È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Profilazione del repertorio recettore-ligando delle cellule natural killer umane

2.8K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/61912

⸱

19 novembre 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 2Program in Immunology, Stanford University School of Medicine, 3Chan-Zuckerberg BioHub

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui progettiamo due pannelli di citometria di massa complementare (CyTOF) e ottimizziamo un protocollo di colorazione CyTOF con l'obiettivo di profilare il recettore delle cellule natural killer e il repertorio di ligandi nel contesto delle infezioni virali.

Abstract

Le cellule natural killer (NK) sono tra i primi a rispondere alle infezioni virali. La capacità delle cellule NK di riconoscere e uccidere rapidamente le cellule infettate da virus è regolata dalla loro espressione di recettori inibitori e attivanti codificati dalla linea germinale. L'impegno di questi recettori da parte dei loro ligandi affini sulle cellule bersaglio determina se l'interazione intercellulare provocherà l'uccisione delle cellule NK. Questo protocollo descrive in dettaglio la progettazione e l'ottimizzazione di due pannelli di citometria di massa complementare (CyTOF). Un pannello è stato progettato per fenotipizzare le cellule NK in base all'espressione del recettore. L'altro pannello è stato progettato per interrogare l'espressione di ligandi noti per i recettori delle cellule NK su diversi sottogruppi di cellule immunitarie. Insieme, questi due pannelli consentono la profilazione del repertorio recettore-ligando delle cellule NK umane. Inoltre, questo protocollo descrive anche il processo con cui coloriamo i campioni per CyTOF. Questo processo è stato ottimizzato per migliorare la riproducibilità e la standardizzazione. Un vantaggio di CyTOF è la sua capacità di misurare oltre 40 marcatori in ciascun pannello, con una sovrapposizione minima del segnale, consentendo ai ricercatori di catturare l'ampiezza del repertorio recettore-ligando delle cellule NK. Il codice a barre al palladio riduce anche la variazione tra i campioni, nonché il consumo di reagenti, facilitando la colorazione dei campioni con ciascun pannello in parallelo. I limiti di questo protocollo includono la produttività relativamente bassa di CyTOF e l'incapacità di recuperare le cellule dopo l'analisi. Questi pannelli sono stati progettati per l'analisi di campioni clinici di pazienti affetti da infezioni virali acute e croniche, tra cui il virus della dengue, il virus dell'immunodeficienza umana (HIV) e l'influenza. Tuttavia, possono essere utilizzati in qualsiasi contesto per studiare il repertorio recettore-ligando delle cellule NK umane. È importante sottolineare che questi metodi possono essere applicati ampiamente alla progettazione e all'esecuzione dei futuri pannelli CyTOF.

Introduzione

Le cellule natural killer (NK) sono cellule immunitarie innate il cui ruolo principale è quello di colpire e uccidere le cellule maligne, infette o altrimenti stressate. Attraverso la loro secrezione di citochine come IFNγ e TNFα, nonché la loro attività citotossica, le cellule NK possono anche modellare la risposta immunitaria adattativa a patogeni e neoplasie. La risposta NK è mediata in parte dalla segnalazione combinatoria di recettori inibitori e attivanti codificati dalla linea germinale, che legano una miriade di ligandi espressi su potenziali cellule bersaglio. Diversi recettori delle cellule NK hanno più di un ligando e nuove coppie recettore-ligando vengono identificate regolarmente.

C'è un particolare interesse nello studio delle cellule NK nel contesto delle infezioni virali, dove la loro capacità di rispondere rapidamente alle cellule stressate può limitare la diffusione virale o promuovere lo sviluppo di strategie di evasione delle cellule NK. Questo interesse per la biologia delle cellule NK si estende al campo dell'immunoterapia del cancro, dove i ricercatori stanno studiando il ruolo delle cellule NK nell'immunosorveglianza tumorale e nel microambiente tumorale1. Tuttavia, la capacità di profilare le interazioni cellula NK-cellula bersaglio è complicata dal fatto che le cellule NK umane possono esprimere oltre 30 recettori che a loro volta possono interagire con oltre 30 ligandi noti2. La rilevazione simultanea di più recettori delle cellule NK e dei loro ligandi affini è, quindi, necessaria per catturare la complessità delle interazioni recettore-ligando che controllano la funzione NK. Di conseguenza, ci siamo rivolti alla citometria di massa (CyTOF), che consente il rilevamento simultaneo di oltre 40 marcatori a livello di singola cellula. Il nostro obiettivo era quello di creare due pannelli CyTOF per profilare il repertorio recettore-ligando delle cellule NK. Volevamo anche progettare un protocollo per l'elaborazione e la colorazione efficaci dei campioni clinici. I campioni clinici umani forniscono una grande quantità di informazioni su come il corpo risponde all'infezione virale. Pertanto, abbiamo sviluppato questo protocollo per studiare l'espressione dei recettori delle cellule NK e dei loro ligandi affini in parallelo per una migliore standardizzazione, un migliore recupero, un consumo ridotto di reagenti e limitati effetti batch.

Diversi pannelli di citometria a flusso progettati per caratterizzare il fenotipo delle cellule NK umane sono stati pubblicati in precedenza 3,4,5,6,7,8. La maggior parte di questi pannelli ha una capacità limitata di catturare l'ampiezza del repertorio recettore-ligando, consentendo solo il rilevamento di una selezione limitata di marcatori. Inoltre, questi pannelli sono limitati dalla sovrapposizione del segnale tra i fluorocromi. CyTOF utilizza anticorpi coniugati a isotopi metallici, che vengono letti mediante spettrometria di massa a tempo di volo, riducendo così drasticamente lo spillover tra i canali.

