Articolo metodologico

Sintesi di pirazolo dipendente dal pH, imidazolo e fluorofori di Isoindolone Dipyrrinone usando un approccio di condensazione claisen-schmidt

5.2K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/61944

⸱

10 giugno 2021

 ,  , 
1Department of Physical and Life Sciences, Nevada State College, 2Department of Humanities, Nevada State College

In questo articolo

Sommario

La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt è una metodologia importante per la generazione di composti aromatici biciclici coniugati colma di metina. Utilizzando una variante mediata dalla base della reazione aldola, è possibile accedere a una gamma di molecole fluorescenti e/o biologicamente rilevanti attraverso un approccio sintetico generalmente economico e operativamente semplice.

Abstract

I composti aromatici biciclici coniugati colma di metina sono costituenti comuni di una serie di molecole biologicamente rilevanti come porfirine, dipirrinones e prodotti farmaceutici. Inoltre, la rotazione limitata di questi sistemi spesso si traduce in sistemi altamente o moderatamente fluorescenti come osservato in 3H,5H-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f]pirimidina-3-uno, xantoglow, analoghi pirroloindolizinedione, analoghi BODIPY e sistemi ad anello fenolici e imidazolinone di Green Fluorescent Protein (GFP). Questo manoscritto descrive un metodo economico e operativamente semplice per eseguire una condensazione claisen-schmidt per generare una serie di analoghi diapirrinone dipendenti dal pH fluorescente. Mentre la metodologia illustra la sintesi degli analoghi dipirrinone, può essere tradotta per produrre una vasta gamma di composti aromatici biciclici coniugati. La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt utilizzata in questo metodo è limitata nell'ambito ai nucleofili e agli elettrofili che sono enolabile in condizioni di base (componente nucleofila) e aldeidi non enoluibili (componente elettrofilo). Inoltre, sia i reagenti nucleofili che elettrofili devono contenere gruppi funzionali che non reagiscano inavvertitamente con idrossido. Nonostante queste limitazioni, questa metodologia offre l'accesso a sistemi completamente nuovi che possono essere utilizzati come sonde biologiche o molecolari.

Introduzione

Un certo numero di sistemi biciclici coniugati, in cui due anelli aromatici sono collegati da un ponte monometina, subiscono l'isomerizzazione tramite rotazione del legame, quando eccitati con un fotone(Figura 1A)1,2,3,4,5. L'isomero eccitato si rilasserà generalmente allo stato del suolo attraverso processi di decadimento nonradiativi 6. Se la barriera energetica alla rotazione del legame è aumentata in misura sufficiente, è possibile limitare o prevenire la fotoisomerizzazione. Invece, l'eccitazione fotonica si traduce in uno stato di singoletto eccitato che spesso si rilassa attraverso la fluorescenza piuttosto che il decadimento non radiativo (Figura 1B). La fotoisomerizzazione restrittiva è più comunemente realizzata limitando meccanicamente la rotazione del legame attraverso il collegamento dei due sistemi di anelli aromatici mediante collegamenti covalenti, bloccando così la molecola in un particolare stato isorico. Questo approccio è stato utilizzato per creare diversi analoghi fluorescenti triciclici dipirirolo e dipirolemetano come: 3H,5H-dipirrolo[1,2-c:2',1'-f]pirimidina-3-uno (1), xanthoglows (2)6,7, analoghi pirroloindolizinedione (3)8e analoghi BODIPY 9 (4 , Figura 2) in base ai quali i sistemi ad anello di pirrolidina e/o pirrolole sono reticolati con metilene, carbonile, o linker difluoro al boro. Tipicamente, 1-4 possiedono ΦF > 0,7 suggerendo che questi sistemi sono molto efficienti come unità di fluoroforo.

