Profilazione metabolica ad alto rendimento per perfezionamenti del modello di microalghe

Screening del fenotipo Microarray dell'alga modello Chlamydomonas reinhardtii
I saggi PM testano la capacità dell'alga di utilizzare varie fonti di carbonio, azoto, zolfo e fosforo in un mezzo minimo. In questa descrizione dei metodi, abbiamo dimostrato come i saggi PM sono stati utilizzati per identificare il metabolismo del carbonio e dell'azoto. La cinetica di utilizzo del carbonio e dell'azoto è stata misurata con un lettore di micropiasche. I dati sono stati analizzati utilizzando il software PMI. La cinetica riassuntiva delle piastre di dosaggio PM selezionate (PM01 e PM03) è mostrata nella Figura 1. I "grafici xy" mostrano le misurazioni della respirazione nel tempo tracciate per i saggi delle piastre a 96 pozzi, dove l'asse y e l'asse x rappresentano rispettivamente i valori delle misurazioni grezze e del tempo. I dati sono stati convertiti in un modello di mappa termica per analizzare comparativamente l'assemblaggio dei dati cinetici.

La pipeline di raffinazione della rete metabolica su scala genomica utilizzando i dati PM (Figura 2) illustra l'integrazione dei saggi PM ad alto rendimento con le prove sperimentali fornite dalle ricerche genomiche in grado di espandere un modello di rete metabolica.

Per determinare la riproducibilità dei dati PM ottenuti dalle piastre PM01 - 04 e PM10, è stata analizzata una regressione lineare per tracciare i dati di due esperimenti di replica indipendenti l'uno contro l'altro (Figura 3). La figura 3 mostra che la maggior parte dei dati erano quasi simili in quanto cadono sulla linea del 45 °, con solo pochi valori anomali presenti, e il loro coefficiente di determinazione R2 era 0,9. La consistenza e la riproducibilità degli esperimenti per l'alga sono verificate da questo appezzamento.

Identificazione di nuovi metaboliti
Il test PM ha identificato 662 metaboliti in sette piastre; PM01-PM04 e PM06-PM08, mentre la gascromatografia Time-Of-Flight (GC-TOF) aveva identificato 77 metaboliti32 (Figura 4). Confrontando questi due insiemi con i 1068 metaboliti contabili nell'iRC1080, solo sei metaboliti si sovrapponevano tra i tre insiemi e 149 si sovrapponevano tra l'iRC1080 e il PM. Questo risultato dimostra che la piattaforma di profilazione metabolica può essere una fonte significativa di nuove informazioni metaboliche.

L'acido acetico era l'unica fonte di carbonio rilevata nella piastra PM01 come carbonio di supporto dopo aver sottratto il segnale di fondo. Questo risultato è coerente con la letteratura33 e mostra la specificità dei saggi DI PM. I test PM hanno rivelato nuove fonti di zolfo, fosforo e azoto che C. reinhardtii può utilizzare per la crescita. I metaboliti dello zolfo erano solfato, tiosolfato, tetrationato e DL-lipoamide. Le fonti di fosforo erano tiofosfato, ditiofosfato, acido D-3-fosfo-glicerico e cisteamina-S-fosfato. I metaboliti fonte di azoto erano L-ammino e D-amminoacidi, compresi gli amminoacidi meno comuni; L-omoserina, L-piroglutammica, metilammina, etilammina, etanolamina e D,L-α-ammino-butirrico, e 108 di-peptidi e cinque tri-peptidi (Tabella 1). Tutti i 128 metaboliti appena identificati sono stati cercati in KEGG e MetaCyc per le loro reazioni associate, i numeri EC e le vie.

I nuovi 128 metaboliti sono stati associati a 49 numeri EC unici. Di questi, 15 EC sono stati collegati alle loro prove genomiche utilizzando cinque fonti tra cui; Phytozome Version 10.0.234 JGI Version 435, AUGUSTUS 5.0 e 5.210 annotazioni da Manichaikul et al. 36 e KEGG13. I metaboliti senza evidenza genomica sono stati inseriti nel sito web Universal Protein Resource (UniProt, http://www.uniprot.org/)37,38 dove le loro sequenze correlate sono state trovate in altri organismi. Le sequenze omologhe in C. reinhardtii sono state identificate eseguendo Position-Specific Iterated BLAST (PSI-BLAST, https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) dal sito web NCBI considerando solo sequenze che hanno prodotto allineamenti significativi (valore E <0,005).