Come noi, altri ricercatori si sono rivolti a CyTOF per studiare le cellule NK 9,10,11,12,13,14, anche se generalmente con meno marcatori di cellule NK, il che riduce la profondità della fenotipizzazione. Sebbene i protocolli di colorazione generali utilizzati da questi gruppi siano simili ai nostri, ci sono alcune differenze fondamentali. Altri protocolli non prevedono l'isolamento delle cellule NK prima della colorazione, anche se i ricercatori sono interessati solo a quel sottogruppo13,14. Dato che le cellule NK costituiscono solo il 5-20% delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC), colorare intere PBMC piuttosto che cellule NK isolate significa che la maggior parte degli eventi raccolti non saranno cellule NK. Ciò riduce la quantità di dati generati nel sottoinsieme di interesse e si traduce in un uso inefficiente del tempo macchina. Inoltre, mentre molti di questi pannelli interrogano l'espressione dei recettori delle cellule NK come i recettori killer Ig-like (KIR), NKG2A/C/D e i recettori naturali di citotossicità (NKp30, NKp44 e NKp46), l'espressione di questi marcatori non è inserita in un contesto più ampio a causa dell'assenza di dati sull'espressione dei rispettivi ligandi. Di conseguenza, mentre questi metodi precedentemente pubblicati per studiare le cellule NK tramite CyTOF sono sufficienti per la fenotipizzazione delle cellule NK su larga scala, utilizzati in isolamento, non possono fornire un quadro completo dell'attività delle cellule NK. Questo ci porta al principale vantaggio dei metodi qui descritti, ovvero che fino a questo punto non esistono citometria a flusso pubblicati o pannelli CyTOF incentrati sull'esplorazione dell'espressione di ligandi per i recettori delle cellule NK. È importante sottolineare che il nostro pannello di ligandi ha diversi canali aperti per consentire l'aggiunta di marcatori per soddisfare le esigenze uniche di ogni esperimento.

Considerando che uno dei principali limiti di CyTOF è l'impossibilità di recuperare il campione dopo l'analisi, questo metodo potrebbe non essere appropriato per i ricercatori che hanno campioni limitati con i quali sono interessati a eseguire ulteriori esperimenti. Inoltre, la natura a basso rendimento di CyTOF significa che i dati generati saranno di scarsa qualità se il numero iniziale di cellule è basso. Escludendo queste due limitazioni, questo metodo funzionerà bene in qualsiasi contesto per studiare le interazioni recettore-ligando tra le cellule NK e le cellule bersaglio.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Le PBMC adulte sane anonime sono state ottenute da camere del sistema di leucoriduzione acquistate dallo Stanford Blood Center. Le PBMC da donatori pediatrici sani anonimizzati e pazienti pediatrici con dengue acuta sono state ottenute dal Gorgas Memorial Institute of Health Studies di Panama City, Panama e dagli ospedali appartenenti al Ministero della Salute, al sistema di sicurezza sociale di Panama City e alle aree suburbane. Il protocollo di studio sulla dengue è stato approvato dall'IRB dell'Hospital del Niño (CBIHN-M-0634), quindi approvato dai comitati di ICGES, CSS, Santo Tomas Hospital e Stanford University. Le PBMC di pazienti con infezione da HIV in trattamento antiretrovirale sono state ottenute dallo studio ACTG A5321.

