Qui viene presentato un protocollo per fornire oligonucleotidi come RNA a piccola interferenza (siRNA), imitazioni di micro-RNA (miR) o anti-micro-RNA (anti-miR) in adipociti maturi per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA.
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Articolo metodologico
Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'alterazione della funzione degli adipociti contribuisce alla patogenesi delle malattie metaboliche tra cui il diabete di tipo 2 e l'insulino-resistenza. Ciò evidenzia la necessità di comprendere meglio il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione degli adipociti per sviluppare nuove terapie contro le malattie legate all'obesità. Modulare l'espressione di proteine e micro-RNA negli adipociti rimane molto impegnativo. Questo articolo descrive un protocollo per differenziare i fibroblasti murini in adipociti maturi e per modulare l'espressione di proteine e micro-RNA negli adipociti maturi attraverso la trasfezione inversa utilizzando oligonucleotidi a RNA a interferenza piccola (siRNA) e micro-RNA che imitano (miR mimic). Questo protocollo di trasfezione inversa prevede l'incubazione del reagente di trasfezione e degli oligonucleotidi per formare un complesso nella piastra di coltura cellulare a cui vengono aggiunti gli adipociti maturi. Gli adipociti sono quindi autorizzati a riattaccarsi alla superficie della piastra aderente in presenza del complesso oligonucleotidi/reagente di trasfezione. Analisi funzionali come lo studio della segnalazione dell'insulina, dell'assorbimento del glucosio, della lipogenesi e della lipolisi possono essere eseguite sugli adipociti maturi 3T3-L1 trasfetti per studiare l'impatto della manipolazione di proteine o micro-RNA sulla funzione degli adipociti.
Introduzione
L'obesità è considerata un importante fattore di rischio per numerose malattie metaboliche, tra cui la resistenza all'insulina (IR), il diabete di tipo 2 (T2D) e le malattie cardiovascolari1. Le terapie attuali non sono riuscite a fermare la prevalenza in costante aumento di queste malattie e la gestione dell'IR di pazienti obesi e diabetici rimane un importante problema clinico. Il tessuto adiposo svolge un ruolo cruciale nel controllo dell'omeostasi energetica e la sua espansione patologica durante l'obesità contribuisce allo sviluppo di IR e T2D2,3. Ciò evidenzia la necessità di comprendere meglio il meccanismo molecolare coinvolto nella disfunzione degli adipociti per sviluppare nuove terapie contro le malattie legate all'obesità. Molti studi di ricerca hanno studiato il ruolo degli RNA codificanti proteine nella fisiologia degli adipociti e la loro associazione con l'obesità.
Più recentemente, la scoperta di RNA non codificanti (ncRNA), in particolare micro-RNA (miR), ha forgiato nuovi concetti relativi al meccanismo di regolazione dei programmi di espressione genica. Gli studi hanno dimostrato che gli ncRNA sono importanti regolatori della funzione degli adipociti e che la loro disregolazione svolge un ruolo importante nelle malattie metaboliche4. Pertanto, la manipolazione di proteine e ncRNA negli adipociti è cruciale per decifrare il loro ruolo nella funzione degli adipociti e il loro impatto su patologie come il T2D. Tuttavia, manipolare l'espressione di proteine e ncRNA in vivo e negli adipociti primari rimane molto impegnativo, favorendo l'uso di modelli di adipociti in vitro.
I fibroblasti murini 3T3-L1 si differenziano facilmente in adipociti maturi, funzionali e insulino-responsi, che sono una linea cellulare ben caratterizzata utilizzata per studiare la funzione degli adipociti (ad esempio, segnalazione di insulina, assorbimento di glucosio, lipolisi e secrezione di adipochine)5,6,7,8,9,10. Queste proprietà rendono gli adipociti 3T3-L1 un modello interessante per modulare l'espressione di proteina-codifica e nc-RNA per decifrare il loro ruolo nella funzione degli adipociti e il loro potenziale ruolo nelle malattie legate all'obesità. Sfortunatamente, mentre i fibroblasti 3T3-L1 sono facili da trasfettare utilizzando reagenti disponibili in commercio, gli adipociti 3T3-L1 differenziati sono una delle linee cellulari più difficili da trasfettare. Questo è il motivo per cui numerosi studi che manipolano l'espressione genica nelle cellule 3T3-L1 si sono concentrati sulla differenziazione degli adipociti piuttosto che sulla funzione degli adipociti.
Per molto tempo, l'unica tecnica efficiente per trasfezionare gli adipociti è stata l'elettroporazione5, che è noiosa, costosa e può causare danni alle cellule. Questo documento riporta una tecnica di trasfezione inversa che utilizza un reagente di trasfezione comune, che riduce il tempo pratico per la trasfezione, non ha alcun effetto sulla vitalità cellulare ed è molto meno costoso dell'elettroporazione. Questo protocollo è perfettamente adatto per la trasfezione di siRNA e altri oligonucleotidi come i micro-RNA mimics (miR mimics) e anti-miRs. Il principio del protocollo di trasfezione inversa è quello di incubare il reagente di trasfezione e gli oligonucleotidi per formare un complesso nella piastra di coltura cellulare e quindi seminare gli adipociti maturi nei pozzetti. Quindi, gli adipociti si riattaccano alla superficie della piastra aderente in presenza del complesso oligonucleotidi/reagente di trasfezione. Questa metodologia semplice, efficiente e poco costosa consente di studiare il ruolo degli RNA e dei miR codificanti proteine nella funzione degli adipociti e il loro potenziale ruolo nelle malattie legate all'obesità.
