Qui descriviamo l'acquisizione ottica e la caratterizzazione di potenziali d'azione da cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un sistema di fotometria modulare ad alta velocità.
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Articolo metodologico
Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le tecniche convenzionali di microelettrodi intracellulari per quantificare l'elettrofisiologia dei cardiomiociti sono estremamente complesse, ad alta intensità di lavoro e tipicamente eseguite a bassa produttività. La rapida e continua espansione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) presenta un nuovo standard nella ricerca cardiovascolare e sono ora necessari metodi alternativi per aumentare la produttività dei dati elettrofisiologici a livello di singola cellula. VF2.1Cl è un colorante sensibile alla tensione di recente derivazione che fornisce una rapida risposta a canale singolo e di alta grandezza alle fluttuazioni del potenziale di membrana. Possiede una cinetica superiore a quella di altri indicatori di tensione esistenti e rende disponibili dati funzionali equivalenti a quelli delle tecniche tradizionali di microelettrodo. Qui, dimostriamo la caratterizzazione semplificata e non invasiva del potenziale d'azione nei cardiomiociti umani derivati da iPSC a ritmo esterno utilizzando un sistema di fotometria modulare e altamente conveniente.
Introduzione
La modellazione elettrofisiologica dei cardiomiociti e la costruzione di piattaforme efficienti per lo screening dei farmaci cardiaci è essenziale per lo sviluppo di strategie terapeutiche per una varietà di disturbi aritmici. La rapida espansione della tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ha prodotto promettenti incursioni nella modellizzazione delle malattie umane e nell'indagine farmacologica utilizzando cardiomiociti derivati da pazienti isolati (iPSC-CM). Le tecniche "Gold standard" per la caratterizzazione elettrofisiologica di queste cellule attraverso patch-clamp (current-clamp) possono quantificare la morfologia e la durata del poten....
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Protocollo
1. Preparati cellulari
NOTA: Le iPSC umane utilizzate in questo protocollo sono state derivate da donatori sani e differenziate in monostrati utilizzando la modulazione di piccole molecole completamente definita delle tecniche di segnalazione WNT e di purificazione del lattato come precedentemente descritto12,13,14. I CM iPSC sono stati mantenuti ogni 2-3 giorni con un terreno di coltura descritto di seguito.
- Preparare un terreno di coltura di mezzo basale (RPMI 1640) e un supplemento al 2% (B27). Conservare a 4 °C. Utilizzare a temperat....
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Risultati
Figura 3: Profili del potenziale d'azione ottico (AP) di cardiomiociti nativi isolati e cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC-CM). (A) AP ottico rappresentativo di un singolo cardiomiocita murino (al centro) con SEM ± media di APD50 e APD90 (n = 7, destra). (B) AP ottico rappresentativo di u.......
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Discussione
Qui descriviamo un protocollo di base per acquisire facilmente profili AP dettagliati da iPSC-CM isolati adatti per la modellazione elettrofisiologica e lo screening di farmaci cardiaci. Rileviamo AP regolari e robusti dai nostri iPSC-CM scarsamente seminati, il che suggerisce sia la funzionalità dell'indicatore che la fedeltà metodologica.
A causa dell'ampio spettro di metodologie commerciali per la riprogrammazione iPSC e della mancanza di standardizzazione per i protocolli di differenziazio.......
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Dichiarazioni
Cairn Research Ltd ha supportato questa pubblicazione coprendo i costi di produzione del file video.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare Cairn Research Ltd. per il loro gentile contributo finanziario che ha coperto i costi di produzione di questa pubblicazione. Inoltre, ringraziamo la signora Ines Mueller e la signora Stefanie Kestel per il loro eccellente supporto tecnico.
La ricerca degli autori è sostenuta dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 e nell'ambito della strategia di eccellenza della Germania - EXC 2067/1- 390729940) e dalla Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| 0,25 Tripsina EDTA | Gibco | ||
| Integratore B27 | Gibco | ||
| CaCl2 | Carl Roth | HN04.2 | |
| D(+)-Glucosio anidro BioChemica | ITW Reagenti | A1422 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10270-106 | |
| Kit potenziale a membrana FluoVolt | Invitrogen | F10488 | |
| HEPES | Carl Roth | HN77.4 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 6781.1 | |
| Lamanin | Sigma-Aldrich | 114956-81-9 | |
| Matrigel | BD | 354230 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 9265.2 | |
| Nifedipina | Sigma-Aldrich | 21829-25-4 | |
| Penicillina/Streptomicina | Invitrogen | 15140 | |
| Inibitore ROCK Y27632 | Stemolecola | 04-0012-10 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | ||
| Versene EDTA | Gibco | 15040033 | |
| Attrezzatura | |||
| 495LP Dicroic Beamsplitter | Amplificatore Chroma Technology | ||
| Axopatch 200B | Molecular Devices | ||
| Coprioggetti Circle, Spessore 0 | Thermo Scientific | CB00100RA020MNT0 | |
| Digidata 1550B | Molecular Devices Alimentatore | ||
| Dual OptoLED | Ricerca su Cairn | ||
| Filtro di eccitazione ET470/40x | Tecnologia | ||
| ET535/50M | Tecnologia Chroma | ||
| Emocitometro Neubauer inciso | Hausser Scientific | ||
| Cubi filtranti | Ricerca su Cairn | ||
| IX73 Microscopio invertito | Olimpo | ||
| MonoLED Cairn Research | |||
| Adattatori multiporta | Ricerca su Cairn | ||
| Stimolatore cellulare Myopacer | Otturatore IonOptix | ||
| Optomask | Ricerca su Cairn | ||
| Controller di sistema Optoscan | Cairn Research | ||
| Piattaforma a temperatura controllata PH-1 | Strumenti Warner | ||
| Rivelatore fotomoltiplicatore | Ricerca su Cairn | ||
| Inserto amplificatore PMT | Cairn Research | ||
| Inserto di alimentazione PMT | Cairn Research | ||
| Camera da bagno aperta RC-26G | Strumenti Warner | ||
| Adattatore da palco SA-OLY/2AL | Olimpo | ||
| T565LPXR Beamsplitter dicroico | Chroma Technology | ||
| T660LPXR Beamsplitter dicroico | canale Chroma Technology | ||
| TC-20 | npi Electronic | ||
| UPLFLN 40X Obiettivo | Olimpo | ||
| Telecamera USB 3.0 a colori | di imaging | ||
| Software | |||
| Clampex 11.1 | Molecular Devices | ||
| Clampfit 11.1 | Dispositivi molecolari | ||
| Cattura IC 2.4 | Fonte di imaging | ||
| Prisma 8 | Graphpad |
Riferimenti
- Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
- Liang, P., et al.
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Ristampe e permessi
