Diverse regioni cerebellari sono state implicate per svolgere un ruolo in distinti output comportamentali, ma i meccanismi molecolari sottostanti rimangono sconosciuti. Questo lavoro descrive un metodo per sezionare in modo riproducibile e rapido la corteccia cerebellare degli emisferi, delle regioni anteriori e posteriori del verme e dei nuclei cerebellari profondi al fine di sondare le differenze molecolari isolando l'RNA e testando le differenze nell'espressione genica.
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Articolo metodologico
Dissezione regionale cerebellare per l'analisi molecolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il cervelletto svolge un ruolo importante in diverse funzioni chiave tra cui il controllo del movimento, l'equilibrio, la cognizione, la ricompensa e l'affetto. Studi di imaging indicano che regioni cerebellari distinte contribuiscono a queste diverse funzioni. Gli studi molecolari che esaminano le differenze cerebellari regionali sono in ritardo in quanto sono per lo più eseguiti su estratti cerebellari interi, mascherando così qualsiasi distinzione tra specifiche regioni cerebellari. Qui descriviamo una tecnica per sezionare in modo riproducibile e rapido quattro diverse regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare vermale anteriore e posteriore e la corteccia cerebellare degli emisferi. Sezionare queste regioni distinte consente l'esplorazione di meccanismi molecolari che possono essere alla base dei loro contributi unici all'equilibrio, al movimento, all'affetto e alla cognizione. Questa tecnica può anche essere utilizzata per esplorare le differenze nella suscettibilità patologica di queste regioni specifiche in vari modelli di malattia murina.
Introduzione
Il cervelletto contiene oltre la metà dei neuroni nel cervello ed è stato storicamente indicato come un centro di controllo motorio e di equilibrio nel cervello1. Più recentemente, gli studi hanno dimostrato che il cervelletto svolge un ruolo chiave in varie altre funzioni tra cui la cognizione, l'elaborazione della ricompensa e l'influenza2,3,4,5.
Il cervelletto ha un'anatomia ben descritta: la regione della corteccia è composta da granuli, Purkinje e strati molecolari. Le cellule del gran....
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Protocollo
1. Configurazione
- Raccogli l'attrezzatura necessaria tra cui forbici di decapitazione, pinza smussata, forbici di dissezione, forbici vascolari, microspatula, matrice cerebrale di topo sagittale, lame di rasoio, punte di pipet da 200 μL, piastra di Petri di vetro, vetrino di vetro e secchiello del ghiaccio. Disadere tutte le attrezzature su un pad assorbente.
- Metti la capsula di Petri, la lastra di vetro e la matrice cerebrale sul ghiaccio.
- Utilizzando una lama di rasoio con un angolo perpendicolare, tagliare circa 5 mm dalla punta di una punta di pipetta da 200 μL. Ciò rende la dimensione dell'apertura all'estremità dell....
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Risultati
Per questi esperimenti sono stati utilizzati quattro topi femmina di tipo C57/Black6 di undici settimane. Un topo è stato utilizzato per condurre una dissezione cerebellare completa che viene definita "cervelletto di massa" e ha permesso il confronto dei livelli di RNA nelle regioni sezionate con una dissezione completa. Gli altri tre topi sono stati utilizzati per condurre la dissezione cerebellare descritta in questo protocollo. L'utilizzo di tre topi consente di garantire che le tenden.......
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Discussione
Il metodo qui descritto consente di valutare l'espressione genica sottostante e i meccanismi molecolari all'interno di quattro distinte regioni cerebellari: i nuclei cerebellari profondi (DCN), la corteccia cerebellare anteriore del verme (CCaV), la corteccia cerebellare posteriore del verme (CCpV) e la corteccia cerebellare degli emisferi (CCH). La capacità di valutare queste regioni separatamente amplierà la nostra conoscenza dell'eterogeneità di specifiche regioni cerebellari e possibilmente farà luce sul loro contrib.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo grati ad Austin Ferro e Juao-Guilherme Rosa nel laboratorio Cvetanovic per il loro aiuto nella risoluzione dei problemi delle dissezioni e nell'estrazione dell'RNA e RTqPCR. Questa ricerca è finanziata da M. Cvetanovic, R01 NS197387; | HHS National Institutes of Health (NIH).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1.5 Provette per microcentrifuga | ThermoScietific | 3456 | |
| 100% Alcool isopropilico | VWR Scienze della vita | 1106C361 | |
| 200 ul Punte di pipetta | GeneMate | P-1237-200 | |
| Matrice cerebrale di topo adulto Sagittal | Kent Scientific Corporation | RBMA-200S | |
| Pinze | |||
| Cloroformio | Macron | 220905 | |
| per decapitazione | |||
| Forbici | |||
| Alcool etilico | Pharmco | 111000200 | |
| Vetrino (per elettroforesi) | BIORAD | ||
| Omogeneizzatore | Kimble | 6HAZ6 | |
| Secchiello per | |||
| Siringa da insulina (.5ml) | BD | 329461 | |
| iScript Adv cDNA kit per RT-qPCR | BIORAD | 1725037 | |
| Micro Spatola | |||
| Ago Pinza | |||
| Piastra di Petri | Pyrex | ||
| Primetime Primer per aldolasi C | IDT Mm.PT.58>43415246 | ||
| Primer Primetime per Kcng4 | IDT | Mm.PT.56A.9448518 | |
| Primer Primetime per Parvalbumina | IDT | Mm.PT.58.7596729 | |
| Primer Primetime Rps18 | IDT | Mm.PT.58.12109666 | |
| Lame Rzor a filo singolo | Personna GEM | ||
| Pestelli sterili monouso | FisherScientific | 12141364 | |
| Reagente TRIzol | Ambion di Life technologies | 15596018 | |
| Forbici Vascolari |
Riferimenti
- Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
- Schmahmann, J. D., Caplan, D. Cognition, enotion, and the....
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Ristampe e permessi