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Protocollo
NOTA: Utilizzare tecniche sterili per eseguire tutte le fasi del protocollo in una cappa di coltura cellulare a flusso laminare. Vedere tabella dei materiali per i dettagli su tutti i reagenti e le apparecchiature.
1. Differenziazione dei fibroblasti murini 3T3-L1 in adipociti
- Coltivare i fibroblasti 3T3-L1 in piatti da 100 mm in DMEM medio di coltura senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% siero di vitello neonato e 1% di penicillina e streptomicina (Figura 1A). Posizionare i piatti in un incubatore di colture tissutali (7% CO2 e 37 °C).
- Due giorni dopo la confluenza, cambiare il terreno di coltura, sostituendo con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% di siero fetale di vitello (FCS) e 1% di penicillina e streptomicina integrate con 0,25 mM di 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 0,25 μM di desametasone, 5 μg/ml di insulina e 10 μM di rosiglitazone.
NOTA: Ci vogliono 5 giorni per raggiungere la confluenza quando le cellule vengono seminate a 300.000 cellule per piatto da 100 mm. - Due giorni dopo, sostituire il terreno di coltura con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina integrati con 5 μg / mL di insulina e 10 μM di rosiglitazone e incubare per 2 giorni. Quindi, nutrire le cellule ogni 2 giorni con DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina (Figura 1B).
- Trasfettate gli adipociti 3T3-L1 7-8 giorni dopo l'inizio del protocollo di differenziazione.
NOTA: È importante raggiungere un alto livello di differenziazione (>80%) prima della trasfezione per evitare la proliferazione dei fibroblasti rimanenti dopo la trasfezione, che porterebbe a una popolazione mista di cellule che potrebbe influenzare i risultati.
2. Preparazione di piastre precoate
- Il giorno prima o poche ore prima della trasfezione, preparare una soluzione di collagene di tipo I a 100 μg/mL in etanolo al 30% da una soluzione stock a 1 mg/mL. Aggiungere 250 μL di collagene per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti e 125 μL per pozzetti di una piastra a 24 pozzetti e distribuire la soluzione sulla superficie del pozzo.
- Lasciare il piatto senza il coperchio sotto il cappuccio della coltura fino a quando il collagene si asciuga. Lavare due volte con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS).
NOTA: le piastre precoate sono disponibili per l'acquisto.
3. Preparazione della miscela di trasfezione
NOTA: La concentrazione finale di siRNA è compresa tra 1 e 100 nM (da 1 a 100 pmol di siRNA per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti). La concentrazione finale del miR mimic è 10 nM (10 pmol/pozze). Determinare la migliore concentrazione di ciascun siRNA, miR mimic o altro oligonucleotide prima di iniziare l'esperimento per evitare effetti fuori bersaglio. Eseguire esperimenti di trasfezione in triplice copia per facilitare l'analisi statistica dei risultati. Preparare tutti i reagenti in eccesso per tenere conto della normale perdita durante il pipettaggio.
- Mescolare mediante pipettaggio (volume/volume) il siRNA (o altri oligonucleotidi) con minimale essenziale migliorato (Tabella 1). Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere il reagente di trasfezione e il minimal essential medium migliorato al siRNA e il pipetto da miscelare (Tabella 1). Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (durante questo periodo, procedere al paragrafo 4). Aggiungere la miscela di trasfezione a ciascun pozzo della piastra rivestita di collagene.
4. Preparazione degli adipociti 3T3-L1
- Lavare le celle nella capsula di Petri da 100 mm due volte con D-PBS. Aggiungere 5x tripsina alle cellule (1 mL per piatto da 100 mm), assicurandosi di coprire tutta la superficie con la tripsina. Attendere 30 s e rimuovere con attenzione la tripsina.
- Incubare la capsula di Petri per 5-10 minuti a 37 °C nell'incubatrice. Toccare la parabola da 100 mm per staccare le celle.
- Aggiungere 10 ml di DMEM senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina per neutralizzare la tripsina. Pipettare con cura il mezzo su e giù per staccare le cellule e omogeneizzare la sospensione cellulare.
- Contare le cellule utilizzando una camera di conteggio Malassez o un contatore di celle automatizzato e regolare la concentrazione delle cellule a 6,25 x 105 celle / mL di mezzo. Seminare 800 μL della sospensione/pozzetti cellulare di una piastra a 12 pozzetti (5 x 105 cellule) o 400 μl della sospensione/pozzettino cellulare di una piastra a 24 pozzetti (2,5 x 105 cellule) contenente la miscela di trasfezione.
