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Articolo metodologico

Raccolta di campioni e analisi del microbioma duodenale

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DOI:

10.3791/61900

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12 gennaio 2021

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1Division of Gastroenterology, Hepatology and Parenteral Nutrition, Veterans Administration Greater Los Angeles Healthcare System, 2The Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California, 3UCLA Microbiome Center, David Geffen School of Medicine at University of California, 4Department of Surgery, University of California, Los Angeles, 5Department of Medicine and Human Genetics, David Geffen School of Medicine at University of California, 6Cedars-Sinai Cancer and Department of Medicine, Cedars-Sinai Medical Center

In questo articolo

Sommario

In questo manoscritto, discutiamo un nuovo metodo per campionare e analizzare il microbioma duodenale. Questo metodo fornisce una rappresentazione accurata della diversità e della composizione microbica nel duodeno e potrebbe essere utile per ulteriori indagini sul microbioma duodenale.

Abstract

I cambiamenti nel microbioma sono stati correlati con la fisiologia e la fisiopatologia di molti sistemi di organi, sia nell'uomo che nei modelli murini. Il microbioma intestinale è stato tipicamente studiato attraverso raccolte di campioni fecali. La facilità di ottenere campioni fecali ha portato a molti studi che hanno rivelato informazioni riguardanti il tratto gastrointestinale luminale distale. Tuttavia, pochi studi hanno affrontato l'importanza del microbioma nell'intestino prossimale. Dato che il duodeno è un sito importante per la digestione e l'assorbimento, il suo microbioma è rilevante per la nutrizione e le malattie del fegato e merita ulteriori indagini. Qui descriviamo in dettaglio un nuovo metodo per il campionamento del microbioma intestinale luminale prossimale e della mucosa in soggetti umani sottoposti a endoscopia superiore mediante l'ottenimento di aspirato duodenale e biopsie. L'approvvigionamento dei campioni è facile e non è influenzato da artefatti come l'aderenza preparatoria del paziente, come potrebbe essere il caso per ottenere campioni di colon durante la colonscopia. I risultati preliminari mostrano che i microbiomi luminale e mucoso differiscono in modo significativo, il che è probabilmente correlato alle condizioni ambientali e alle funzioni di barriera. Pertanto, una combinazione di aspirato duodenale e biopsie rivela un quadro più completo del microbioma nel duodeno. Le biopsie si ottengono dai segmenti discendenti e orizzontali del duodeno, che sono anatomicamente vicini al fegato e all'albero biliare. Questo è importante per studiare il ruolo della biologia degli acidi biliari e dell'asse intestino-fegato nella malattia epatica. Le biopsie e l'aspirato possono essere utilizzati per il sequenziamento dell'RNA ribosomiale 16S, la metabolomica e altre applicazioni simili.

Introduzione

Il microbioma intestinale è diventato un'area di crescente interesse negli ultimi anni. È ormai noto che la variegata popolazione batterica nell'intestino può differire in base a una varietà di fattori, tra cui la genetica, la dieta, i farmaci e le influenze ambientali1. Gli studi hanno anche identificato profili microbici unici legati a diverse malattie gastrointestinali, come l'obesità, le malattie infiammatorie intestinali e le malattie del fegato 2,3. La maggior parte degli studi si concentra sulla profilazione del microbioma dell'intestino crasso attraverso l'analisi di campioni di mucosa fecale e distale4. Sebbene la più alta concentrazione di batteri intestinali risieda nel colon (1012 batteri/grammo), esiste comunque una complessa comunità di microbi che risiede nel duodeno (103/g), nel digiuno (104/g) e nell'ileo (107/g) che svolge un ruolo chiave nel metabolismo e nell'assorbimento digestivo5.

L'intestino tenue funge da sito principale di scomposizione e assorbimento dei nutrienti nel tratto gastrointestinale. I batteri commensali che rivestono l'intestino tenue svolgono un ruolo fondamentale nell'aiutare la degradazione chimica dei substrati alimentari e nel rilascio di composti bioattivi che aiutano l'assorbimento dei nutrienti6. Queste interazioni contribuiscono a creare un ambiente complesso di attività microbico-microbico e ospite-microbo nell'intestino tenue7. Uno studio che ha osservato il microbiota dell'intestino tenue in modelli murini ha rilevato che i topi privi di germi alimentati con una dieta ricca di grassi avevano un assorbimento lipidico compromesso ma, quando colonizzati con microbiota digiunale, avevano un aumento diretto dell'assorbimento dei lipidi6. Uno studio pilota sull'uomo che ha profilato il microbiota duodenale di individui obesi e sani ha scoperto che il microbiota duodenale di individui obesi presentava alterazioni nelle vie di degradazione degli acidi grassi e del saccarosio, probabilmente indotte in una relazione dieto-dipendente8. Inoltre, la disbiosi nel microbiota dell'intestino tenue è stata identificata in diverse malattie, tra cui la proliferazione batterica dell'intestino tenue, la sindrome dell'intestino corto, la pouchite, la disfunzione enterica ambientale e la sindrome dell'intestino irritabile7.

