari, cellulari e fisiologiche tra loro 2,5. Il SAT rappresenta fino all'80% dell'AT umano, mentre il VAT si trova all'interno della cavità addominale, principalmente nel mesentere e nell'omento, essendo metabolicamente più attivo6. Inoltre, il VAT è un organo endocrino che secerne mediatori con un impatto sostanziale sul peso corporeo, sulla sensibilità all'insulina, sul metabolismo lipidico e sull'infiammazione. Di conseguenza, l'accumulo di IVA porta all'obesità addominale e alle malattie correlate all'obesità come il diabete di tipo 2, la sindrome metabolica, l'ipertensione e il rischio di malattie cardiovascolari, rappresentando un migliore predittore della mortalità associata all'obesità 6,7,8,9.

In condizioni omeostatiche, gli adipociti, i macrofagi e le altre cellule immunitarie cooperano per mantenere il metabolismo dell'IVA attraverso la secrezione di mediatori antinfiammatori10. Tuttavia, l'eccessiva espansione dell'IVA promuove il reclutamento di cellule T attivate, cellule NK e macrofagi. Infatti, nel VAT magra, il rapporto dei macrofagi è del 5%, mentre questo rapporto sale fino al 50% nell'obesità, con polarizzazione dei macrofagi dal fenotipo antinfiammatorio a quello pro-infiammatorio, generando un ambiente infiammatorio cronico10,11.

Come conseguenza della pandemia di obesità, è sorto un numero sorprendente di rapporti che affrontano diversi argomenti di ricerca IVA, tra cui la biologia degli adipociti, l'epigenetica, l'infiammazione, le proprietà endocrine e le aree emergenti come le vescicole extracellulari, tra gli altri 8,10,12,13. Tuttavia, sebbene l'ambiente VAT sia definito dal crosstalk tra gli adipociti e i macrofagi residenti o in arrivo, la maggior parte degli studi si è concentrata su una sola popolazione cellulare e ci sono scarse informazioni sull'interazione di queste cellule in VAT e sulle loro conseguenze fisiopatologiche11,14. Inoltre, sono stati condotti preziosi studi sull'interazione adipocita-macrofagi nell'AT utilizzando linee cellulari, prive delle condizioni di priming in vivo 11,14,15. Una strategia adeguata per sezionare l'interazione o il particolare contributo di queste cellule in VAT richiede l'isolamento di entrambi i tipi di cellule dalla stessa biopsia adiposa per eseguire saggi in vitro che rispecchino il più possibile le proprietà in vivo che regolano il metabolismo del VAT.

Sebbene i metodi di dissociazione non enzimatica basati su forze meccaniche per rompere l'AT garantiscano una manipolazione minima, questi metodi non possono essere utilizzati se l'obiettivo è quello di studiare le cellule SVF, poiché hanno una minore efficienza nel recupero cellulare e una bassa vitalità cellulare rispetto ai metodi enzimatici, ed è necessario un volume maggiore di tessuto16,17. La digestione enzimatica con collagenasi è un metodo delicato che consente un'adeguata digestione del collagene e delle proteine della matrice extracellulare dei tessuti fibrosi come il WAT18 ed è spesso utilizzato quando la tripsina è inefficace o dannosa19. Il protocollo fornisce linee guida fondamentali per la risoluzione dei problemi per l'isolamento efficiente di adipociti maturi vitali e cellule SVF da biopsie umane VAT in un unico processo, utilizzando una tecnica di digestione enzimatica della collagenasi, fornendo informazioni per garantire rese elevate (quantità, purezza e integrità) di RNA totale da adipociti maturi, compresi i microRNA, per applicazioni di espressione a valle. Allo stesso tempo, il protocollo è ottimizzato per identificare sottogruppi di macrofagi da cellule SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per ulteriori analisi mediante citometria a flusso20.

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Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dall'IRB dell'Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). La partecipazione era volontaria e tutte le donne iscritte hanno firmato il modulo di consenso informato.

1. Prelievo di tessuto adiposo viscerale

  1. Ottenere biopsie IVA attraverso omentectomia parziale durante il taglio cesareo da donne adulte sane con gravidanze singole a termine senza travaglio.
  2. Dopo la chiusura uterina e l'emostasi, procedere all'individuazione di un maggiore omento ed estenderlo su un impacco bagnato. L'AT esposto è l'IVA.
  3. Individua il vaso sanguigno più grande e traccia una linea immaginaria di 7 x 5 cm fino alla base dell'omento maggiore.
  4. Identifica una zona avascolare e usa la pinza Kelly per forare il lato esterno della VAT.
  5. Utilizzare la pinza di Ochsner per bloccare il lato prossimale e distale nella zona in cui è stata praticata la VAT e utilizzare le forbici Metzenbaum per tagliare il tessuto.
  6. Lega l'omento maggiore con il numero 1 di seta nera.
  7. Rimuovere la pinza di Ochsner e valutare l'emostasi.
  8. Mettere la biopsia VAT in un contenitore sterile e trasportarla immediatamente in laboratorio.