1. Marcatura degli anticorpi, preparazione del pannello e conservazione

  1. Marcatura di anticorpi con isotopi metallici
    NOTA: Per aumentare la standardizzazione intersperimentale della colorazione, si consiglia di eseguire più coniugazioni per ciascun anticorpo e quindi combinare i prodotti in un'unica miscela master per la conservazione a lungo termine come descritto di seguito.
    1. Determinare la concentrazione di ciascun anticorpo misurando l'assorbanza a 280 nm prima della coniugazione. Gli anticorpi utilizzati per questo protocollo sono disponibili in commercio e sono stati acquistati dai fornitori elencati nella Tabella dei materiali.
    2. Marcare gli anticorpi con isotopi metallici utilizzando i kit di marcatura degli anticorpi disponibili in commercio secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare 100 μg di anticorpi per ogni reazione.
    3. Determinare la concentrazione finale dell'anticorpo recuperato misurando l'assorbanza a 280 nm. Conservare gli anticorpi per un breve periodo a 4 °C.
  2. Titolazioni di anticorpi
    NOTA: La tecnologia CyTOF è molto sensibile ai potenziali segnali di contaminazione provenienti dai metalli ambientali. Pertanto, tutti i tamponi/reagenti utilizzati devono essere preparati con acqua ultrapura e conservati in contenitori di plastica o vetro che non siano mai stati lavati con sapone.
    1. Preparare provette da centrifuga per ciascun donatore contenenti 9 ml di RPMI caldo e completo (RPMI 1640, 10% FBS, 1% L-glutammina, 1% penicillina/streptomicina) e 20 μl di benzonasi per flaconcino di PBMC da scongelare. Scongelare i PBMC a bagnomaria e aggiungerli ai tubi.
      NOTA: La benzonasi riduce la viscosità e lo sfondo del DNA libero dalle cellule lisate.
    2. Centrifugare a 300 x g a temperatura ambiente per 5 min. Risospendere i PBMC in 5 ml di supporto RPMI completo e contare.
    3. Per ogni titolazione del pannello, piastra 2-4 milioni di PBMC/pozzetto in 6 pozzetti di una piastra a fondo tondo da 96 pozzetti (un pozzetto per ogni titolo e uno per non colorato). Centrifugare la piastra a 600 x g a temperatura ambiente per 3 min. Muovere la piastra per rimuovere il surnatante. Risospendere ogni pozzetto in 200 μL di CyPBS.
    4. Eseguire la colorazione di vitalità del cisplatino come descritto di seguito.
      NOTA: Il cisplatino è usato per discriminare le cellule vive da quelle morte nella citometria di massa.
      1. Risospendere le cellule in 100 μL di 25 μM di cisplatino. Incubare a temperatura ambiente per 1 min.
      2. Estinguere la reazione del cisplatino aggiungendo 100 μL di FBS a ciascun pozzetto e mescolando. Centrifugare e frullare la piastra.
        NOTA: Eseguire tutte le fasi successive della centrifuga a 4 °C.
      3. Lavare le celle due volte con 200 μl di CyFACS (1x PBS senza contaminanti di metalli pesanti in acqua ultrapura con 0,1% BSA, 0,05% di sodio azide). Centrifugare e frullare la piastra ogni volta.
    5. Titolare il pannello anticorpale di superficie come descritto di seguito.
      NOTA: È necessario eseguire miscele master separate per il pannello di superficie NK e il pannello ligando.
      1. Preparare una miscela master di tutti gli anticorpi di superficie a una concentrazione di 10 μg/mL utilizzando CyFACS. Puntare a un volume finale di 150 μL. Effettuare diluizioni seriali 1:2 utilizzando CyFACS, per ottenere le seguenti concentrazioni: 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,625 μg/mL.
      2. Filtrare i cocktail di anticorpi attraverso un'unità di filtro centrifugo (dimensione dei pori di 0,1 μm) a 10.600 x g per 3 minuti prima della colorazione.
      3. Risospendere le cellule piastrate in 50 μl del cocktail di anticorpi di superficie al rispettivo titolo. Risospendere il pozzetto non colorato in CyFACS. Incubare a 4 °C per 30 min.
      4. Lavare le celle con 150 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra.
      5. Lavare le celle con 200 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra.
    6. Eseguire la fissazione delle cellule risospendendo ciascun pozzetto in 100 μL di paraformaldeide (PFA) al 2% in CyPBS. Incubare la piastra a temperatura ambiente al buio per 20 minuti. Lavare le celle con 100 μL di CyFACS. Centrifugare a 700 x g per 5 min.
      ATTENZIONE: Si sospetta che il PFA causi difetti genetici e cancro. Inoltre, è dannoso se entra in contatto con gli occhi, la pelle o viene inalato. Maneggiare in modo appropriato garantendo una buona ventilazione, aprendo con cura il recipiente e prevenendo la formazione di aerosol.
