Isolamento fecale (micro) RNA

L'RNA extracellulare viene riconosciuto come un fattore significativo che media molti processi biologici¹. L'RNA extracellulare nelle feci è stato segnalato per la prima volta nel 2008 come marker per il cancro del colon e la colite ulcerosa attiva², ed è stato recentemente rivelato come un componente normale del lume intestinale e delle feci e media le comunicazioni ospite-microbo ^3,4,5. Lo scopo di questo protocollo di isolamento dell'RNA è quello di estrarre RNA extracellulare di alta qualità da campioni fecali raccolti da soggetti animali e umani. Il protocollo è stato adattato da un kit commerciale di isolamento miRNA. L'RNA acquisito viene utilizzato per analisi a valle come il sequenziamento dell'RNA, RT-PCR e micro-array. Il protocollo include diversi suggerimenti importanti e utili per massimizzare la quantità e la qualità dell'RNA presente nelle feci di animali e umani. La ragione per sviluppare e ottimizzare questo metodo di isolamento dell'RNA (incluso il microRNA) è diminuire l'RNA microbico nelle feci, limitare le variabili negli studi di ricerca e analizzare la composizione dell'RNA nell'intestino senza tenere conto di vari fattori confondenti e fonti di contaminazione. Da notare, questo isolamento dell'RNA riduce al minimo il rilascio di RNA dalle cellule viventi e dai microbi viventi (RNA cellulare). Si concentra sugli RNA extracellulari che sono stati rilasciati dalle cellule intestinali o sono stati acquisiti attraverso l'assunzione di cibo. Principalmente, questo metodo non è adatto per studi in cui viene studiato il trascrittoma microbico.

Tutti i metodi che coinvolgono animali da ricerca qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School.

Tutti i metodi che coinvolgono soggetti di ricerca umana qui descritti sono conformi alle linee guida stabilite dal Comitato di ricerca umana dei partner.

1. Raccolta di campioni fecali

1. Autoclavare o preparare una provetta da microcentrifuga sterile e priva di nucleasi da 2 ml con tappo a vite per ciascun soggetto animale in un esperimento.
   1. Per i soggetti umani, fornire un dispositivo di raccolta dei campioni di feci appropriato, privo di nucleasi e sterile per ciascun soggetto.
2. Raccogliere 25-100 mg (circa 1-4 pellet fecali per campioni fecali di topo) di campioni fecali da ciascun soggetto animale in un ambiente sterile.
   NOTA: Due o più pellet fecali (~ 50 mg o più pesanti) sono preferiti per ottenere RNA della massima purezza.
   1. Utilizzare tutti i dispositivi di protezione individuale (DPI) e i materiali necessari, ad esempio: un paio di guanti da laboratorio, uno spray disinfettante e un tovagliolo di carta sterile, per sterilizzare l'area di lavoro, dove è posizionato il soggetto di ricerca animale, per evitare la contaminazione del campione fecale.
      1. Per i soggetti umani, istruire ogni soggetto di ricerca / collezionista a raccogliere 100-200 mg di campioni di feci in un ambiente il più sterile possibile. Utilizzare il funzionamento sterile standard ed evitare la contaminazione del campione di feci.
3. Raccogliere campioni fecali da ciascun soggetto animale direttamente in una provetta da microcentrifuga da 2 ml con un tappo a vite senza toccare altre superfici per evitare la contaminazione.
   1. Per i soggetti umani, istruire ciascun soggetto a defecare direttamente in un dispositivo di raccolta applicabile fornito (ad esempio, un kit di raccolta di campioni di feci sterili) per evitare la contaminazione.
      NOTA: Istruire il soggetto ad evitare la contaminazione da superfici della toilette, acqua, urina o altre superfici/oggetti non sterili.
4. Congelare immediatamente i campioni fecali raccolti in provette da microcentrifuga da 2 ml a -80 °C o metterli in un secchio di ghiaccio secco per una migliore quantità e qualità di RNA prima della risospensione delle feci, come descritto nei passaggi seguenti.
   1. Per i campioni di feci umane, aliquote ogni campione fresco di 200 mg in provette da microcentrifuga da 2 mL con tappi a vite e congelarle a -80 °C prima della risospensione delle feci come descritto di seguito.
      1. Per la conservazione di campioni di feci non in provette da microcentrifuga da 2 ml con tappi a vite, pesare e trasferire 100-200 mg ciascuno di campioni congelati in provette di microcentrifuga separate da 2 ml con tappi a vite prima della risospensione delle feci come descritto di seguito.
         NOTA: Per i campioni di feci umane, evitare di assumere più di 200 mg di campioni di feci per l'isolamento dell'RNA in quanto potrebbe causare difficoltà nei passaggi successivi. Con un campione sovraccarico in una provetta da microcentrifuga da 2 ml, la fase acquosa, la fase organica e l'interfase potrebbero non essere chiaramente formate e separate. La procedura può essere messa in pausa qui.