2. Digestione enzimatica del tessuto adiposo viscerale e isolamento degli adipociti maturi e delle cellule della frazione vascolare stromale

  1. Pesare la biopsia IVA e risciacquare con 1x PBS pH 7,4.
  2. Tagliare 4 g di VAT e utilizzare le forbici per tritare il tessuto in piccoli pezzi in un vassoio di dissezione.
  3. Trasferire l'IVA tritata in una provetta da centrifuga sterile da 50 ml, aggiungere 20 ml di PBS e agitare delicatamente per rimuovere l'eccesso di globuli rossi.
  4. Scartare PBS e ripetere la procedura due volte.
  5. Trasferire l'IVA in una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 mL e aggiungere 25 mL di soluzione digestiva (0,25% collagenasi di tipo II, 5 mM di glucosio, 1,5% albumina in PBS).
  6. Incubare a 37 °C per 60 minuti in agitatore orbitale a 125 giri/min.
  7. Filtrare il tessuto digerito attraverso tre strati di garza in una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 ml.
  8. Centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
  9. Si ottengono due fasi, una fase superiore che corrisponde agli adipociti maturi, mentre le cellule SFV rimangono nel pellet. Trasferire delicatamente gli adipociti maturi in una nuova provetta da centrifuga sterile da 50 ml utilizzando una pipetta di trasferimento.
  10. Aggiungere 20 mL di PBS freddo, agitare delicatamente e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a 4 °C.
  11. Scartare PBS e ripetere la procedura due volte.
  12. Utilizzare una pipetta di trasferimento per trasferire delicatamente gli adipociti maturi in una provetta per microcentrifuga priva di DNasi-RNasi da 1,5 mL.
  13. Centrifugare a 200 x g per 1 minuto a 4 °C e rimuovere il PBS in eccesso utilizzando una micropipetta P200. Ripetere questo passaggio se necessario.
  14. Trasferire delicatamente 300 μL di sospensione adipocitaria matura in provette per microcentrifuga da 1,5 mL prive di DNasi-RNasi. Conservare gli adipociti maturi a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA.
    NOTA: Gli adipociti non formano un pellet.
  15. Una volta separati gli adipociti (passaggio 2.9), aspirare la maggior parte della soluzione di digestione con una pipetta di trasferimento, mantenendo il pellet SVF sul fondo della provetta.
  16. Trasferire il pellet con le cellule SVF in una nuova provetta da centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta di trasferimento.
  17. Lavare delicatamente il pellet cellulare, risospendendo in 20 mL di PBS freddo 1x pipettando su e giù.
  18. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare rapidamente il surnatante per decantazione.
  19. Eseguire un secondo lavaggio ripetendo i passaggi 2.17 e 2.18.
  20. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi dei globuli rossi bilanciato a temperatura ambiente (RT) al pellet SVF e sospendere mediante pipettaggio ripetuto. Non vorticare.
  21. Incubare per 5 minuti a RT e centrifugare per 5 minuti a 800 x g. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta di trasferimento e smaltirlo correttamente.
  22. Per neutralizzare il tampone di lisi, aggiungere 10 mL di PBS 1x freddo e mescolare delicatamente fino a quando il pellet cellulare non si disaggrega.
  23. Centrifugare a 800 x g per 5 min per ottenere il pellet SVF ed eliminare il PBS. Un pellet bianco dovrebbe essere visibile sul fondo del tubo.
  24. Risospendere le cellule in 5 mL di PBS 1x a RT mediante pipettaggio ripetuto e filtrate attraverso tre strati di garza in una nuova provetta conica da 50 mL. Successivamente, queste cellule saranno utilizzate per la caratterizzazione delle sottopopolazioni di macrofagi mediante citometria a flusso.