      NOTA: Tutte le centrifughe successive vengono eseguite a 700 x g per 5 minuti a 4 °C.
    7. Permeabilizzare le cellule risospendendo in 200 μl di 1x tampone di permeabilizzazione (tampone per perm) diluito in acqua ultrapura. Centrifugare e frullare la piastra. Lavare le celle con 200 μL di tampone Perm. Centrifugare e frullare la piastra.
      NOTA: L'incubazione nel tampone Perm non è necessaria.
    8. Titolazione intracellulare del pannello anticorpale
      1. Preparare una miscela master di tutti gli anticorpi intracellulari a una concentrazione di 10 μg/mL utilizzando il tampone Perm. Puntare a un volume finale di 150 μL. Effettuare diluizioni seriali 1:2 utilizzando il tampone Perm per ottenere le seguenti concentrazioni: 10, 5, 2,5, 1,25 e 0,625 μg/mL.
      2. Filtrare i cocktail di anticorpi attraverso un'unità di filtro centrifugo (dimensione dei pori di 0,1 μm) a 10.600 x g per 3 minuti prima della colorazione.
      3. Risospendere le cellule piastrate in 50 μL del cocktail di anticorpi intracellulari al rispettivo titolo. Risospendere il pozzetto non colorato nel tampone permanente. Incubare a 4 °C per 45 min.
        NOTA: Se un pannello intracellulare non deve essere titolato, risospendere i pozzetti in 50 μl di tampone Perm.
      4. Lavare le celle con 150 μL di tampone Perm. Centrifugare e frullare la piastra.
      5. Lavare le celle con 200 μL di tampone Perm. Centrifugare e frullare la piastra.
      6. Lavare le celle due volte con 200 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra.
    9. Colorazione dell'intercalatore del DNA
      NOTA: L'intercalatore si lega all'acido nucleico cellulare e viene utilizzato per identificare le cellule nucleate nella citometria di massa.
      1. Cellule di risospensione in 200 μL di intercalatore diluito 1:10.000 in CyPBS e PFA al 2%. Incubare la piastra per una notte a 4 °C.
      2. Conservare le piastre, se necessario, a 4 °C coperte con pellicola di paraffina per un massimo di una settimana.
        NOTA: Eseguire tutte le fasi successive della centrifuga a 700 x g per 5 minuti a 4 °C.
      3. Prima di eseguire i campioni su CyTOF, rimuovere la pellicola di paraffina dalla piastra e centrifugare a 700 x g per 5 minuti a 4 °C. Muovi il piatto. Lavare le celle una volta con 200 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra.
      4. Lavare le celle tre volte con 200 μL di acqua ultrapura. Centrifugare e frullare la piastra. Risospendere le cellule in 200 μL di acqua ultrapura. Immediatamente prima di eseguire il campionamento, regolare la concentrazione a circa 6 x 105 cellule/mL in perle di normalizzazione diluite a una concentrazione di 1x in acqua ultrapura.
    10. Eseguire gli esempi su CyTOF.
    11. Analizza i dati e scegli i titoli appropriati per ciascun anticorpo selezionando il titolo anticorpale più basso, che si traduce nella massima intensità del segnale e nella migliore separazione tra popolazioni positive e negative in base alla valutazione visiva.
      NOTA: Le titolazioni per i pannelli NK e ligando sono mostrate rispettivamente nella Figura 1 e nella Figura 2 . Se non viene identificata una chiara distinzione tra popolazioni positive e negative, i titoli possono essere valutati su più tipi di cellule o su linee cellulari, per consentire l'identificazione di popolazioni cellulari sia positive che negative.
    12. Conservazione del pannello anticorpi
      1. Combinare gli anticorpi titolati in una miscela master e filtrare attraverso un'unità filtrante a siringa sterile da 0,1 μm. Devono essere effettuate miscele master separate per il pannello di superficie NK, il pannello intracellulare NK e il pannello del ligando.
      2. Per lo stoccaggio a lungo termine dei pannelli, seguire una delle due opzioni accettabili:
      3. Inviare la miscela master a un'azienda di terze parti per la liofilizzazione. Questo metodo viene utilizzato per il pannello NK. Gli anticorpi non coniugati internamente non possono essere liofilizzati, a causa della presenza di stabilizzatore anticorpale, che interferisce con il processo di liofilizzazione. Questi anticorpi vengono aggiunti al pannello il giorno della colorazione.
      4. Utilizzare una pipetta a ripetizione per preparare aliquote da 50 μl di ciascuna miscela master e conservarle a -80 °C.