È anche possibile limitare la fotoisomerizzazione attraverso mezzi diversi dal collegamento covalente dei sistemi ad anello. Ad esempio, gli anelli fenolici e imidazolinone (Figura 2) della proteina fluorescente verde (GFP) sono limitati alla rotazione da parte dell'ambiente proteico; l'impostazione restrittiva aumenta la resa quantica di tre ordini di grandezza rispetto alla stessa unità di cromoforo nella soluzione libera10. Si ritiene che l'impalcatura proteica della GFP fornisca una barriera rotazionale attraverso effetti sterici ed elettrostatici11. Recentemente, il nostro gruppo in collaborazione con il gruppo Odoh dell'Università del Nevada, Reno ha scoperto un altro sistema a fluoroforo che presenta una somiglianza strutturale con i sistemi xanthoglow a base di dipirrinone (Figura 2)12. Questi analoghi dipirrinone, tuttavia, differiscono dal sistema xanthoglow in quanto i legami idrogeno intramolecolari, piuttosto che legami covalenti, scoraggiano la fotoisomerizzazione e si traducono in un sistema biciclico fluorescente. Inoltre, gli analoghi pirazolo, imidazolo e isoindolone dipirrinone possono legare idrogeno in stati protonati e deprotonati; la deprotonazione si traduce nello spostamento verso il rosso delle lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione, probabilmente a causa di un cambiamento nella natura elettronica del sistema. Mentre è stato riferito che l'legame idrogeno aumenta le rese quantistiche attraverso una rotazione limitata13,14, 15,16, non siamo a conoscenza di nessun altro sistema di fluoroforo in cui l'isomerizzazione limitata serve come modalità di fluorescenza sia negli stati protonati che deprotonati della molecola. Pertanto, questi fluorofori di dipirrinone dipendenti dal pH sono unici in questo senso.

In questo video, ci concentriamo sulla sintesi e caratterizzazione chimica della serie analogica fluorescente dipyrrinone. In particolare, c'è un'enfasi posta sulla metodologia di condensazione claisen-schmidt che è stata utilizzata per costruire la serie completa di analoghi fluorescenti. Questa reazione si basa sulla generazione di uno ione enolato vinilegoo mediato in base che attacca un gruppo di aldeide, per produrre un alcol che successivamente subisce l'eliminazione. Per la serie analogica del dipirrinone, un pirrolinone/isoindolone viene convertito in un enolato per facilitare un attacco ad un gruppo di aldeidi attaccato ad un anello di pirazolo o imidazolo(Figura 3); dopo l'eliminazione si forma un sistema biciclico completamente coniugato, collegato da un ponte di metina. È degno di nota che l'intera serie di analoghi dipyrrinone possa essere costruita con materiali commerciali prontamente disponibili e possa essere prodotta in una singola sequenza di reazione a un vaso tipicamente in rese da moderate a alte (le rese vanno da circa il 50-95%). Poiché la maggior parte degli analoghi del dipirrinone sono di natura altamente cristallina, è necessaria pochissima purificazione al di fuori delle condizioni di lavoro standard per produrre campioni analiticamente puri. Di conseguenza, questo sistema a fluoroforo richiede solo pochi passaggi per accedere da materiali commerciali prontamente disponibili e può essere sintetizzato, purificato e preparato per studi analitici o biologici in un lasso di tempo relativamente breve.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

1. Procedura generale per la sintesi degli analoghi di dipirrinone 16-25

  1. Sciogliere il pirrolinone/isoindolone (1,00 mmol) e il corrispondente aldeide pirazolo/imidazolo (1,00 mmol) in 5,0 ml di etanolo in un pallone a fondo tondo.
  2. Aggiungere koh acquoso (24,0 mmol, 10 M, 2,40 mL) al pallone in una porzione.
  3. Mescolare e reflusso la miscela fino a quando il completamento della reazione non è confermato da TLC (vedere la tabella 1 per un elenco dei tempi di reazione). È stato usato un eluente TLC del 10% di metanolo nel diclorometano e gli analoghi sono stati osservati possedere valori Rf nell'intervallo da 0,62 a 0,86 o intorno a esso. Applicare una quantità sufficiente di grasso sottovuoto o utilizzare un manicotto PTFE all'interfase dei giunti di vetro per evitare che il vetro del condensatore e il pallone a fondo tondo si sequestrano ad alte temperature e condizioni di base.
  4. Lasciare raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente ed evaporare i volatili a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
  5. Raffreddare la miscela di reazione a 0 °C utilizzando un bagno di ghiaccio.
  6. Neutralizzare la miscela oleosa rimanente aggiungendo acido acetico (30,0 mmol, 1,70 mL) in una porzione.
  7. Purificare il materiale prodotto risultante utilizzando la filtrazione sottovuoto (vedere fase 2a, per i composti: 17, 18, 20-22, 24 e 25) o utilizzare l'estrazione liquido-liquido/ cromatografia a colonna (vedere fase 2b, per i composti: 16, 19 e 23).