3. Estrazione di RNA da adipociti maturi

  1. Preparare un'area pulita, utilizzando uno spray decontaminante a RNasi per evitare la degradazione dell'RNA. Utilizzare un set di pipette riservato alle procedure a RNA. Tutti i tubi e i puntali utilizzati devono essere privi di RNasi.
  2. Scongelare la sospensione adipocitaria matura (paragrafo 2.14) a 4 °C se è stata conservata a -80 °C.
    NOTA: Evitare più cicli di gelo-scongelamento.
  3. Lisare le cellule aggiungendo 1.000 μL di reagente a base di acido-guanidinio-fenolo e miscelare accuratamente con una micropipetta P1000 per omogeneizzare.
  4. Incubare per 5 minuti a RT per aumentare la dissociazione dei complessi nucleoproteici.
  5. Centrifugare il lisato cellulare per 5 minuti a 12.000 x g a RT. Si otterranno tre fasi: una fase superiore (gialla) corrispondente ai lipidi adipocitari, una fase intermedia (rosa) corrispondente agli acidi nucleici e una fase a pellet (detriti cellulari).
  6. Rimuovere con cautela lo strato lipidico, utilizzando una micropipetta P200.
  7. Trasferire la fase intermedia in una nuova provetta da 2 mL, evitando che i residui lipidici e i pellet disturbino (circa 700 μL).

4. Purificazione dell'RNA totale, compresi i microRNA

NOTA: Per ottenere RNA totale di alta qualità viene utilizzato un metodo di purificazione dell'RNA totale basato su colonna.

  1. Aggiungere un volume uguale di etanolo (95%-100%) al campione della sezione 3.7, circa 700 μL, e mescolare a mano capovolgendo la provetta per 10 s.
  2. Trasferire 700 μL di miscela in una colonna inserita in una provetta di raccolta, centrifugare ed eliminare il flusso continuo.
  3. Ricaricare la colonna e ripetere il passaggio 4.2.
  4. Trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta.
  5. Aggiungere 400 μL di tampone di prelavaggio alla colonna e alla centrifuga. Scartare il flusso continuo e ripetere questo passaggio.
  6. Aggiungere 700 μL di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare per 2 minuti.
  7. Trasferire con cautela la colonna in un tubo privo di nucleasi.
  8. Aggiungere 50 μL di acqua priva di nucleasi direttamente alla matrice della colonna ed eluire l'RNA mediante centrifugazione. Preparare aliquote da 10 μL utilizzando provette da microfuge da 200 μL.
  9. Mettere immediatamente le aliquote sul ghiaccio e utilizzarne una per determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA.
  10. Preparare un'aliquota di 5 μL di RNA totale aggiustata a 100 ng/μL per misurare l'integrità dell'RNA e la concentrazione di microRNA.
  11. Conservare a -80 °C fino al momento dell'utilizzo.

5. Determinazione della concentrazione, della purezza e dell'integrità dell'RNA adipocitario maturo; saggio di quantificazione dei microRNA

NOTA: Le determinazioni della concentrazione e della purezza dell'RNA vengono eseguite utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis; L'integrità dell'RNA e la quantificazione dei miRNA vengono eseguite utilizzando un analizzatore di controllo della qualità dell'RNA.

  1. Lavare il lettore di campioni con acqua di grado molecolare e strofinare.
  2. Caricare 2 μL di acqua di eluizione (vuoto), modificare l'impostazione in RNA e fare clic sul pulsante Vuoto .
  3. Caricare 2 μL di campione e fare clic sul pulsante Misura .
  4. Al termine della lettura, registrare i rapporti A260/A280 e A260/A230 e la quantità di RNA (ng/μL) (Figura 1A).
    NOTA: L'RNA con rapporto OD260/OD280 e OD260/OD230 intorno a 2,0 è considerato puro.
  5. Misurare il numero di integrità dell'RNA (RIN) utilizzando un kit di integrità dell'RNA seguendo le istruzioni del produttore (Figura 1B).
    NOTA: Un RIN =10 corrisponde a un RNA intatto, mentre un RIN ≤ 3.0 indica un RNA fortemente degradato. Per i microarray di espressione o RT-qPCR, utilizzare l'RNA con RIN ≥ 6.0.
  6. Utilizzare un piccolo kit di RNA per determinare la concentrazione e la percentuale di microRNA, seguendo le istruzioni del produttore (Figura 1C).
    NOTA: Per evitare la sovrastima di piccoli e micro RNA, utilizzare campioni di RNA con RIN ≥ 6.0.