2. Protocollo di colorazione

  1. Scongelare le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) come descritto nei passaggi 1.2.1 e 1.2.2. Mettere da parte almeno 1 milione di PBMC per la colorazione del pannello ligando in una provetta da centrifuga da 15 mL. Mantenere queste PBMC sul ghiaccio durante l'isolamento delle cellule NK.
  2. Isolamento delle cellule NK
    NOTA: I seguenti passaggi di isolamento delle celle NK sono una versione modificata del protocollo di un fornitore specifico. Tuttavia, qualsiasi kit o protocollo che esegua la selezione negativa su base magnetica delle cellule NK sarebbe un'alternativa adeguata. Inoltre, questo passaggio è facoltativo in quanto questo protocollo è adatto anche per la fenotipizzazione di cellule NK da PBMC intere.
    1. Centrifugare le restanti PBMC a 450 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet cellulare in 40 μL di tampone MACS (PBS, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) per 107 celle totali.
    2. Aggiungere 10 μl di cocktail di biotina-anticorpi sulle cellule NK per 10-7 cellule totali. Mescolare bene e incubare per 5 minuti con ghiaccio.
    3. Aggiungere 30 μL di tampone MACS per 107 cellule totali e 20 μL di MicroBead Cocktail di cellule NK per 107 cellule totali. Mescolare bene e incubare per 10 minuti con ghiaccio.
    4. Preparare le colonne di eluizione risciacquando con 500 μl di tampone MACS. Aggiungere 2 mL di RPMI completo a freddo a 15 mL di provette di raccolta.
    5. Aggiungere il tampone MACS alle provette contenenti le cellule per portare il volume fino a 500 μL. Pipettare l'intero volume di 500 μL sulla colonna di eluizione preparata. Sciacquare la provetta con altri 500 μl di tampone MACS e trasferirla nella colonna.
    6. Dopo l'arresto del flusso, sciacquare due volte la colonna di eluizione con 500 μL di tampone MACS. Dopo che il flusso si è fermato, contare le cellule NK.
  3. Piastre e celle di lavaggio.
    1. Centrifugare le cellule NK e le PBMC isolate a 300 x g a temperatura ambiente per 10 minuti. Risospendere le cellule a una concentrazione di 5 milioni di cellule/mL in CyPBS (1x PBS senza contaminanti di metalli pesanti in acqua ultrapura). Piastre in una piastra a 96 pozzetti con fondo a U.
      NOTA: Ogni aliquota del pannello di celle NK può macchiare fino a 3 milioni di cellule. Se sei singoli campioni di cellule NK vengono codificati con codice a barre e raggruppati prima della colorazione, il numero totale combinato di cellule NK non deve superare i 3 milioni. Il pannello del ligando può colorare fino a 6 milioni di PBMC per campione. Se sei singoli campioni vengono codificati a barre e raggruppati prima della colorazione, il numero totale combinato di PBMC non deve superare i 6 milioni.
    2. Centrifugare la piastra a 600 x g a temperatura ambiente per 3 min. Muovere la piastra per rimuovere il surnatante.
      NOTA: Eseguire tutte le centrifughe successive a 600 x g per 3 minuti fino al passaggio 2.7.
    3. Risospendere le cellule in 200 μL di CyPBS. Centrifugare e frullare la piastra.
  4. Eseguire la colorazione di vitalità con cisplatino come descritto al punto 1.2.4.
  5. Colorazione con codici a barre
    NOTA: Questi pannelli vengono utilizzati in combinazione con un metodo di codifica a barre modificato a due di quattro, basato sul palladio, su cellule vive non fissate per ridurre al minimo gli effetti batch e massimizzare il recupero delle cellule15. Tuttavia, questo passaggio è facoltativo in quanto la codifica a barre non è necessaria per ottenere dati di qualità.
    1. Risospendere ciascun pozzetto in 50 μl del rispettivo codice a barre premiscelato e incubare a 4 °C per 30 minuti. Lavare le celle con 150 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra.
    2. Lavare le celle due volte con 200 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra. Risospendere tutti i pozzetti in 30 μl di CyFACS. Combina fino a sei pozzetti di cellule colorate con codici a barre univoci in un unico pozzetto ed esegui la centrifugazione e il flicking della piastra.
  6. Colorazione superficiale
    1. Sciogliere la losfera del pannello NK di superficie in 50 μL di CyFACS con ulteriori anticorpi di superficie addizionati (anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-LILRB1). Scongelare il pannello del legante conservato a -80 °C e centrifugare il tubo con una minicentrifuga. Picco in ulteriori marcatori di superficie del pannello ligando (anti-CD16, anti-CD19).
      NOTA: Qualsiasi cocktail di anticorpi che non sia stato precedentemente filtrato (cioè prima della liofilizzazione o del congelamento) deve essere filtrato attraverso un'unità di filtro centrifugo (dimensione dei pori di 0,1 μm) a 10.600 x g per 3 minuti prima della colorazione.
    2. Risospendere ciascun pozzetto in 50 μl del rispettivo pannello. Incubare a 4 °C per 30 min. Lavare le celle con 150 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra. Lavare nuovamente le celle con 200 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra.
  7. Correggi le celle come descritto nel passaggio 1.2.6.
    NOTA: Eseguire tutte le centrifughe successive a 700 x g per 5 minuti a 4 °C.
  8. Permeabilizzare le cellule come descritto nel passaggio 1.2.7.
  9. Colorazione intracellulare
    1. Sciogliere la losfera intracellulare del pannello NK in 50 μL di tampone Perm. Se lo si desidera, preparare un cocktail di anticorpi intracellulari per i campioni di PBMC.
      NOTA: Qualsiasi cocktail di anticorpi che non sia stato precedentemente filtrato (cioè prima della liofilizzazione o del congelamento) deve essere filtrato attraverso un'unità di filtro centrifugo (dimensione dei pori di 0,1 μm) a 10.600 x g per 3 minuti prima della colorazione.
    2. Pozzetti di risospensione in 50 μL dei rispettivi pannelli intracellulari. Se non viene utilizzato un pannello intracellulare in combinazione con il pannello della superficie del ligando, risospendere i pozzetti di PBMC in 50 μL del tampone Perm. Incubare a 4 °C per 45 min.
    3. Lavare le celle con 150 μL di tampone Perm. Centrifugare e sfogliare la piastra. Lavare le celle con 200 μL di tampone Perm. Centrifugare e frullare la piastra.
    4. Lavare le celle due volte con 200 μL di CyFACS. Centrifugare e frullare la piastra.
  10. Colorazione intercalatrice del DNA. Eseguire la colorazione dell'intercalatore del DNA come descritto al punto 1.2.9.1. Incubare la piastra per una notte a 4 °C.
    NOTA: L'intercalatore si lega all'acido nucleico cellulare e viene utilizzato per identificare le cellule nucleate nella citometria di massa. Le piastre possono essere conservate coperte con un film di paraffina per un massimo di una settimana a 4 °C.
  11. Prima di eseguire i campioni su CyTOF, lavare le celle come descritto nei passaggi 1.2.9.3 e 1.2.9.4.
  12. Eseguire esempi su CyTOF.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Gli anticorpi sono stati coniugati a isotopi metallici utilizzando kit di marcatura disponibili in commercio, secondo le istruzioni del produttore. I cloni di anticorpi sono stati convalidati mediante citometria a flusso e citometria di massa prima dell'uso in questo pannello. Un elenco iniziale di cloni è stato selezionato sulla base della revisione della letteratura e della disponibilità di anticorpi. I livelli di espressione di alcuni ligandi per i recettori delle cellule NK sono bassi...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

Qui descriviamo la progettazione e l'applicazione di due pannelli CyTOF complementari volti a profilare il repertorio recettore-ligando delle cellule NK. Questo protocollo include diversi passaggi fondamentali per ottenere dati di qualità. CyTOF utilizza ioni di metalli pesanti, piuttosto che fluorocromi, come sonde di marcatura per gli anticorpi19. Questa tecnologia è quindi soggetta a potenziali segnali di contaminazione da parte dei metalli ambientali