2. Purificazione della procedura

  1. tramite filtrazione sottovuoto
    1. Montare un imbuto Hirsch su un pallone laterale utilizzando un adattatore in gomma montato.
    2. Applicare un pezzo di carta filtrante rotonda sull'imbuto Hirsch e bagnare leggermente utilizzando acqua deionizzata per consentire l'aderenza all'imbuto.
    3. Collegare una sorgente di vuoto al braccio laterale del pallone e assicurarsi che vi sia una tenuta sottovuoto sufficiente assicurandosi che nessuna delle vetrerie possa essere smontata durante il vuoto.
    4. Versare il pallone contenente il prodotto cristallizzato sul filtro sottovuoto e lasciare filtrare. Risciacquare i cristalli con 10 mL di acqua deionizzata ghiacciata.
    5. Lasciare che i cristalli filtrati continuino ad asciugarsi sopra la carta filtrante, pur essendo ancora collegati alla fonte di vuoto, a seguito della filtrazione di tutti i liquidi.
    6. Raccogliere i cristalli filtrati e posizionarli in un pallone a fondo rotondo da 25 ml.
    7. Collegare il pallone a fondo tondo a un adattatore di linea di giunto/vuoto in vetro macinato fritte. Fissare l'unione del giunto in vetro con una clip di keck.
    8. All'estremità a coste dell'adattatore di linea ad alto vuoto in vetro, attaccare una linea sottovuoto che viene instradata a una pompa ad alto vuoto e raffreddare adeguatamente una trappola per vuoto (utilizzando refrigerante come azoto liquido o ghiaccio secco / acetone) per condensare eventuali materiali volatili che possono evaporare dal materiale cristallino. Accendere la pompa ad alto vuoto per garantire la completa evaporazione di eventuali tracce di solvente rimanente dai cristalli.
    9. Lasciare asciugare i cristalli sotto vuoto alto per un minimo di 1 h. Rimuovere il pallone a fondo tondo dalla linea/adattatore sottovuoto, spegnere la pompa per vuoto alta e pulire la trappola per vuoto.
  2. Purificazione della procedura tramite cromatografia a colonna
    1. Diluire il contenuto della miscela di reazione trattata con acido acetico (dal passo 1.6) con 10 mL di acqua deionizzata e trasferirlo in un imbuto separatore. Aggiungere 10 mL di diclorometano all'imbuto separatore. Agitare delicatamente e sfiatare l'imbuto separatorio per separare i due strati.
    2. Estrarre lo strato acquoso utilizzando porzioni successive di diclorometano (3 x 5 mL). Unire le frazioni organiche e asciugare utilizzando anidro Na2SO4. Decantare e rimuovere tutti i volatili a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
    3. Diluire il residuo ottenuto dal punto 2.2.2. con 5 mL di CH2Cl2. Eseguire la cromatografia a colonna flash utilizzando circa 75 g di gel di silice. Elute il campione con una soluzione di 10% di metanolo in diclorometano.
    4. Rimuovere le frazioni raccolte di solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante. Trasferire il residuo solido in un pallone a fondo tondo da 25 ml utilizzando circa 10 ml di CH2Cl2. Rimuovere il solvente a pressione ridotta utilizzando un evaporatore rotante.
    5. Essiccare il residuo solido rimanente sotto vuoto elevato, come descritto in precedenza nei passaggi da 2.1.7 a 2.1.9.