2. Preparazioni di soluzioni di lavaggio

1. Aggiungere 21 ml di etanolo al 100% di grado American Chemical Society (ACS) alla soluzione di lavaggio 1 fornita nel kit di isolamento miRNA (vedere Tabella dei materiali) per raggiungere il volume finale di 30 ml, come mostrato sul flacone. Vortice fino a quando tutto si dissolve nella bottiglia.
2. Aggiungere 40 ml di etanolo ACS grado 100% alla soluzione di lavaggio 2/3 fornita per raggiungere il volume finale di 50 ml, come indicato sul flacone. Vortice per 5 s o fino a quando la miscela finale è ben amalgamata.

3. Preparazione di attrezzature e materiali

1. Spruzzare l'area di lavoro e le attrezzature, ad esempio: il banco di laboratorio, l'area di lavoro nella cappa aspirante chimica e le rack dei tubi della microcentrifuga, con una soluzione di decontaminazione della ribonucleasi (RNasi) (ad esempio, soluzione di decontaminazione della RNasi disponibile in commercio). Per evitare la contaminazione, applicare con la soluzione di decontaminazione RNasi sulle superfici dove e quando ritenuto necessario.
2. Indossare un camice da laboratorio pulito, indossare una maschera facciale e indossare guanti da laboratorio appropriati per proteggere l'RNA nei campioni fecali dalle nucleasi presenti sulla pelle umana. Spruzzare i guanti con una soluzione di decontaminazione RNasi e cambiare frequentemente i guanti per evitare la contaminazione.
3. Preparare un secchio di ghiaccio secco per i campioni fecali conservati a -80 °C per evitare lo scongelamento prima della risospensione delle feci e un secchio di ghiaccio per i materiali, ad esempio: Acido-fenolo: cloroformio, per prolungare la durata di conservazione.
   NOTA: Assicurarsi che i materiali, inclusi i supporti utilizzati nel protocollo, siano sterili senza contaminazione delle nucleasi.

4. Risospensione delle feci

1. Risospendere 25-100 mg di campioni fecali in 600 μL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato 1x Dulbecco (DPBS).
   ATTENZIONE: I campioni fecali devono essere trattati immediatamente quando scongelati da -80 °C senza nemmeno uno scongelamento parziale per ridurre al minimo il rilascio di RNasi e RNA cellulare poiché i cristalli di ghiaccio rompono i compartimenti cellulari interni ed esterni quando le cellule nel campione si scongelano.
   1. Aggiungere 600 μL di 1x DPBS alla provetta da 2 mL di microcentrifuga con un tappo a vite contenente campioni fecali a temperatura ambiente (RT).
   2. Incubare la miscela di campioni fecali immersi in 600 μL di 1x DPBS nella provetta da microcentrifuga da 2 mL con tappo per 30 minuti a RT.
   3. Risospendere la miscela schiacciando con 1 mL di punta della pipetta e vortice bene con il tubo di microcentrifuga da 2 mL tappato. Per ottimizzare e aumentare la quantità e la qualità dell'RNA, risospendere la miscela con un omogeneizzatore con l'impostazione per un ciclo a S4000 (o 4000 rpm) e 45 s.

5. Estrazione organica

ATTENZIONE: Utilizzare la cappa aspirante chimica pericolosa per le seguenti fasi fino alla fase 6 con l'uso di acido-fenolo: cloroformio e etanolo ACS grado 100% a causa della loro tossicità e infiammabilità. Sostituire i DPI secondo necessità e seguire le precauzioni standard appropriate quando si tratta di materiali pericolosi.