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri attuali ed ex del Blish Laboratory che hanno contribuito a questo panel. Grazie all'AIDS Clinical Trials Group e al team ACTG A5321, nonché alla dottoressa Sandra López-Vergès e Davis Beltrán del Gorgas Memorial Institute for Health Studies per la cura dei campioni. Infine, grazie a Michael Leipold, Holden Maecker e allo Stanford Human Immune Monitoring Center per l'uso delle loro macchine Helios. Questo lavoro è stato supportato da NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089 e Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenesis of Infectious Diseases #1016687 to CB, NIH Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award T32 AI007502, TL1 TR001084 e NIH/NIAID K08 AI138640 to EV, National Science Foundation Graduate Research Fellowship DGE-1656518 to JM e NIH training grant T32-AI-007290 (PI Olivia Martinez). Lo studio ACTG ha ricevuto sovvenzioni da AI-68634 (Statistical and Data Management Center), UM1-A1-26617, AI-131798 e AI-68636 (ACTG). CB è il Tashia and John Morgridge Faculty Scholar in Pediatric Translational Medicine presso lo Stanford Maternal Child Health Research Institute e un ricercatore del Chan Zuckerberg Biohub.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
89YSigma-Aldrich204919
102-Nitrato di palladioTrace Sciences Ordine
104-Nitrato di palladioTrace Sciences Ordine
106-Nitrato di palladioTrace Sciences Ordine
108-Nitratodi palladioTrace SciencesInternational Special Order
115InTrace Sciences InternationalSpecial Order
141PrFluidigm201141A
142NdFluidigm201142A
143NdFluidigm201143A
144NdFluidigm201144A
145NdFluidigm201145A
146NdFluidigm201146A
147SmFluidigm201147A
148NdFluidigm201148A
149SmFluidigm201149A
150NdFluidigm201150A
151EuFluidigm201151A
152SmFluidigm201152A
153EuFluidigm201153A
154SmFluidigm201154A
155GdFluidigm201155A
156GdFluidigm201156A
157GdTrace Sciences InternationalN/A
158GdFluidigm201158A
159TbFluidigm201159A
160GdFluidigm201160A
161DyFluidigm201161A
162DyFluidigm201162A
163DyFluidigm201163A
164DyFluidigm201164A
165HoFluidigm201165A
166ErFluidigm201166A
167ErFluidigm201167A
168ErFluidigm201168A
169TmFluidigm201169A
170ErFluidigm201170A
171YbFluidigm201171A
172YbFluidigm201172A
173YbFluidigm201173A
174YbFluidigm201174A
175LuFluidigm201175A
176YbFluidigm201176A
209Bi anti-CD16Fluidigm3209002BClone 3G8. Utilizzato con una diluizione di 1:50.
697 celleCreative BioarrayCSC-C0217
Unità filtranti ultra centrifughe Amicon 0,5 con membrana Ultracel-30, 30 kDaMilliporeUFC503096
acetonitrile anidroFisher ScientificBP1165-50
anti-2B4Biolegend329502Clone C1.7.
anti-B7-H6R& D SystemsMAB7144Clone 875001.
anti-CCR2Biolegend357202Clone K036C2.
anti-CD2Biolegend300202Clone RPA-2.10.
anti-CD3Biolegend300402Clone UCHT1.
anti-CD4Biolegend317402Clone OKT4.
anti-CD4Biolegend344602Clone SK3.
anti-CD7Biolegend343102Clone CD7-6B7.
anti-CD8Biolegend344702Clone SK1.
anti-CD11bBiolegend301302Clone ICRF44.
anti-CD14Biolegend301802Clone M5E2.
anti-CD19Biolegend302202Clone HIB19.
anti-CD33Biolegend303402Clone WM53.
anti-CD38Biolegend303502Clone HIT2.
anti-CD48Biolegend336702Clone BJ40.
anti-CD56BD Pharmingen559043Clone NCAM16.2.
anti-CD57Biolegend322302Clone HCD57.
anti-CD62LBiolegend304802Clone DREG-56.
anti-CD69Biolegend310902Clone FN50.
anti-CD94Biolegend305502Clone DX22.
anti-CD95Biolegend305602Clone DX2.
anti-CD155Biolegend337602Clone SKII.4.
anti-CXCR6Biolegend356002Clone K041E5.
anti-DNAM-1BD Biosciences559787Clone DX11.
anti-DR4Biolegend307202Clone DJR1.
anti-DR5Biolegend307302Clone DJR2-2.
anti-FAS-LBiolegend306402Clone NOK-1.
anti-FcRgMillipore06-727Anticorpo policlonale.
anti-HLA-C,EMilliporeMABF233Clone DT9.
anti-HLA-Bw4Miltenyi BiotecClone Ordine SpecialeREA274.
anti-HLA-Bw6Miltenyi Biotec130-124-530Clone REA143.
anti-HLA-DRBiolegend307602Clone L243.
anti-HLA-EBiolegend342602Clone 3D12.
anti-ICAM-1Biolegend353102Clone HA58.
anti-Ki-67Biolegend350502Clone Ki-67.
R& R& anti-KIR2DL1/KIR2DS5 D SystemsMAB1844Clone 143211.
anti-KIR2DL3R& D SystemsMAB2014Clone 180701.
anti-KIR2DL5Miltenyi Biotec130-096-200Clone UP-R1.
R& anti-KIR2DS4 D SystemsMAB1847Clone 179315.
anti-KIR3DL1BD Biosciences555964Clone DX-9.
anti-LFA-3Biolegend330902Clone TS2/9.
anti-LILRB1R& D Systems292319Clone MAB20172.