Siamo interessati alla relazione tra il microbioma e i diversi stadi della malattia epatica cronica. In particolare, il duodeno funge da primo sito di degradazione chimica e assorbimento nutrizionale nell'intestino tenue. Inoltre, la circolazione epatica portale porta nutrienti e metaboliti al fegato, dove vengono elaborati e regolati nel flusso sanguigno. La vicinanza anatomica tra l'intestino e il fegato crea un ambiente suscettibile alle risposte pro-infiammatorie che possono insorgere a causa di un fallimento della barriera intestinale o di alterazioni del microbioma intestinale9. Gli studi che indagano il microbioma e la progressione della malattia epatica hanno identificato la disbiosi microbica in pazienti con steatosi epatica non alcolica (NAFLD), steatoepatite (NASH), epatopatia alcolica e cirrosi10,11. Mentre la maggior parte degli studi caratterizza il microbioma del colon, eravamo interessati a studiare il microbioma dell'intestino tenue in relazione alla malattia epatica. Utilizzando il nuovo metodo qui presentato, abbiamo identificato profili microbici duodenali unici in pazienti con cirrosi epatica in relazione alla dieta12.

Poiché la caratterizzazione del microbioma dell'intestino tenue continua a diventare un'area di crescente interesse, è necessario sviluppare tecniche uniformi per ottenere campioni che rappresentino accuratamente il microbiota dell'intestino tenue. Tuttavia, ci sono sfide associate all'approvvigionamento dei campioni che hanno complicato lo studio dell'ambiente del microbioma dell'intestino tenue. Gli attuali metodi di campionamento richiedono procedure invasive che sono spesso soggette a contaminazione, come delineato da Kastl et al7. Qui descriviamo in dettaglio un nuovo metodo per ottenere aspirato duodenale e biopsie per l'analisi microbica da pazienti con malattia epatica sottoposti a esofagogastroduodenoscopia.

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Protocollo

I campioni duodenali sono stati ottenuti presso il Veteran Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, il Cedars-Sinai Medical Center e il Ronald Reagan UCLA Medical Center dopo che il protocollo clinico per lo studio Microbiome, Microbial Markers and Liver Disease (M3LD) è stato accettato dal comitato di revisione istituzionale del comitato di revisione etica locale. Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti partecipanti.

1. Consenso dei partecipanti

  1. Avvicinare i soggetti con una diagnosi di cirrosi epatica di qualsiasi eziologia con endoscopie programmate per lo screening delle varici o l'ipertensione portale per il reclutamento. Escludere i pazienti con carcinoma epatocellulare (HCC).
  2. Introduci lo studio, assicurati attentamente che i partecipanti comprendano e chiedi al partecipante se desidera partecipare allo studio. Compila un modulo di consenso informato se sono d'accordo.
  3. Assicurarsi che l'endoscopia sia eseguita da un medico adeguatamente formato e accreditato.