1. Estrarre l'RNA con 600 μL di acido-fenolo: cloroformio (il volume di acido-fenolo: cloroformio richiesto è uguale al volume iniziale di 1x DPBS aggiunto nella fase 4.1).
   1. Aggiungere 600 μL di acido-fenolo: cloroformio alla sospensione del punto 4.1.
      NOTA: Prelevare acido-fenolo: cloroformio dalla fase inferiore del flacone mentre la fase superiore viene miscelata con un tampone acquoso. Se l'interfase tra queste due fasi è disturbata, attendere e prelevare acido-fenolo: cloroformio solo quando l'interfase si ristabilisce per evitare la contaminazione.
2. Vortice la miscela per 60 s per mescolare accuratamente. In alternativa, per ottimizzare e aumentare la quantità di RNA nella resa, mescolare utilizzando un omogeneizzatore con l'impostazione per un ciclo a S4000 e 45 s.
3. Centrifugare per 15 minuti a 10.000 x g a RT per separare le fasi acquosa e organica con una microcentrifuga. Dopo la centrifugazione, l'interfase dovrebbe essere compatta. In caso contrario, ripetere la centrifugazione.
   NOTA: Se l'interfase non poteva essere compatta come desiderato probabilmente a causa del rapporto irregolare tra il volume iniziale e il volume di acido-fenolo aggiunto: cloroformio dopo diverse ripetizioni di centrifugazione, procedere al recupero della fase acquosa con maggiore attenzione per evitare la contaminazione.
4. Recuperare la fase acquosa e trasferirla in una nuova provetta da microcentrifuga da 2 mL con tappo a cerniera (non fornita dal kit di isolamento miRNA).
   1. Rimuovere con attenzione la fase acquosa (o superiore) senza disturbare la fase inferiore e trasferirla in un nuovo tubo di microcentrifuga da 2 ml con tappo a cerniera. Notare il volume trasferito (ad esempio, ~500 μL).
      NOTA: Quando l'interfase è compatta e la fase superiore è chiaramente separata, ci sono probabilmente alcune minuscole particelle residue che galleggiano sulla parte superiore della fase acquosa. Pipettare con attenzione per evitare questi residui e recuperare solo la fase acquosa visibilmente e chiaramente separata per garantire una resa di RNA di qualità, anche se è possibile ottenere solo un piccolo volume della fase acquosa.

6. Isolamento finale dell'RNA

1. Aggiungere 1,25 volumi di etanolo al 100% di grado RT ACS alla fase acquosa nel tubo di microcentrifuga da 2 ml (ad esempio, aggiungere 625 μL di etanolo al 100% se si recuperano 500 μL di fase acquosa dal passaggio 5.4.). Vortice 3 s.
2. Caricare la fase acquosa/miscela di etanolo attraverso la cartuccia filtrante fornita nel kit di isolamento dei miRNA.
   1. Per ogni campione, posizionare la cartuccia filtrante in una delle provette di raccolta fornite dal kit.
      1. Pipettare e caricare 600 μL della fase acquosa/miscela di etanolo nella cartuccia del filtro.
         NOTA: Vortice brevemente la miscela per miscelare accuratamente l'etanolo con la fase acquosa prima del pipettaggio. Non possono essere caricati più di 700 μL della fase acquosa/miscela di etanolo alla volta.
   2. Centrifugare a 10.000 x g per 90 s per filtrare attraverso la miscela. La rotazione a una velocità maggiore potrebbe danneggiare il filtro.
   3. Eliminare il filtrato e ripetere i punti da 6.2.1 a 6.2.2 fino a filtrare tutta la miscela attraverso la stessa membrana filtrante in applicazioni successive. Conservare e riutilizzare lo stesso tubo di raccolta per i passaggi di lavaggio sottostanti.
   4. Lavare il filtro con 700 μL di miRNA Wash Solution 1.
      ATTENZIONE: miRNA Wash Solution 1 contiene guanidina tiocianato che può causare irritazione cutanea e gravi danni agli occhi. Indossare i DPI necessari, ad esempio: guanti, visiera, camice protettivo da laboratorio. Cambiare frequentemente i guanti se necessario.
      1. Applicare 700 μL di miRNA Wash Solution 1, la soluzione di lavoro preparata con etanolo ACS 100%, nella cartuccia del filtro.
      2. Centrifugare per 60 s per filtrare la miRNA Wash Solution 1 attraverso la cartuccia filtrante.
      3. Eliminare il filtrato dal tubo di raccolta e posizionare la stessa cartuccia filtrante nello stesso tubo di raccolta.
   5. Lavare il filtro con Wash Solution 2/3 una volta ciascuno con volumi di 700 μL, 500 μL e 250 μL consecutivi.
      1. Applicare 700 μL di Wash Solution 2/3, la soluzione di lavoro preparata con etanolo ACS 100%, nella cartuccia del filtro.
         1. Centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
         2. Eliminare il filtrato dal tubo di raccolta e posizionare la stessa cartuccia filtrante nello stesso tubo di raccolta.
      2. Applicare 500 μL di soluzione di lavaggio 2/3 nella cartuccia del filtro.
         1. Centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
         2. Eliminare il filtrato dal tubo di raccolta e posizionare la stessa cartuccia filtrante nello stesso tubo di raccolta.
      3. Applicare 250 μL di soluzione di lavaggio 2/3 nella cartuccia del filtro.
         1. Centrifugare a 10.000 x g per 1 min.
         2. Eliminare il filtrato dalla provetta di raccolta.
      4. Trasferire la cartuccia del filtro in un nuovo tubo di raccolta e ruotare il gruppo per 5 minuti per rimuovere il fluido residuo dal filtro.