anti-LLT-1R& D SystemsAF3480Clone 402659.
anti-MICAR& D SystemsMAB1300-100Clone 159227.
R& anti-MICB D SystemsMAB1599-100Clone 236511.
anti-Nectina-1Biolegend340402Clone R1.302.
anti-Nectina-2Biolegend337402Clone TX31.
anti-NKG2AR& D SystemsMAB1059Clone 131411.
anti-NKG2CR& D SystemsMAB1381Clone 134522.
anti-NKG2DBiolegend320802Clone 1D11.
anti-NKp30Biolegend325202Clone P30-15.
anti-NKp44Biolegend325102Clone P44-8.
anti-NKp46Biolegend331902Clone 9E2.
anti-NTB-ABiolegend317202Clone NT-7.
anti-Pan HLA classe IBiolegend311402Clone W6/32.
anti-PD1Biolegend329902Clone EH12.2H7.
anti-PerforinAbcamab47225Clone B-D48.
anti-Siglec-7Biolegend347702Clone S7.7.
anti-SykBiolegend644302Clone 4D10.2.
anti-TACTILEBiolegend338402Clone NK92.39.
anti-TIGITR& D SystemsMAB7898Clone 741182.
anti-ULBP-1R& D SystemsMAB1380-100Clone 170818.
anti-ULBP-2, 5, 6R& D SystemsMAB1298-100Clone 165903.
Stabilizzatore di anticorpiCandor Bioscience131 050
Benzonasi NucleasiMillipore70664
Bond-Breaker Soluzione TCEPThermo Fisher Scientific77720
Soluzione di albumina sierica bovinaSigma-AldrichA9576
Cloruro di calcio diidrato (CaCl2+2H2O)Sigma-Aldrich223506-25G
Cis-Platinum(II)diammina dicloruro (cisplatino)Enzo Life SciencesALX-400-040-M250Una soluzione madre da 100 mM è stata preparata in DMSO e suddivisa in 25 µ L aliquote. Usato a 25 & micro; Diluizione M per macchia viva/morta. Il segnale appare nei canali 194Pt e 195Pt.
DMSOSigma-AldrichD2650
eBioscience Tampone di permeabilizzazioneThermo Fisher Scientific00-8333-56
EDTA (0,5 M)HoeferGR123-100Un tampone HEPES a doppia concentrazione con EDTA è stato prodotto secondo la seguente ricetta: 1,3 g di NaCl (Thermo Fisher Scientific), 27 mg di CaCl2+2H2O (Sigma-Aldrich), 23 mg di MgCl22PO4 (Thermo Fisher Scientific), 4 mL di HEPES 1M (Thermo Fisher Scientific), 2 mL di EDTA 0,5M (Hoefer, Holliston, MA, USA) e 100 mL di H2O. Il pH di questo tampone HEPES a doppia concentrazione è stato regolato a un pH di 7,3 utilizzando 1M HCl e 1M NaOH.
EQ Perle di calibrazione a quattro elementiFluidigm201078
Siero fetale bovinoThermo Fisher ScientificN/A
Citometro di massa HeliosFluidigmN/A
HEPES (1M)Thermo Fisher Scientific15630080
Soluzione antibiotica/antimicotica HyClone (Pen/Strepto/Fungiezone)Fisher Scientific
Iridio - Intercalatore 191Ir/193IrDVS Sciences (Fluidigm)201192BUtilizzato con diluizione 1:10000.
Isotiocianobenzil-EDTA (ITCB-EDTA)Dojindo Molecular Technologies, Inc.M030-10Diluito a 1,25 mg/mL in acetonitrile anidro.
Cellule K562 AmericanType Culture Collection (ATCC)ATCC CCL-243
L-Glutammina (200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034
Cloruro di magnesio (MgCl2)Sigma-Aldrich208337-100G
Maxpar X8 Antibody Labeling KitsFluidigmN/A Nessunnumero di catalogo poiché i kit vengono forniti con metalli.
Millex-VV Unità filtro per siringa, 0.1 µ mMilliporeSLVV033RS
Milli-Q Advantage A10 Sistema di purificazione dell'acquaMilliporeZ00Q0V0WW
colonne MSMiltenyi Biotec
NALM6 celleType Culture Collection (ATCC)ATCC CRL-3273
Dispositivi centrifughi Nanosep con membrana Omega 3KPall CorporationOD003C35
Kit di isolamento cellulare NK, umanoMiltenyi Biotec130-092-657
Paraformaldeide (16%)Microscopia elettronica Scienze15710
PBSThermo Fisher Scientific10010023
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)Fisher ScientificMP021954531
Qdot 655 anti-CD19Thermo Fisher ScientificQ10179Clone SJ25-C1. Utilizzato con diluizione 1:50. Il segnale appare nei canali 112Cd-114Cd.
Qdot 655 anti-HLA-DRThermo Fisher ScientificQ22158Clone Tü36. Utilizzato con diluizione 1:200.
Rockland PBSRockland Immunochemicals, Inc.MB-008 Utilizzato per produrre tamponi CyPBS (10X Rockland PBS diluito a 1X in acqua Milli-Q) e CyFACS (10X Rockland PBS diluito a 1X in acqua Milli-Q con 0,1% BSA e 0,05% di sodio azide). I tamponi sono stati filtrati in modo sterile attraverso un 0,22 µ M filtra e filtra a 4 gradi C nelle bottiglie Stericup.
RPMI 1640Thermo Fisher Scientific 21870092
Sodio azide (NaN3)Sigma-AldrichS2002
Cloruro di sodio (NaCl)Fisher ScientificS271-500
Stericup Quick Release-GP Sistema di filtrazione sottovuoto sterileMillipore SigmaS2GPU10RE
Soluzione di sintonizzazioneFluidigm201072
Soluzione di lavaggio Fluidigm201070
speciale internazionalespeciale internazionalespeciale internazionaleSV3007901 American

