Forniamo un protocollo dettagliato per l'allevamento, la microiniezione delle uova e per l'accoppiamento efficiente del firebrat Thermobia domestica per generare e mantenere ceppi mutanti dopo l'editing del genoma.
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Articolo metodologico
Microiniezione delle uova e accoppiamento efficiente per l'editing genomico nella Termbia domestica Firebrat
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il firebrat Thermobia domestica è una specie ametabolica e senza ali adatta allo studio dei meccanismi di sviluppo degli insetti che hanno portato alla loro riuscita radiazione evolutiva sulla terra. L'applicazione di strumenti genetici come l'editing del genoma è la chiave per comprendere i cambiamenti genetici che sono responsabili delle transizioni evolutive in un approccio Evo-Devo. In questo articolo, descriviamo il nostro attuale protocollo per la generazione e la manutenzione di ceppi mutanti di T. domestica. Riportiamo un metodo di iniezione secca, in alternativa al metodo di iniezione umida riportato, che ci consente di ottenere tassi di sopravvivenza stabilmente elevati negli embrioni iniettati. Reportiamo anche un ambiente ottimizzato per accoppiare gli adulti e ottenere le generazioni successive con alta efficienza. Il nostro metodo sottolinea l'importanza di tenere conto della biologia unica di ciascuna specie per il successo dell'applicazione dei metodi di modifica del genoma agli organismi modello non tradizionali. Prevediamo che questi protocolli di editing del genoma aiuteranno nell'implementazione di T. domestica come modello di laboratorio e accelereranno ulteriormente lo sviluppo e l'applicazione di strumenti genetici utili in questa specie.
Introduzione
Thermobia domestica appartiene a uno degli ordini di insetti più basali, Zygentoma, che conserva un ciclo di vita ancestrale ametabolico e senza ali. Tale posizione filogenetica basale e caratteristiche ancestrali hanno fissato questa specie come un modello attraente per studiare i meccanismi alla base del successo degli insetti sulla Terra, che coprono oltre il 70% della specie animaledescritta 1. T. domestica è stato a lungo utilizzato principalmente per studiare le caratteristiche ancestrali della fisiologia degli insetti a causa delle sue caratteristiche adatte come modello di laboratorio, come un ciclo di vita relativamen....
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Protocollo
1. Mantenimento delle colonie di laboratorio
- Per il mantenimento di popolazioni di wildtype e mutanti, utilizzare un grande contenitore di plastica (460 mm x 360 mm x 170 mm) con cibo di pesce artificiale regolare, acqua in tazze di plastica con un foro di ventilazione sulla parte superiore, una carta piegata per nascondere gli insetti e cotone stratificato per la deposizione delle uova(Figura 2A). Mantenere tutte le colture T. domestica all'interno di incubatori a 37 °C e impostare l'umidità relativa (RH) all'interno di ciascun contenitore sul 60%-80%.
NOTA: Poiché T. domestica assorbe il vapore acqueo dall....
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Risultati
Nelle nostre mani, circa 100 uova possono essere ben iniettate con un singolo capillare di iniezione quando ha la punta adeguata(Figura 3C). L'iniezione di gRNA/Cas9 complesso di ribonucleoproteina negli embrioni entro le prime 8 ore dopo la deposizione delle uova provoca indeli nel sito mirato al gRNA. Ciò causa mutazioni bialleliche in alcune cellule della generazione iniettata (G0) e quindi i fenotipi di mosaico mutante sono solitamente ottenuti in G0. Ad esempio, quando questo protocollo.......
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Discussione
Per la generazione di successo del mutante T. domestica desiderato con CRISPR / Cas9, è prima importante raccogliere un numero sufficiente di embrioni messi in scena per l'iniezione. Per una raccolta costante di un numero sufficiente di uova T. domestica, la chiave è selezionare una dimensione appropriata del contenitore per avere una densità di popolazione inferiore perché aiuterebbe il completamento di una serie di complessi comportamenti di accoppiamento, che viene ripetuto dopo ogni muta adulta
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
TO e TD sono stati supportati rispettivamente dai numeri di sovvenzione JSPS KAKENHI 19H02970 e 20H02999.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra a 24 pozzetti | Corning | 83-3738 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nucleasi V3, 100 &; g | Detergente antistatico integrato DNA Technologies | ||
| Hozan | Z-292 | per la rimozione dell'elettricità statica da una piastra a 24 pozzetti | |
| Barrier Box 20.7L | AS ONE | 4-5606-01 | Contenitore grande |
| FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000013 | Microiniettore elettronico |
| Femtotip II, capillare di iniezione | Eppendorf | 5242957000 | Capillare per iniezione di vetro |
| High Pack 2440mL | AS ONE | 5-068-25 | Incubatore per contenitori di medie dimensioni |
| Panasonic | MIR-554-PJ | per 37 ° C incubazione. Non c'è bisogno di umidificare all'interno dell'incubatrice. | |
| KOD Fx Neo | Toyobo | KFX-101 | Enzima PCR per la genotipizzazione. Ottimizzato per un'amplificazione da modelli grezzi. |
| Supporto magnetico | Narishige | GJ-8 | per contenere il micromanipolatore |
| Microloader | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micromanipolatore | Narishige | MM-3 | |
| Microscopio | Olympus | SZX12 | per microiniezione. Un ingrandimento superiore a 35X è sufficiente per la microiniezione |
| MultiNA | Shimadzu | MCE-202 | Sistema di elettroforesi a microchip |
| NiceTac | Nichiban | NW-5 | Nastro biadesivo per posizionare le uova su un vetrino |
| Pennello (crine di cavallo) | Pentel | ZBS1-0 | |
| Piatto per coltura vegetale | SPL Life Sciences | 310100 | Piatto di accoppiamento e forniture d'acqua per contenitori di grandi e medie dimensioni |
| Proteinasi K, ricombinante, grado PCR Liofilizzato da Pichia pastoris | Roche | 3115836001 | |
| Microscopio SZX 12 | Olympus | SZX 12 | ingrandimento superiore a 35X è sufficiente per la microiniezione |
| Talco | Maruishi | 877113 | |
| Tetra Goldfish Gold | Growth Spectrum Brands | Mangime artificiale regolare per pesci |
Riferimenti
- Species 2000, ITIS Catalogue of Life, 2019 Annual Checklist. Roskov, Y., et al. , Available from: http://www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2019 (2019).
- Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadić, A., Kaufman, T. C. The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashi....
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Ristampe e permessi
