Articolo metodologico

Xenopus laevis Preparazione dell'estratto di uova e metodi di imaging dal vivo per la visualizzazione dell'organizzazione citoplasmatica dinamica

DOI:

10.3791/61923

⸱

6 giugno 2021

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine, 2Current Address: Department of Biological Sciences, University of Southern California, 3Department of Biochemistry, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Descriviamo un metodo per la preparazione e l'imaging dal vivo di estratti citoplasmatici non diluiti da uova di Xenopus laevis .

Abstract

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Tradizionalmente utilizzati per saggi biochimici di massa, gli estratti di uova di Xenopus laevis sono emersi come un potente strumento basato sull'imaging per lo studio di fenomeni citoplasmatici, come la citochinesi, la formazione del fuso mitotico e l'assemblaggio del nucleo. Basandosi sui primi metodi che riprendevano estratti fissi campionati in punti temporali sparsi, i recenti approcci hanno ottenuto estratti live utilizzando la microscopia time-lapse, rivelando caratteristiche più dinamiche con una risoluzione temporale migliorata. Questi metodi di solito richiedono sofisticati trattamenti superficiali del vaso di imaging. Qui introduciamo un metodo alternativo per l'imaging dal vivo di estratti di uova che non richiedono alcun trattamento chimico superficiale. È semplice da implementare e utilizza materiali di consumo di laboratorio prodotti in serie per l'imaging. Descriviamo un sistema che può essere utilizzato sia per la microscopia a campo largo che per quella confocale. È progettato per l'imaging di estratti in un campo 2-dimensionale (2D), ma può essere facilmente esteso all'imaging in 3D. È adatto per studiare la formazione di modelli spaziali all'interno del citoplasma. Con dati rappresentativi, dimostriamo la tipica organizzazione dinamica di microtubuli, nuclei e mitocondri in estratti interfasici preparati con questo metodo. Questi dati di immagine possono fornire informazioni quantitative sulla dinamica citoplasmatica e sull'organizzazione spaziale.

Introduzione

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Il citoplasma costituisce il volume principale di una cellula e ha un'organizzazione distinta. Gli ingredienti del citoplasma eucariotico possono auto-assemblarsi in una vasta gamma di strutture spaziali, come gli astri dei microtubuli e l'apparato di Golgi, che a loro volta sono disposti dinamicamente e girati a seconda dell'identità della cellula e dello stato fisiologico. Comprendere l'organizzazione spaziale del citoplasma e il suo legame con le funzioni cellulari è quindi importante per capire come funziona la cellula. Gli estratti di uova di Xenopus laevis sono stati tradizionalmente utilizzati per saggi biochimici di massa 1,2,3....

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Protocollo

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Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Stanford University.

1. Preparazione di diapositive e copertine

  1. Applicare uno strato di nastro adesivo fluorurato di etilene propilene (FEP) su un vetrino con un applicatore a rullo. Tagliare il nastro adesivo eccessivo sui bordi con una lama di rasoio pulita. Preparare i coprivetrini rivestiti con nastro FEP nello stesso modo (Figura 1A).
  2. Applicare un distanziatore di immagini adesivo fronte-retro sul lato rivestito con nastro FEP del vetrino. Lasciare la fodera protettiva sulla ....

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Risultati

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Gli estratti di uovo di Xenopus laevis possono essere utilizzati per studiare l'auto-organizzazione del citoplasma durante l'interfase. La Figura 2A mostra i risultati di un esperimento riuscito. Abbiamo integrato estratti interfasici con nuclei di spermatozoi demembranati di Xenopus laevis 19 ad una concentrazione di 27 nuclei / μL e 0,38 μM purificati GST-GFP-NLS 27,28,29,30 (proteina di fusione costituita da glutatione-S-trans.......

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Discussione

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Gli estratti di uova di Xenopus laevis sono emersi come un potente sistema modello per studi basati sull'imaging di varie strutture subcellulari 10,14,15,16,17,18,21,31,32,33,34,35,36 e organizzazione citoplasmatica nel suo complesso

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo J. Kamenz, Y. Chen e W. Y. C. Huang per i commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del National Institutes of Health (R01 GM110564, P50 GM107615 e R35 GM131792) assegnate a James E. Ferrell, Jr.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta da centrifuga da 17 mlBeckman Coulter337986
22x22 mm quadrato #1 vetro di coperturaCorning284522
AprotininaMilliporeSigma10236624001Inibitore della proteasi
CicloesimideMilliporeSigma01810Inibitore della sintesi proteica
Citocalasina BMilliporeSigmaC6762Actina inibitore della polimerizzazione
Femmina Xenopus laevis raneNascoLM00535MX
Fluorescent HiLyte 488 marcato con proteina tubulinaCytoskeleton, Inc.TL488M-APer la visualizzazione del citoscheletro dei microtubuli
Fluorescente HiLyte 647 marcato con proteina tubulinaCytoskeleton, Inc.TL670M-APer la visualizzazione del citoscheletro dei microtubuli
Etilene propilene fluorurato (FEP) nastro otticamente trasparenteCS Hyde company23-FEP-2-5
Pipetta Pasteur in vetroFisher Scientific13-678-20C
Gonadotropina corionica umana (hCG)MilliporeSigmaCG10
Distanziatore di imagingMicroscopia elettronica Scienze70327-8S
LeupeptinMilliporeSigma11017101001Inibitore della proteasi Vetrini
microscopioFisher Scientific12-518-100B
Olio mineraleMilliporeSigma330760
MitoTracker Rosso CMXRosThermo Fisher ScientificM7512Per la visualizzazione dei mitocondri
Gonadotropina sierica della cavalla gravida (PMSG)BioVendorRP1782725000
Applicatore a rulloAmazonB07HMBJSP8Per applicare il nastro FEP ai vetrini e ai vetrini coprioggetti
Lamette da barba a taglio singoloFisher Scientific12-640Per rimuovere l'eccesso di nastro FEP
Pipetta di trasferimentoFisher Scientific13-711-7M
per

Riferimenti

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  1. Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin synthesis drives the early embryonic cell cycle. Nature. 339 (6222), 275-280 (1989).
  2. Dunphy, W. G., Brizuela, L., Beach, D., Newport, J. The Xenopus cdc2 protein is a component of MPF, a cytoplasmic regulator of mitosis. Cell. 54

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Tag

Estratto di uova di XenopusPassivazione con nastro FEPMicroscopia time lapseConfocale a campo largoFormazione di pattern spazialiDinamica dei microtubuliPartizionamento mitocondriale

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