Riferimenti

  1. Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (3), 200-218 (2020).
  2. Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
  3. Eller, M. A., Currier, J. R. OMIP-007: phenotypic analysis of human natural killer cells. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (6), 447-449 (2012).
  4. Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-029: Human NK-cell phenotypization. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 87 (11), 986-988 (2015).
  5. Hammer, Q., Romagnani, C. OMIP-039: Detection and analysis of human adaptive NKG2C + natural killer cells : Detection of Human Adaptive NKG2C + NK Cells. Cytometry. 91 (10), 997-1000 (2017).
  6. Liechti, T., Roederer, M. OMIP-058: 30-Parameter flow cytometry panel to characterize iNKT, NK, unconventional and conventional T cells. Cytometry. 95 (9), 946-951 (2019).
  7. Béziat, V., et al. NK cell responses to cytomegalovirus infection lead to stable imprints in the human KIR repertoire and involve activating KIRs. Blood. 121 (14), 2678-2688 (2013).
  8. Pfefferle, A., et al. Intra-lineage plasticity and functional reprogramming maintain natural killer cell repertoire diversity. Cell Reports. 29 (8), 2284-2294 (2019).
  9. Barcenilla, H., Åkerman, L., Pihl, M., Ludvigsson, J., Casas, R. Mass cytometry identifies distinct subsets of regulatory T cells and Natural killer cells associated with high risk for Type 1 diabetes. Frontiers in Immunology. 10, 982(2019).
  10. Kurioka, A., et al. CD161 defines a functionally distinct subset of pro-inflammatory Natural killer cells. Frontiers in Immunology. 9, 486(2018).
  11. Romee, R., et al. Cytokine-induced memory-like natural killer cells exhibit enhanced responses against myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 8 (357), (2016).
  12. Shinko, D., et al. Mass cytometry reveals a sustained reduction in CD16+ Natural killer cells following chemotherapy in colorectal cancer patients. Frontiers in Immunology. 10, 2584(2019).
  13. Pohlmeyer, C. W., et al. Identification of NK cell subpopulations that differentiate HIV-infected subject cohorts with diverse levels of virus control. Journal of Virology. 93 (7), 01790(2019).
  14. Palgen, J. -L., et al. NK cell immune responses differ after prime and boost vaccination. Journal of Leukocyte Biology. 105 (5), 1055-1073 (2019).
  15. Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
  16. Takahashi, C., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
  17. Baumgart, S., Peddinghaus, A., Schulte-Wrede, U., Mei, H. E., Grützkau, A. OMIP-034: Comprehensive immune phenotyping of human peripheral leukocytes by mass cytometry for monitoring immunomodulatory therapies. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 34-38 (2017).
  18. Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 87 (5), 380-382 (2015).
  19. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  20. Leipold, M. D., Newell, E. W., Maecker, H. T. Multiparameter phenotyping of human PBMCs using mass cytometry. Methods in Molecular Biology. 1343, 81-95 (2015).
  21. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (6), 467-475 (2012).
  22. Zivanovic, N., Jacobs, A., Bodenmiller, B. A practical guide to multiplexed mass cytometry. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 95-109 (2014).
  23. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150 (3), 248-264 (2017).
  24. Wilk, A. J., et al. Charge-altering releasable transporters enable specific phenotypic manipulation of resting primary natural killer cells. BioRxiv. , 970491(2020).
  25. Vendrame, E., et al. TIGIT is upregulated by HIV-1 infection and marks a highly functional adaptive and mature subset of natural killer cells. AIDS. 34 (6), 801-813 (2020).
  26. Zhao, N. Q., et al. Natural killer cell phenotype is altered in HIV-exposed seronegative women. PloS One. 15 (9), 0238347(2020).
  27. McKechnie, J. L., et al. HLA upregulation during dengue virus infection suppresses the natural killer cell response. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 268(2019).
  28. McKechnie, J. L., et al. Mass cytometry analysis of the NK cell receptor-ligand repertoire reveals unique differences between dengue-infected children and adults. ImmunoHorizons. 4 (10), 634-647 (2020).
  29. Ranganath, T., et al. Characterization of the impact of daclizumab beta on circulating natural killer cells by mass cytometry. Frontiers in immunology. 11, 714(2020).
  30. Fernandez, I. Z., et al. A novel human IL2RB mutation results in T and NK cell--driven immune dysregulation. The Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1255-1267 (2019).
  31. Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (45), 9626-9634 (2017).
  32. Nikzad, R., et al. Human natural killer cells mediate adaptive immunity to viral antigens. Science Immunology. 4 (35), (2019).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Esplora altri articoli

Cellule Natural Killercitometria di massapannelli CyTOFespressione dei recettoriespressione dei ligandibarcoding al palladiocampioni cliniciinfezioni viralisottogruppi di cellule immunitarie

Questo articolo è stato pubblicato

Video in arrivo

Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.