3. Acquisizione dell'asoptività molare e UV/Vis pKa Studi per analoghi 16-25

  1. Creare soluzioni di stock composto per spettrofotometria UV/Vis per analoghi 16 - 25.
    1. Pesare 10 μmol dell'analogo dipirrinone selezionato (16 - 25) e aggiungerlo a un pallone volumetrico da 10 ml.
    2. Aggiungere DMSO al segno da 10,0 ml sul pallone volumetrico.
      NOTA: Se il composto non si dissolve completamente, riscaldare il pallone usando una pistola termica e agitare il pallone in base alle esigenze per sciogliere completamente il composto.
  2. Creare soluzioni saline tamponate con fosfato (PBS) a vari livelli di pH. Gli analoghi erano caratterizzati in buffer PBS che andavano in pH da circa 4 a 15.
    1. Utilizzando un cilindro volumetrico da 1 L, creare 1 L di soluzione di materiale PBS diluire 100 mL di PBS (x100) in 900 mL di acqua deionizzata.
    2. Trasferire 50 mL della soluzione di scorta PBS preparata (fase 3.2.1) su un becher da 100 mL e aggiungere una barra di agitazione magnetica. Quindi, utilizzando un misuratore di pH calibrato per monitorare le variazioni del pH, titolare il buffer PBS con un acquoso NaOH da 1,0 M (per ottenere buffer con pH > 7.0) o 1,0 M HCl (per ottenere buffer con pH < 7.0).
      NOTA: Per ottenere dati che si trattenano in una curva di titolazione ben definita, si consiglia di generare buffer di pH in incrementi di 0,1 unità di pH entro ± 0,5 del punto di flessione previsto e incrementi di 0,5 al di fuori del punto di flessione previsto.
  3. Acquisire spettri di asottabilità molare per analoghi 16 - 25 in soluzioni PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH (pH 14.0).
    1. Preparare una cuvetta di quarzo "vuota" utilizzando una cuvetta di quarzo pulita e asciutta, quindi aggiungere 2,0 mL di soluzione di materiale PBS (pH 7.0) o acquosa naoh da 1,0 M alla cuvetta utilizzando una micropipetta da 100 a 1000 μL.
      NOTA: È importante per l'integrità del processo di acquisizione dei dati della soluzione vuota assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella soluzione di cuvetta e pulire accuratamente i lati della cuvetta con una salvietta Kim per evitare la dispersione della luce risultante da polvere o detriti all'esterno della cuvetta. Se le bolle persistono, toccare delicatamente e ripetutamente la cuvetta su un tovagliolo di carta posato su una superficie dura.
    2. Utilizzando uno spettrofotometro UV/Vis, spegnete la soluzione selezionata per un intervallo da 200 a 800 nm.
    3. In una seconda cuvetta di quarzo pulita e secca aggiungere 2,00 mL di PBS (pH 7.0) o 1,0 M NaOH (pH 14) seguito da 10 μL della soluzione di stock analogica dipyrrinone (16 - 25) (vedere fase 3.1) con una micropipetta da 5-50 μL. Posizionare un tappo sulla cuvetta e agitare bene oltre a invertire la cuvetta.
      NOTA: È importante per l'integrità del processo di acquisizione dei dati della soluzione campione assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella soluzione di cuvetta e pulire accuratamente i lati della cuvetta con una salvietta Kim per evitare la dispersione della luce risultante da polvere o detriti all'esterno della cuvetta. Se le bolle persistono, toccare delicatamente e ripetutamente la cuvetta su un tovagliolo di carta posato su una superficie dura.
    4. Utilizzando lo spettrofotometro UV/Vis, acquisire uno spettro di assorbimento per la soluzione analogica dipyrrinone per un intervallo di 200 - 800 nm.