2. Raccolta dei campioni

  1. Anestetizzare il paziente con 50 mg di fentanil e 2 mg di midazolam. Aumentare il dosaggio secondo necessità fino a quando il paziente è moderatamente anestetizzato e può tollerare l'endoscopio.
  2. Inserire un endoscopio (ad es. Pentax EG29-i10) nell'esofago del paziente e procedere verso il piloro.
    NOTA: Le dimensioni dell'endoscopio variano in base alla fisiologia del paziente. Non utilizzare l'endoscopio per alcuna aspirazione prima della raccolta del campione per evitare di contaminare il canale dell'endoscopio con secrezioni gastriche o orofaringee.
  3. Procurarsi un vetrino da microscopio e smussare l'ago per siringa calibro 18 per prepararsi all'approvvigionamento del campione. Preparare un tampone sterile che verrà utilizzato per trasferire le biopsie dal vetrino del microscopio ai crioviali.
  4. Quando l'endoscopio arriva alla seconda porzione del duodeno distale all'ampolla di Vater, aspirare il fluido presente attraverso un catetere di aspirazione sterile monouso passato attraverso il canale di lavoro dell'endoscopio superiore e raccoglierlo in un contenitore monouso da 40 mL. Lavare fino a 30 mL di acqua sterile aggiuntiva con una siringa nel duodeno e aspirare il fluido in una trappola per campioni di fluido per raccogliere un totale di 15 mL.
  5. Rimuovere e tappare immediatamente il contenitore di aspirazione collegato al componente di aspirazione del catetere. Posizionare il contenitore in un thermos con ghiaccio e in una sacca per il trasporto dei campioni per il trasferimento al laboratorio di lavorazione.
  6. Inserire una pinza per biopsia monouso da 2,8 mm nella porta sul lato dell'endoscopio per rimuovere i campioni di tessuto per la ricerca. Esegui 2 passaggi casuali della pinza all'interno della seconda porzione del duodeno, raccogliendo due morsi di tessuto in ogni passaggio.
  7. Utilizzare un ago per siringa smussato calibro 18 per estrarre campioni di tessuto dalla pinza e sul vetrino del microscopio prima di trasferire i campioni in quattro crioviali vuoti separati da 2 ml. Avvitare saldamente i tappi.
  8. Inserire tutti e 4 i crioviali ben chiusi in un contenitore vuoto, come una tazza per l'urina, e creare un bagno, composto da 20 ml di etanolo e ghiaccio secco, per congelare rapidamente le biopsie.
  9. Posizionare i crioviali per biopsia in un contenitore isolato di polistirolo su un letto di ghiaccio secco e trasferire i campioni in un congelatore a -80 °C per la conservazione a lungo termine per preservare i campioni.

3. Lavorazione ad aspirazione

  1. Dopo la raccolta dei campioni biologici, trasferire immediatamente i campioni biologici a un laboratorio BSL2 o superiore per l'elaborazione.
  2. Capovolgere delicatamente il contenitore del liquido aspirato quattro volte, quindi aliquotare circa 1,5 mL di fluido in 2 mL di crioviali.
  3. Conservare i campioni a -80 °C fino a quando non è possibile eseguire l'analisi del lotto.

4. Somministrazione di questionari e raccolta di dati clinici

  1. Chiedi ai partecipanti di compilare questionari per ottenere informazioni su dieta, dati demografici, abitudini di fumo/alcol, condizioni mediche/farmaci e qualità della vita13.
  2. Esamina le cartelle cliniche per acquisire dati clinici, inclusi laboratori clinici, dati di imaging, farmaci e complicanze mediche.

5. Estrazione del DNA

  1. Eseguire l'estrazione del DNA immediatamente dopo aver rimosso le biopsie duodenali e aspirare dal deposito a -80 °C. Non sono necessari passaggi preparatori per estrarre il DNA dai campioni di biopsia duodenale.
  2. Eseguire l'estrazione e il sequenziamento del DNA per tutti i campioni nello stesso giorno per ridurre il rischio di un effetto batch nell'analisi. Impostare una libreria specifica per i campioni raccolti prima che i campioni possano essere sequenziati.
  3. Utilizzare un kit di micropreparazione del DNA per estrarre il DNA dai campioni di biopsia duodenale, secondo il protocollo14 del produttore.
  4. Aggiungere la quantità massima di campione secondo le linee guida del protocollo a una provetta di lisi contenente 750 μL di soluzione di lisi e un volume secco di 0,7 mL di perle di vetro da 2 mm.
  5. Fissare le provette di lisi in una frusta per microsfere con un portaprovette e far funzionare la frusta alla massima velocità per almeno cinque minuti. Il tempo varierà in base al battitore di cordoni e al campione da analizzare.
  6. Centrifugare le provette di lisi in una microcentrifuga a 10.000 x g per 1 minuto.
  7. Trasferire fino a 400 μl di surnatante attraverso una provetta di raccolta filtrata e centrifugare nuovamente a 8000 x g per 1 minuto.
  8. Aggiungere 1200 μl di tampone legante al filtrato in una provetta per microcentrifuga e mescolare accuratamente fino a ottenere un composto omogeneo.
  9. Trasferire 800 μl della miscela in una colonna di centrifuga e in una provvetta. Centrifugare a 10.000 x g per 1 min. Scartare il flusso.
  10. Posizionare la colonna di centrifuga su una nuova provetta da centrifuga con 400 μl di tampone di lavaggio del DNA e mescolare accuratamente fino a ottenere un composto omogeneo. Centrifugare a 10.000 x g per 1 min. Scartare il flusso.
  11. Ripetere il passaggio 5.10 due volte, con 700 μL e poi 200 μL di tampone di lavaggio DNA per lavaggio.
  12. Aggiungere 20 μl di tampone di eluizione alla colonna di centrifuga in una nuova provetta da centrifuga. Incubare per un minuto, quindi centrifugare a 10.000 x g per 1 minuto per eluire il DNA. Eliminare la colonna.
  13. Filtra nuovamente il DNA. Il DNA è ora pronto per l'amplificazione PCR.