7. Eluire l'RNA con 50 μL di acqua priva di nucleasi

1. Trasferire la cartuccia filtrante in un nuovo tubo di raccolta. Pipettare 50 μL di acqua priva di nucleasi al centro del filtro e tappare il tubo di raccolta.
   1. Incubare a RT per 10 min.
   2. Centrifugare per 5 minuti a 8.000 x g per recuperare l'RNA nella nuova provetta di raccolta.
   3. Determinare la concentrazione e la purezza dell'RNA fecale recuperato utilizzando un fluorometro. L'RNA fecale recuperato può essere conservato a -80 °C.

Gli RNA rappresentativi sono stati isolati rispettivamente da campioni fecali di topo da 50 mg (2 pellet fecali di topo) e campioni di feci umane da 100 mg ed eluiti in acqua priva di nucleasi da 50 μL. L'analisi spettrofotometrica della concentrazione suggerisce che una quantità totale di 49 μg e 16 μg di RNA sono stati isolati rispettivamente (Tabella 1). La purezza dell'RNA era elevata, come indicato da un rapporto A260/A280 di ~2,0 e un rapporto A260/A230 di ~1,8 (Tabella 1). Come riportato3, la maggior parte degli RNA nelle feci sono microRNA e quei microRNA possono esistere nell'esosoma. Coerentemente con questo, un test di elettroforesi basato su chip dell'RNA suggerisce che gli isolati rappresentativi di RNA dalle feci di topo e umane sono bassi o privi di composizioni di rRNA 18S e 28S e la dimensione degli isolati di RNA cade nella piccola regione dell'RNA (Figura 1A). Un'ulteriore piccola elettroforesi dell'RNA con l'elettroforesi basata su chip rivela che gran parte degli RNA sono di dimensioni microRNA (Figura 1B). Ciò è coerente con l'osservazione che la quantificazione completata utilizzando un piccolo bioanalizzatore di RNA è paragonabile a quella ottenuta con i saggi precedenti6.

Tabella 1: Analisi rappresentativa di nanodrop dell'RNA isolato con questo protocollo. Gli RNA rappresentativi sono stati isolati da 2 pellet fecali di topo o campioni di feci umane da 100 mg, eluiti in 50 μL di acqua priva di nucleasi. La concentrazione di RNA, il rapporto di A260/A280 e il rapporto di A260/A230 sono stati misurati con nanodrop.

Figura 1: Analisi rappresentative dell'elettroforesi basata su chip della distribuzione dimensionale degli isolati di RNA fecale. (A) RNA rappresentativi isolati da 2 pellet fecali di topo (pannello di sinistra) e 100 mg di feci umane (pannello di destra) utilizzando il protocollo qui descritto sono stati caratterizzati utilizzando il test di elettroforesi basato su chip. Questo test suggerisce che la maggior parte degli isolati di RNA erano piccoli RNA. (B) Gli isolati sono stati quindi sottoposti all'elettroforesi di piccolo RNA con il sistema di elettroforesi basato su chip per analizzare la distribuzione dimensionale degli isolati. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non dichiarano interessi finanziari rilevanti o materiali correlati al metodo di ricerca descritto in questo documento protocollare.