    5. Alla stessa cuvetta aggiungere altri 10 μL della soluzione di stock analogico di dipirrinone e ripetere i passaggi 3.3.3 e 3.3.4.
    6. Ripetere il passaggio 3.3.5 fino a quando un totale di 50 μL di soluzione di stock analogico di dipirrinone è stato aggiunto alla cuvetta al fine di acquisire almeno cinque punti dati della lunghezza d'onda di eccitazione. Ripetere i passaggi da 3.3.1 a 3.3.6 fino a ottenere tutte le soluzioni stock da 16 a 25 sia in PBS (pH 7.0) che in 1.0 M NaOH.
  4. Ottenere valori di asoptività molare per 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH utilizzando l'analisi di regressione lineare best fit.
    1. Utilizzando un programma di grafica come GraphPad Prism 7, traccia l'assorbanza misurata (asse y) rispetto alla concentrazione analogica del dipirrinone (asse x). Create un'analisi di regressione lineare più adatta per i cinque punti tracciati. Si dovrebbe osservare una relazione lineare e l'analisi statistica dovrebbe mostrare un valore R2 ≥ 0,98.
    2. Ripetere il passaggio 3.4.1 per gli analoghi 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH.
    3. Calcola l'asoptività molare per 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH usando il valore di pendenza estrapolato dalla curva lineare più adatta.
  5. Determinare il pKcon valori di 16 - 25 studi utilizzando la spettrofotometria UV/Vis
    1. In una cuvetta di quarzo pulita e asciutta, trasferire 1.900 μL del tampone PBS al livello di pH selezionato (preparato nel passaggio 3.2) utilizzando una micropipetta da 100 a 1000 μL.
      NOTA: Abbiamo notato al momento della conservazione che un precipitato bianco può formarsi in alcuni dei buffer. Per assicurarsi che il tampone sia completamente omogeneo e se è visibile un precipitato, utilizzare la filtrazione gravitazionale per rimuovere qualsiasi precipitato immediatamente prima dell'uso. Vedere la nota dopo il passaggio 3.3.1.
    2. Utilizzando lo spettrofotometro UV/Vis, spegnete la soluzione tampone PBS selezionata per un intervallo di 200-800 nm.
    3. In una seconda cuvetta al quarzo pulita e asciutta, trasferire 1.900 μL del tampone PBS selezionato, quindi aggiungere 100 μL della soluzione di stock analogico selezionata utilizzando una micropipetta da 5-50 μL. Posizionare un tappo sulla cuvetta e agitare bene oltre a invertire la cuvetta.
      NOTA: Vedere la nota precedente dopo il passaggio 3.3.3.
    4. Utilizzando lo spettrofotometro UV/Vis, acquisire lo spettro di assorbimento per l'analogo dipyrrinone per un intervallo di 200 - 800 nm.
    5. Ripetere i passaggi da 3.5.1 a 3.5.4 per 16 - 25 in ciascuno dei buffer PBS generati nel passaggio 3.2.
  6. Determinare il pKdi un valori per 16 - 25 utilizzando una funzione di raccordo a curva sigmoidale più adatta.
    1. Utilizzando un programma di grafo, grafare l'assorbanza misurata rispetto alla lunghezza d'onda (nm) per 16 - 25 ai vari livelli di pH.
    2. Scegli una lunghezza d'onda compresa tra 380-415 nm dove a livelli di pH più bassi (< 7.0) l'assorbanza è piccola (0-0,1 unità) e a una maggiore assorbanza di pH (> 12,0) è considerevolmente maggiore (0,8-1,0 unità). Traccia l'assorbanza alla lunghezza d'onda scelta rispetto al pH.
    3. Utilizzando una funzione di curva sigmoidale, generare una curva di adattamento migliore per ciascuno degli analoghi 16 - 25. Segnalare il pH estrapolato a mezza altezza della curva. Questo è il valore pKsegnalato.