6. Amplificazione del DNA

  1. Eseguire l'amplificazione PCR della regione V4 del gene dell'RNA ribosomiale 16S mediante il sequenziamento paired-end 250 × 2 su aMiSeq, HiSeq o NovaSeqsequencer 15.
  2. Creare una piastra di primer a 96 pozzetti. Creare una miscela master di 165 μl di ILHS_515f primer diretto conservato (100 mM di stock) e 2970 μl di acqua di biologia molecolare. Aggiungere 28,5 μl di questa miscela a ciascun pozzetto.
  3. Aggiungere 1,5 μl di primer inverso corrispondente dalla piastra a 96 pozzetti di primer unici IL_806r con codice a barre (stock da 100 μM). Questi codici a barre identificheranno campioni unici di pazienti.
  4. Creare una miscela master di acqua (23,1 μl x 3,3 x numero di campioni), tampone PCR (3 μl x 3,3 x numero di campioni), dNTP (0,6 μl x 3,3 x numero di campioni) e JumpStart Taq DNA polimerasi (0,3 μl x 3,3 x numero di campioni).
    NOTA: L'amplificazione del DNA 16S deve essere eseguita in triplice copia.
  5. Aggiungere 81 μl di miscela master a ciascun pozzetto della prima piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 6 μL di DNA e 3 mL di miscela di primer a ciascun pozzetto. Utilizzare una pipetta multicanale P200 per miscelare i pozzetti, quindi pipettare 30 μl nel pozzetto corrispondente di ciascuna delle altre due piastre PCR. Sigillare la piastra.
  6. Utilizzare le seguenti impostazioni del termociclatore: 94 °C x 3 min; 35 cicli: 94 °C x 45 s, 50 °C x 1 min, 72 °C x 1,5 min. Dopo 35 cicli: 72 °C x 10 min, 94 °C x 5 min, 4 °C a tempo indeterminato.

7. Pulizia e configurazione della libreria

  1. Utilizzare un kit di pulizia PCR o DNA per purificare i prodotti PCR. Eluire il DNA con 30 μL di acqua di grado PCR (trattata con DEPC).
  2. Utilizza uno spettrofotometro a spettro UV-visibile in grado di quantificare i campioni PCR.
  3. Apri il software dello spettrofotometro sul desktop del computer. Fare clic su Acido nucleico.
  4. Pulisci il porto con acqua distillata. Aggiungere 1 μL di 1x tampone PCR/acqua alla porta e calibrare.
  5. Inserire l'ID del campione e pipettare 1 μL di campione sulla porta.
  6. Chiudi la porta e premi Misura.
    NOTA: Evitare bolle d'aria quando si aggiungono campioni sulla porta.
  7. Pulire il campione con salviette da laboratorio e acqua distillata, quindi preparare il campione successivo. Registra i valori con ogni campione. Il computer dovrebbe anche salvare automaticamente.
  8. Combina 250 ng di ciascun prodotto PCR amplificato in 1 provetta. Questa è la libreria del DNA.
  9. Consegna la libreria, insieme alle letture 1 e 2 e ai primer di sequenziamento dell'indice, a un laboratorio di sequenziamento per il sequenziamento.
    NOTA: Se non è disponibile un laboratorio locale, è possibile utilizzare un laboratorio di sequenziamento commerciale per questa fase.