NOTA: Una capsula di Petri da 100 mm di adipociti consentirà la preparazione di una piastra da 12 pozzetti o di una piastra da 24 pozzetti. Un piatto da 100 mm di solito contiene 6-7 x10 6 adipociti, che corrispondono a 5 x10 5 adipociti per pozzetti di una piastra a 12 pozzetti. - Incubare le piastre in un incubatore di colture cellulari (7% CO2 e 37 °C) e non disturbare le cellule per 24 ore. Il giorno successivo, sostituire con cura il surnatante con DMEM fresco senza piruvato, 25 mM di glucosio, 10% FCS e 1% di penicillina e streptomicina.
NOTA: È anche possibile seminare le cellule in piastre a 48 e 96 pozzetti precoate di collagene, ma prendere maggiori precauzioni quando si sostituisce il mezzo per evitare il distacco degli adipociti.
5. Analisi funzionale di adipociti 3T3-L1 trasfettato
- Target di studio knockdown 24-48 h e 48-96 h dopo siRNA o miR mimic delivery per mRNA e proteine, rispettivamente.
- Eseguire analisi funzionali degli adipociti trasfetti per studiare la segnalazione dell'insulina, l'assorbimento del glucosio, la secrezione di adipochine, la lipolisi e la lipogenesi.
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Risultati
Utilizzando la procedura di reverse-transfection qui descritta per modulare l'espressione di proteine o micro-RNA negli adipociti 3T3-L1, gli adipociti hanno dimostrato di preservare la loro morfologia dopo la trasfezione (Figura 1B,C). Infatti, 2 giorni dopo la trasfezione, gli adipociti erano ben diffusi e attaccati alla piastra e presentavano goccioline lipidiche multiloculari che sono una caratteristica degli adipociti 3T3-L1 maturi. Il c...
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Discussione
Questo documento presenta un protocollo dettagliato per la differenziazione e la trasfezione di adipociti maturi. Questo metodo di trasfezione inversa è un metodo semplice, economico e altamente efficiente per trasfettare oligonucleotidi come, ma non solo, siRNA, imitazioni di micro-RNA e anti-micro-RNA in adipociti 3T3-L1, che è una delle linee cellulari più difficili da trasfettare. Questo metodo ha alcune limitazioni che devono essere considerate. Questo protocollo non è efficiente per la trasfezione con DNA plasmidic...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dall'INSERM, dall'Université Côte d'Azur e dall'Agenzia Nazionale francese per la ricerca (ANR) attraverso il programma Investimenti per il futuro Laboratorio di Eccellenza (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) e Initiative of Excellence (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001). J.J. è sostenuta da sovvenzioni della Société Francophone du Diabète (SFD), dell'Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), dell'Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) e della Fondation Benjamin-Delessert. J.G. è supportato da ANR-18-CE14-0035-01. J-F.T. è sostenuta dalla sovvenzione ANR ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 e da una sovvenzione della Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, DEQ20180839587). Ringraziamo anche l'Imaging Core Facility di C3M finanziato dal Conseil Départemental des Alpes-Maritimes e dalla Région PACA, che è anche supportato dalla GIS IBiSA Microscopy and Imaging Platform Côte d'Azur (MICA).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra per coltura tissutale a 12 pozzetti | Dutscher | 353043 | |
| 2,5% di tripsina (10x) | Gibco | 15090-046 | diluita a 5x con D-PBS |
| 2-propanolo | Sigma | I9516 | |
| 3-isobutil-1-metilxantina | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Non-targeting Pool | Horizon Discovery | D-001910-10-05 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Collagene di tipo I da pelle di vitello | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Medium Eagles's Medium (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4,5 g/L di D-glucosio; L-glutammina; no Piruvato |
| Etanolo | Sigma | 51976 | |
| negativo marcato con FAM si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetale Siero bovino | Gibco | 10270-106 | |
| Reagente glicerolo libero | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Soluzione standard di glicerolo | Anticorpo | ||
| HSP90 | Santa Cruz | sc-131119 | Diluizione : 0,5 & micro; g/mL |
| Terreno minimo essenziale migliorato (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| Insulina, umano ricombinante | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN micro-RNA imita Horizon | Discovery | ||
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| miScript II RT Kit | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Saggi Hs_RNU6-2_11 | Saggi Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 219073 | |
| Siero per vitelli neonati | Gibco | 16010-159 | |
| Olio rosso O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Scoperta | L-056623-01-0005 | |
| Penicillina e streptomicina | Gibco | 15140-122 | |
| Anticorpo perilipina-1 | Segnalazione cellulare | 3470 | Diluizione: 1/1000 |
| Piastra di Petri 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB anticorpo | Segnalazione cellulare | 9272 | Diluizione: 1/1000 |
| PKB Phospho Thr308 | anticorpo Cell Segnalazione | 9275 | Diluizione : 1/1000 |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Reagente di trasfezione (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| &alfa;-tubulina anticorpo | Sigma aldrich | T6199 | Diluizione : 0,5 &; g/mL |
| Vamp2 anticorpo | R& Sistemi D | MAB5136 | Diluizione : 0,1 µ g/mL |
Riferimenti
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