4. Acquisizione della resa quantistica e studi sulla fluorescenza

  1. Creare soluzioni di stock di studio a fluorescenza per analoghi dipirrinone 16 - 18 e 20 - 25.
    1. Utilizzando una soluzione di stock analogico dipyrrinone creata nel passaggio 3.1, eseguire una diluizione della soluzione stock aggiungendo 10 μL della soluzione stock a un pallone volumetrico da 1 ml utilizzando una micropipetta da 2 a 20 μL, quindi aggiungere il buffer PBS (pH 7.0) al marchio da 1 ml. Posizionare un tappo sul pallone volumetrico e mescolare bene invertendo e scuotendo il pallone. Questa soluzione di stock diluita verrà utilizzata per generare gli spettri di fluorescenza e sarà definita soluzione di stock di fluorescenza.
    2. Ripetere il passaggio 4.1.1 per gli analoghi 16 - 18 e 20 - 25.
  2. Acquisire spettri di emissione di fluorescenza a concentrazioni variabili, per analoghi 16 - 18 e 20 - 25. Per tutti gli analoghi diversi da 18, acquisire cinque spettri per ogni analogico in soluzioni di pH 7 e 14 a concentrazioni di: 19.96, 39.84, 59.64, 79.37 e 99.01 nM. Per l'analogico 18, acquisire cinque spettri in una soluzione di pH 7 a concentrazioni di: 49,75, 99,01, 147,8, 196,1 e 243,9 nM. In una soluzione di pH 14, acquisire cinque spettri per analogico 18 a concentrazioni di: 99.01, 196.1, 291.3, 384.6, 476.2 nM.
    1. In una cuvetta al quarzo trasparente a quattro lati, aggiungere 3,00 mL di PBS (pH 7.0) o 1,0 NaOH utilizzando una micropipetta da 100 -1.000 μL in tre incrementi di 1.000 μL.
      NOTA: Vedere nota dopo il passaggio 3.3.1.
    2. Utilizzando il fluorometro e il programma software fluorometro FluorEssence, acquisire uno spettro di emissione per la soluzione selezionata ed etichettarlo come la soluzione "vuota".
    3. Alla stessa cuvetta aggiungere 6 μL di soluzione di fluorescenza per l'analogo di dipirrinone selezionato (Parte 4.1) utilizzando una micropipetta da 0,5-10 μL. Posizionare il cappuccio sulla cuvetta e mescolare bene invertendo e scuotendo delicatamente la cuvetta.
      NOTA: Vedere nota dopo il passaggio 3.3.3.
    4. Usando il fluorometro, acquisire uno spettro di emissione per la soluzione composta selezionata usando λmax abs come lunghezza d'onda di eccitazione. L'intensità di eccitazione è stata misurata su un intervallo di 200 nm a partire da 15 nm oltre la lunghezza d'onda di eccitazione (in genere è necessario un intervallo di 200 nm affinché l'intensità della fluorescenza ritorni alla linea di base).
    5. Ripetere i passaggi da 4.2.3 a 4.2.4 fino ad aggiungere alla cuvetta un totale di 30 μL di soluzione di fluorescenza.
    6. Ripetere i passaggi da 4.2.1 a 4.2.5 per analoghi 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH.