Perfezionamento del modello
Le reazioni associate ai nuovi 128 metaboliti, insieme ai loro geni codificati, sono state aggiunte al modello iRC1080, espandendo la rete. Il modello risultante iBD1106, rappresenta 2.444 reazioni, 1.959 metaboliti e 1.106 geni (Tabella 2). Le nuove 254 reazioni aggiunte sono state 20 reazioni di ossidazione degli aminoacidi, 108 reazioni di idrolisi di-peptidica, cinque reazioni di idrolisi tripeptidica e 120 reazioni di trasporto, codificate da quattro geni (Cre02.g096350.t1.3, au.g14655_t1, e_gwW.1.243.1, Cre12.g486350.t1.3).

Un totale di 113 nuove reazioni aggiunte spiegano l'idrolisi di di-peptidi e tri-peptidi. L'idrolisi di di-peptidi e tri-peptidi è associata a due geni, uno per i di-peptidi (Cre02.g078650.t1.3) e uno per i tri-peptidi (Cre16.g675350.t1.3).

Per quanto riguarda le fonti di fosforo, è stata aggiunta una reazione per l'idrolisi della cisteamina-S-fosfato in cisteamina e fosfato associata al gene JLM_162926.

Lo strumento WoLF PSORT39 (http://www.genscript.com/psort/wolf_psort.html) e i risultati riportati da Ghamsari et al. 35 sono stati applicati per ottenere la specifica dei compartimenti cellulari in cui avvengono le nuove reazioni. Analizzando le sequenze proteiche associate alle nuove reazioni, WoLF PSORT ha previsto il citosol come compartimento cellulare per le reazioni.

Un modello metabolico generato può contenere lacune quando le informazioni biochimiche sono incomplete. In questi casi, viene utilizzato gapFind, un comando COBRA. Elenca le lacune alla radice e consente l'identificazione di nuove lacune nell'introduzione del nuovo modello. I metaboliti che non possono essere prodotti in un modello metabolico sono indicati come lacuneradicolare 40,41. L'analisi del root gap ha indicato che entrambi i modelli iRC1080 e iBD1106 contengono gli stessi 91 gap. Ciò dimostra che l'aggiunta dei nuovi metaboliti e delle loro reazioni associate non ha introdotto ulteriori lacune nelle radici. Va notato che il metodo di fenotipizzazione utilizzato in questo protocollo non chiude le lacune delle radici, perché i metaboliti del gap radicale originale mancano di meccanismi di trasporto o produzione, che non sono stati affrontati nei saggi di fenotipizzazione. L'analisi del bilancio di flusso è stata effettuata per testare il comportamento metabolico di iBD1106 in condizioni di luce e buio; (senza acetato) e (con acetato), rispettivamente. L'algoritmo massimizza le reazioni precursori della biomassa per una funzione oggettiva (crescita della biomassa). Per valutare il coinvolgimento di ciascun metabolita nella funzione obiettivo impostata, sono stati calcolati i "prezzi ombra" per tutti i metaboliti. Il cambiamento nella funzione oggettiva riguardante le variazioni di flusso del metabolita definisce il prezzo ombra di un metabolita30,42. L'indicazione se un metabolita è in "eccesso" o sta "limitando" la funzione oggettiva può essere determinata dall'analisi dei prezzi ombra, ad esempio la produzione di biomassa. Valori di prezzo ombra negativi o positivi rivelano metaboliti che, al momento dell'aggiunta, diminuiranno o aumenteranno la funzione obiettivo. I valori zero dei prezzi ombra rivelano metaboliti che non influenzeranno la funzione obiettivo. Il confronto dei prezzi ombra tra iBD1106 e iRC1080 nella Figura 5 mostra che, per la maggior parte dei metaboliti, non si osserva un cambiamento significativo; tuttavia, le differenze si riscontrano rispettivamente in 105 e 70 casi in condizioni di crescita chiare e scure. La Tabella 4 include esempi di tali metaboliti.