6. Conta e vitalità delle cellule della frazione vascolare stromale

  1. Diluire 10 μL di sospensione cellulare SVF (sezione 2.24) in 90 μL di soluzione di blu di tripano allo 0,4% (diluizione finale 1:10) e applicare 10 μL a un emocitometro standard.
  2. Contare attentamente le cellule vitali, escluse le cellule morte, in quattro quadrati all'angolo della camera di conteggio.
  3. Determinare la concentrazione cellulare presente nella sospensione originale: Concentrazione cellulare = Conta cellulare totale/4 x fattore di diluizione (10) x 10.000 = Cellule/mL
  4. Per calcolare la resa cellulare (cellule per grammo di tessuto) ottenuta, moltiplicare la concentrazione cellulare per il volume totale del campione originale (in ml) e dividere per il peso del tessuto digerito (in grammi).
  5. Valutare la vitalità cellulare come percentuale di cellule viventi come segue: % Vitalità = (Numero di cellule vitali / Numero totale di cellule) x 100.

7. Caratterizzazione di sottogruppi di macrofagi da frazione vascolare stromale

  1. Trasferire un totale di 1 x 106 cellule SVF/mL in una provetta in polipropilene a fondo tondo da 5 mL per citometria a flusso e cellule a pellet mediante centrifugazione a 800 x g per 5 minuti a 4 °C.
  2. Vorticare con cautela per allentare il pellet e risospendere le celle in 100 μL di PBS 1x a RT.
  3. Aggiungere la concentrazione ottimale pretitolata di ciascun anticorpo monoclonale coniugato con fluorocromo specifico per un antigene di superficie cellulare; mescolare delicatamente e incubare per 15 minuti al buio a RT.
  4. Aggiungere un eccesso di PBS freddo (≈ 1 mL) e centrifugare l'SVF a 400 x g per 5 minuti a 4 °C.
  5. Scartare rapidamente i surnatanti per decantazione. Fare attenzione a non disturbare il pellet.
  6. Aggiungere 500 μL di soluzione lisante 1x e incubare per 15 minuti a RT, proteggendo i tubi dalla luce diretta.
  7. Rimuovere la soluzione dopo la centrifuga a 400 x g per 5 minuti a 4 °C e conservare a 2-8 °C al buio fino all'acquisizione dei dati.
  8. Vorticare accuratamente le cellule a bassa velocità per ridurre l'aggregazione prima di acquisire.
  9. Risospendere il pellet SVF in 5 mL di fluido della guaina a RT e successivamente filtrare attraverso tre strati di garza in una nuova provetta in polipropilene a fondo tondo da 5 mL prima dell'analisi mediante citometria a flusso, per ridurre l'intasamento delle linee di selezione delle cellule.
  10. Vorticare brevemente ogni tubo prima dell'analisi.
  11. Acquisire i dati dai campioni di interesse. Per l'analisi del flusso, contare un minimo di 10.000 eventi.
    NOTA: Se si utilizza un citometro a flusso per la selezione cellulare, separare i macrofagi per l'applicazione in studi successivi.

8. Strategia di gating

  1. Tracciare l'altezza o la larghezza rispetto all'area per la dispersione diretta (FSC) per determinare la popolazione di singoletto (Figura 2A).
  2. Selezionare le cellule tracciando l'area per la dispersione laterale (SSC) rispetto a FSC, scartando i detriti cellulari (Figura 2B).
  3. Dalle cellule selezionate, identificare le popolazioni che esprimono CD45 come cellule ematopoietiche (Figura 2C) e le cellule CD45/CD14 doppie positive come macrofagi (Figura 2D).
  4. Dai macrofagi CD45+/CD14+, rilevare le cellule HLA-DR negative e positive (Figura 2E).
    NOTA: Includere i controlli di compensazione per il pannello anticorpale e regolare la sovrapposizione spettrale su un citometro a flusso multicolore adeguato per il pannello. Eseguiamo analisi di citometria a flusso utilizzando un citometro dotato di tre laser (laser viola da 405 nm, laser blu da 488 nm e laser rosso da 640 nm) e rivelatori per i fluorocromi indicati.

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Risultati

Questo protocollo descrive un metodo enzimatico che utilizza la digestione della collagenasi seguita da centrifugazione differenziale per isolare, in un unico processo, adipociti maturi vitali e cellule SVF da biopsie VAT ottenute da donne in gravidanza sane dopo omentectomia parziale. In questo caso, utilizziamo gli adipociti per l'estrazione dell'RNA e la SVF per la fenotipizzazione dei macrofagi.

Il protocollo di estrazione dell'RNA ha permesso di ottenere RNA con un'elevata integrità, e RN...