      NOTA: Le concentrazioni di cuvette sono state modificate per l'analogico 18 e i dati sono stati acquisiti utilizzando: 2,0 mL di PBS con cinque incrementi consecutivi di 10 μL di soluzione di fluorescenza per una soluzione neutra (protonato 18)e 2,0 mL di NaOH da 1,0 M con cinque incrementi di 20 μL di soluzione di stock composto aggiunto per una soluzione di base (deprotonata 18).
  3. Determinare la resa quantica usando il metodo di Williams, A. T. etal.
    1. Utilizzando un programma software per fogli di calcolo (cioè Microsoft Excel), importare i dati (punti dati sull'intensità delle emissioni) per gli spettri di emissione per un singolo analogo dipyrrinone (preso in PBS [pH 7.0] o 1.0 M NaOH) ai vari livelli di concentrazione.
    2. Importare i punti dati dagli spettri di emissione per la soluzione "in bianco" (passaggi 4.2.1 - 4.2.2) e sottrarre i punti dati di intensità di emissione "vuoti" dai punti dati sull'intensità di emissione, alle corrispondenti lunghezze d'onda, acquisiti a vari livelli di concentrazione.
    3. Trasferire i punti dati di intensità di emissione corretti "vuoti" in un programma di grafica, come GraphPad Prism 7, e tracciare l'emissione rispetto alla lunghezza d'onda. Calcolare l'area sotto la curva per ciascuna delle curve ottenute ai vari livelli di concentrazione dell'analogico dipirinone.
    4. Seguendo la tecnica delineata da Williams, A. T. et al, calcolare un valore di assorbanza estrapolato per ciascuno dei vari livelli di concentrazione dell'analogo di dipirrinone. Ciò si ottiene moltiplicando il valore di asorptività molare calcolato (dall'analisi di regressione lineare più adatta, vedi passaggio 3.4) per ogni concentrazione di dipirirrinone analogico utilizzata nei passaggi 4.2.3-4.2.5.
    5. Utilizzando un programma di grafica come GraphPad Prism 7, creare un grafico dell'assorbanza estrapolata dell'analogo (asse x) rispetto all'area calcolata sotto ogni curva di concentrazione (passo 4.3.4) per la lunghezza d'onda di emissione corrispondente al valore di emissione maggiore. Si deve osservare una relazione lineare con un ≥ r2 0,96.
    6. Eseguire passaggi analoghi a 3.1-3.4 e 4.1-4.3.5 per il chinino in 0,5 M H2SO4 (ΦF = 0,55)18 e l'antracene in etanolo (ΦF = 0,27)18,19 per ottenere dati per gli standard.
    7. Ottenere i valori di resa quantistica per 16 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH utilizzando le pendenze estrapolate ottenute dai passaggi 4.3.5 e 4.3.6 nella seguente equazione:
      Φx =Φst(Gradx/Gradst)(η2x/η2st)
      dove Φst rappresenta la resa quantico dello standard, Φx rappresenta la resa quantico dell'ignoto, Grad è la pendenza della migliore vestibilità lineare, e η è l'indice di rifrazione del solvente utilizzato (il rapporto dell'indice di rifrazione è stato calcolato usando η = 1,36 per l'etanolo e η = 1,35 per 0,5 M H2SO4).
    8. Segnalare le rese quantiche per 16 - 18 e 20 - 25 in PBS (pH 7.0) e 1.0 M NaOH come media del Φx ottenuto per chinino e antracene.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