8. Formattazione dei dati

  1. I dati di sequenziazione forniscono risultati in file .fastq in avanti e indietro. Converti questi dati in una scheda tecnica e puliscili in modo che le informazioni possano essere analizzate per le applicazioni a valle.
  2. Aprire il software di programmazione R. Seguire le istruzioni e il codice elencati nel file di codifica supplementare per procedere attraverso la pipeline DADA2 e pulire i dati di sequenziamento del DNA16. Scarica il database di riferimento SILVA per l'assegnazione della tassonomia dopo che le sequenze sono state passate attraverso la pipeline17.
  3. In breve, caricare il pacchetto DADA2 in R. Definire un percorso in cui tutti i file .fastq vengono salvati nella stessa directory ed estrarre i file in R.
  4. Leggi i nomi dei file fastq e abbina gli elenchi dei file fastq avanti e indietro.
  5. Ispeziona la qualità delle letture in avanti e in retromarcia.
    NOTA: Le sequenze nucleotidiche possono essere troncate per mantenere sequenze di alta qualità.
  6. Filtra e taglia i file fastq. Utilizzare il metodo learnErrors per apprendere il modello di errore parametrico utilizzato da DADA2. Questo mostrerà i tassi di errore osservati e attesi per ogni possibile sostituzione nucleotidica (A → C, A → T, A → G, ecc.).
  7. Applicare l'algoritmo di inferenza del campione per determinare il numero di sequenze univoche in ogni campione e ispezionare ulteriormente l'oggetto di classe dada per arrivare al numero di vere varianti univoche per campione.
  8. Unisci le letture in avanti e indietro per ottenere sequenze complete e denoizzate.
  9. Costruisci una tabella ASV (amplicon sequence variant).
  10. Rimuovi le chimere dalla tabella ASV. Le sequenze chimeriche sono una singola sequenza risultante da due sequenze madri più abbondanti.
  11. Tenere traccia del numero totale di letture passate attraverso la pipeline. DADA2 utilizzerà SILVA per assegnare la tassonomia a ciascuna sequenza unica. L'accuratezza può essere analizzata includendo una comunità di sequenze batteriche note nella pipeline DADA2 e confrontando le varianti di sequenza DADA2 con la composizione attesa della comunità.
    NOTA: I dati di sequenziamento del DNA sono ora puliti e pronti per l'analisi in base all'ambito e agli obiettivi specifici del progetto di ricerca.

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Risultati

Differenze di popolazione tra microbioma mucoso e luminale dell'intestino prossimale
Studi precedenti hanno riscontrato differenze nelle popolazioni microbiche di campioni di colon luminale e mucoso 4,5,18. I risultati preliminari mostrano che i campioni di aspirato duodenale e biopsia possono misurare sia il microbiota luminale che quello mucoso nell'intestino prossimale. Inoltre, abbiamo scoperto che queste...

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Discussione

Gli studi sul microbioma sono incredibilmente importanti, poiché questo complesso ecosistema ha un ruolo fondamentale nell'omeostasi energetica, nelle risposte immunologiche e nel metabolismo19. Esistono differenze regionali nel microbioma che possono riflettere le distinte funzioni fisiologiche di varie regioni del tratto gastrointestinale, che possono influenzare diversi stati patologici20. Il microbioma fecale è il più comunemente studia...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse finanziari concorrenti da segnalare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dal National Institutes of Health/National Cancer Institute con il numero di sovvenzione RO1CA204145.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2 mL criovialiCorning430659
piastre a 96 pozzettiApplied Biosystems4306737
dNTPSigmaD7295
GhiaccioFornito dall'istituto
EG29-i10 endoscopioPentaxN/ALe dimensioni dell'endoscopio possono variare a seconda della fisiologia del paziente
Micropiastra dell'epoca spettrofotometroBiotekN/A
EthanolSigma Aldrich676829
HiSeq 2500IlluminaN/A
IL_806r primer inversoIDT Tecnologie DNAprimerpersonalizzati
personalizzati ILHS_515f primer in avantiTecnologie IDT DNAprimer personalizzati
JumpStart Taq DNASigmaD4184
Trappola per campioni di mucoBusse Hospital Monouso405Trappola per campioni da 40 cc con tappo di trasporto
Software Nanodrop Gen5ThermoFisher Scientific
Tampone PCRSigmaP2192
Kit di pulizia PCRZymo ResearchD4204
Mascella radiale 4 pinze JumboBoston ScientificM00513343Diametro esterno della ganascia di 2,8 mm
Questionario dieteticoVioscreen VioCareN/A
ZymoBIOMICS Kit di micropreparazione del DNAZymo ResearchD430025 ug capacità di legame
secco

Riferimenti

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Microbioma intestinaleAnalisi del microbiomaAspirato duodenaleBiopsia duodenaleEndoscopia superioreSequenziamento 16SMetabolomicaAsse intestino-fegato

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