Figura 1: Profilo fenotipico dei microarray di C. reinhardtii. Respirazione XY-plots e grafici di livello del PM01 (Fonti di carbonio; A, C) e PM03 (fonti di azoto; B, D) vengono mostrate le piastre di dosaggio. La figura è una matrice 8x12 in cui ogni cellula rappresenta una piastra di pozzo e, quindi, un dato metabolita o ambiente di crescita. All'interno di ogni rappresentazione di celle o pozzi, le curve rappresentano la conversione del colorante per riduzione (asse y) in funzione del tempo (asse x). Le curve di respirazione PM dal CC-503 e dai pozzeli vuoti sono mostrate in ogni cella e sono indicate dal colore (il colore verde acqua rappresenta i pozzeli vuoti e il colore viola rappresenta CC-503). Il grafico a livello rappresenta ogni curva di respirazione come una sottile linea orizzontale che cambia colore (o rimane invariata) nel tempo. I cambiamenti di colore della mappa di calore vanno dal giallo chiaro (poca o nessuna respirazione ha avuto luogo) all'arancione scuro o al marrone (ha avuto luogo una respirazione significativa). Vengono mostrati i metaboliti utilizzati da C. reinhardtii (CC-503) e le piastre bianche. Questa cifra è tratta da un lavoro precedentemente pubblicato da Chaiboonchoe et al. 12Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 2: Pipeline di raffinamento della rete metabolica su scala genomica utilizzando i dati PM. Dopo che un nuovo composto risulta positivo in un test PM, il suo numero di Commissione enzimatica (EC), la reazione e la via vengono identificati dai database disponibili, ad esempio KEGG e MetaCyc. Le prove genomiche vengono quindi estratte da risorse genomiche e di annotazione quando disponibili e costituiscono un collegamento tra genotipo e fenotipo. Quando l'evidenza genomica diretta non è disponibile, la sequenza proteica viene identificata dai numeri EC e l'evidenza genetica viene identificata tramite PSI-Blast. La rete metabolica ricostruita viene quindi perfezionata sulla base di composti appena identificati, ma solo dopo una fase di controllo della qualità che comporta l'interrogazione dei domini proteici utilizzando database pertinenti. Questa figura è stata modificata dal lavoro precedentemente pubblicato da Chaiboonchoe et al. 12Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 3: Riproducibilità dei test PM. I valori PMI sono stati raccolti in un periodo di 168 ore e i valori massimi PMI sono stati tracciati per due studi replicati. Ogni asse rappresenta i valori PMI massimi per ogni studio (l'asse x è uno studio di replica e l'asse y un altro). I valori riprodotti sono equidistanti da ciascun asse. Ogni punto rappresenta un singolo valore massimo. La regressione lineare è stata eseguita da un software per fogli di calcolo e viene mostrato il coefficiente di determinazione risultante (R2). Questa figura è stata modificata dal lavoro precedentemente pubblicato da Chaiboonchoe et al. 12Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 4: Diagramma di Venn dei metaboliti. Il diagramma di Venn enumera i metaboliti identificati dalle piastre PM, dal modello metabolico iRC1080 e dagli esperimenti gascromatografia Time of Flight (GC-TOF). Ogni cerchio indica il numero totale di metaboliti esistenti in ciascun rispettivo metodo di studio. Allo stesso tempo, le regioni sovrapposte rappresentano il numero di metaboliti condivisi tra questi metodi. Il modello metabolico iRC1080 contiene un totale di 1.068 metaboliti unici. Il GC-TOF ha identificato un totale di 77 metaboliti32, mentre ci sono un totale di 662 metaboliti identificati utilizzando le piastre PM. Questa cifra è tratta da lavori precedentemente pubblicati da Chaiboonchoe et al. 12Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Prezzi ombra dei metaboliti in iRC1080 e iBD1106 in condizioni diverse per la massimizzazione della biomassa. Ogni cerchio sui "grafici radar" corrisponde a un valore di prezzo ombra, mentre ogni linea che si estende dal centro di un grafico indica un metabolita. (A) Prezzi ombra e comportamenti metabolici di iRC1080 e iBD1106 in una leggera condizione di crescita; (B), diversi comportamenti metabolici di iRC1080 e iBD1106 in una condizione di crescita oscura. Questa cifra è tratta da lavori precedentemente pubblicati da Chaiboonchoe et al. 12Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Elenco dei metaboliti positivi identificati per l'utilizzo del substrato (C, P, S, N) non presenti nel modello metabolico iRC1080.   *La reazione non è stata inclusa se non è stato identificato alcun gene.  1 Phytozome versione 10.0.2 (http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Creinhardtii).   numero arabo JGI versione 4 35.  3 Augustus versione 510.  4 KEGG (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html).  5 JGI versione 3.136.  Questa tabella è tratta da lavori precedentemente pubblicati da Chaiboonchoe et al. 12 anni

Tabella 2: Contenuto di iRC1080 e iBD1106.  Questa tabella è tratta da lavori precedentemente pubblicati da Chaiboonchoe et al. 12 anni

Tabella 3: Sintesi delle nuove reazioni in iBD1106. Questa tabella è tratta da lavori precedentemente pubblicati da Chaiboonchoe et al. 12 anni

Tabella 4: Esempio di prezzi ombra significativi per iRC1080 e iBD1106. Questa tabella è tratta da lavori precedentemente pubblicati da Chaiboonchoe et al. 12 anni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.