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Discussione

L'IVA svolge un ruolo cruciale nella regolazione metabolica e nell'infiammazione. Il crescente interesse per il ruolo degli adipociti e delle cellule immunitarie nell'infiammazione cronica associata all'obesità ha portato allo sviluppo di diverse tecniche per separare la SVF e le cellule adipose presenti nell'AT. Tuttavia, la maggior parte delle tecniche non consente di ottenere questi due diversi set di cellule utilizzabili per applicazioni a valle dalla stessa biopsia VAT in un'unica procedura, il che potrebbe essere c...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato sostenuto dall'Instituto Nacional de Perinatologia (numeri di sovvenzione: 3300-11402-01-575-17 e 212250-3210-21002-06-15) e dal CONACyT, Fondo Sectorial de Investigación en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (numero di sovvenzione 2015-3-2-61661).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provette per PCR da 0,2 mLAxygenPCR-02-Cprive di RNasi, prive di DNasi e apirogene
AxygenMCT-150-Cprive di DNasi
CorningCLS4101-50EAAvvolte singolarmente in plastica
10 &; L puntale per pipetta universaleAxygenT-300-L-RRNasi, privo di DNasi e apirogeno
10 µ L puntale per pipetta universaleAxygenT-300-R-SRNasi, senza DNasi e apirogeno
1000 & micro; L puntale per pipetta universaleAxygenT-1000-B-RRNasi, senza DNasi e apirogeno
Provetta per microcentrifuga da 2,0 mLAxygenMCT-200-CRNasi, senza DNasi e apirogeno
200 µ L puntale per pipetta universaleAxygenT-200-Y-RRNasi, privo di DNasi e apirogeno
2100 Bioanalizzatore StrumentoAgilent
G2939BA-2101 Bioanalizzatore PCAgilentG2953CA2100 Expert Software preinstallato nel PC
Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mlCorning352003 Tappo a scatto, sterile
Provette da centrifuga da 50 mLCorningCLS430828-100EAPolipropilene, fondo conico e reagente sterile
a base di acido-guanidinio-fenoloReagente Zymo ResearchR2050-1-200TRI o
similare Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-Agilent
Small RNA KitAgilent5067-1548-APC
/Cy7 anticorpo CD14 umanoBioLegend3256200,4 mg/106 cellule, presenti su monociti/macrofagi, clone HCD14
Baker--250 ml, non sterile
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA3912-100GFrazione da shock termico, pH 5,2, ≥ 96%
Stazione di adescamento del chipAgilent5065-9951-Collagenasi
tipo IIGibco17101-015Polvere
D-(+)-GlucosioSigma-AldrichG8270-100GPolvere
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051Fornito con 50 mL TRI reagen
Pinze da dissezione-Acciaio, ganasce seghettate e rotonde estremità
Vassoio di dissezione-Acciaio inossidabile
Alcool etilicoSigma-AldrichE7023-500ML200  a prova, per biologia molecolare
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences
342003-FACS Lysing SolutionBD Biosciences
349202-FACSAria III Flow Cytometer/Cell SorterBD Biosciences
648282-FASCDiva SoftwareBD Biosciences642868Software v6.0 preinstallato
EmatocitometroSigmaZ359629-1EA-Contatore
di cellule manuale---
Forbice da dissezione Mayo--Microcentrifuga in acciaio inossidabile
--Spettrofotometro a nanogocce a temperatura regolabile
Thermo ScientificND2000LAPTOP-Agitatore
orbitale--Temperatura e velocità regolabili
P10  volume variabile  micropipetta Thermo Scientific-Finnpipette46420401 a 10 μ L
P1000  volume variabile  micropipetta Thermo Scientific-Finnpipette4642090da 100 a 1000 μ L
P2  volume variabile  micropipetta Thermo Scientific-Finnpipette46420100,2 a 2 μ L
P200  volume variabile  micropipetta Thermo Scientific-Finnpipette464208020 a 200 μ L
PCR rack di conservazione per provetteAxygenR96PCRFSP-PE
/Cy5 anti-umano HLA-DR AnticorpoBioLegend3076080,0625 mg/106 cellule, presente su macrofagi, clone L243
PE/Cy7 anti-umano CD45 AnticorpoBioLegend3040160,1 mg/106 cellule, presente su leucociti, clone H130
Soluzione salinatamponata con fosfatoSigma-AldrichP3813-10PAKPolvere, pH 7,4, per la preparazione di soluzioni da 1 L
Pipetta Controller---
Globuli rossi Lisi TamponeRoche11 814 389 001Per la lisi preferenziale dei globuli rossi da sangue intero umano
Centrifuga refrigerata--Adattatore per provette coniche da 50 mL
Contenitore sterile per campioni---
Pipetta di trasferimentoThermo Scientific-Samco204-1SSterile
Trypan BlueGibco15250-0610,4% Soluzione
Rack per provette--Per provette di diverse dimensioni
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-
Provette per microcentrifuga da 1,5 mL Pipette sierologiche da 10 mL ,

Riferimenti

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