La reazione di condensazione di Claisen-Schmidt ha fornito l'accesso agli analoghi del dipirrinone (16-25, Figura 4) utilizzando la procedura a un vaso descritta nella sezione del protocollo (vedere fase 1). Gli analoghi 16-25 sono stati tutti generati dalla condensazione del pirrolinone 9, bromoisoindolone 10o isoindolone 11 con 1H-imidazolo-2-carboxaldeide (

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

L'approccio di condensazione di Claisen-Schmidt fornisce un mezzo abbastanza robusto per generare fluorofori di pirazolo, imidazolo e isoindolone dipirrinone attraverso un protocollo relativamente semplicistico dal punto di vista operativo. Mentre la sintesi degli analoghi fluorescenti del dipirrinone è stata al centro di questo studio, va notato che condizioni simili possono essere applicate per accedere ad altri sistemi ad anello biciclici collegati alla metina come i dipirrinoni23,

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Z.R.W. e N.B. ringraziano il NIH (2P20 GM103440-14A1) per il loro generoso finanziamento, nonché Jungjae Koh e l'Università del Nevada, Las Vegas per la loro assistenza nell'acquisizione di NMR 1H e 13C. Inoltre, vorremmo ringraziare gli studenti dei media visivi NSC, Arnold Placencia-Flores, Aubry Jacobs e Alistair Cooper per il loro aiuto nei processi di riprese e animazione all'interno delle parti cinematografiche di questo manoscritto.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-etil-4-metil-3-pirrolina-2-oneCombi-Blocchi [ 766-36-9]Reagente solido giallo
isoindolina-1-oneArkPharm [ 480-91-1]Reagente solido bianco sporco
5-bromoisoindolina-1-oneCombi-Blocks [ 552330-86-6]Reagente solido rosa
2-formilimidazoloCombi-Blocks [ 10111-08-7 ]Reagente solido biancastro
Imidazolo-4-carbaldeideArkPharm [ 3034-50-2]Reagente solido
1-H-pirazolo-4-carbaldeideOakwood Chemicals [ 35344-95-7]Reagente solido
1-H-pirazolo-5-carbaldeideMatrice Scientifico [ 3920-50-1]Reagente solido
Pellet KOH solidi,BeanTown Chemicals[1310-58-3]Pellet solidi bianchi,
Siliflash, Gel di siliceScilicicloR12030BPolvere bianca fine
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (x10)GrowcellsMRGF-6235Liquido traslucido incolore
Beckman Coulter, DU-800, Spettrofotometro UV/Vis e softwareBeckman CoulterStrumento e software per spettroscopiaN/A
Spettrofluorimetro Fluoromax-4Horiba ScientificStrumento per spettroscopiaN/A
Software per fluoremetria FluorEssence V3.5Horiba ScientificSoftware per spettroscopiaN/A
Micropipetta Finnpipette II (dimensioni: 100-1.000, 20-200 e 0,5-10 &; L)FischerbrandN/A Equipment
Wilmad-LabGlass Evaporatore rotante (Modello: WG-EV311-V-PLUS)SP SciencewareN/AEquipment
Pompa per vuoto DuoSeal (numero modello: 1405)WelchN/AEquipment
GraphPad Prism 4GraphPadN/A Softwaredi analisi dati
SympHony pH Meter (Modello: Sb70P)VWRN/AAttrezzatura
: , , , ,

Riferimenti

  1. Abbandonato, G., et al. Cis-trans photoisomerization properties of GFP chromophore analogs. European Biophysics Journal. 40 (11), 1205-1214 (2011).
  2. Funakoshi, H., et al. Spectroscopic studies on merocyanine photoisomers. IV. Catalytic isomerization of photoisomers of merocyanine derivatives in protic solvents. Nippon Kagaku Kaishi. (9), 1516-1522 (1989).
  3. Puzicha, G., Shrout, D. P., Lightner, D. A. Synthesis and properties of homomologated and contracted dipyrrinone analogs of xanthobilirubic acid. Journal of Heterocyclic Chemistry. 27 (7), 2117-2123 (1990).
  4. Bonnett, R., Hamzetash, D., Asuncion Valles, M. Propentdyopents [5-(2-oxo-2H-pyrrol-5-ylmethylene)pyrrol-2(5H)-ones] and related compounds. Part 2. The Z E photoisomerization of pyrromethenone systems. Journal of the Chemical Society, Perkins Transactions. 1 (6), 1383-1388 (1987).
  5. Tikhomirova, K., Anisimov, A., Khoroshutin, A. Biscyclohexane-Annulated Diethyl Dipyrrindicarboxylates: Observation of a Dipyrrin Form with Absent Visible Absorption. European Journal of Organic Chemistry. 2012 (11), 2201-2207 (2012).
  6. Brower, J. O., Lightner, D. A. Synthesis and spectroscopic properties of a new class of strongly fluorescent dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 67 (8), 2713-2716 (2002).
  7. Woydziak, Z. R., Boiadjiev, S. E., Norona, W. S., McDonagh, A. F., Lightner, D. A. Synthesis and Hepatic Transport of Strongly Fluorescent Cholephilic Dipyrrinones. Journal of Organic Chemistry. 70 (21), 8417-8423 (2005).
  8. Jarvis, T., et al. Pyrrole β-amides: Synthesis and characterization of a dipyrrinone carboxylic acid and an N-Confused fluorescent dipyrrinone. Tetrahedron. 74 (14), 1698-1704 (2018).
  9. Bodio, E., Denat, F., Goze, C. BODIPYS and aza-BODIPY derivatives as promising fluorophores for in vivo molecular imaging and theranostic applications. Journal of Porphyrins and Phthalocyanines. 23, 1159-1183 (2019).
  10. Acharya, A., et al. Photoinduced Chemistry in Fluorescent Proteins: Curse or Blessing. Chemical Reviews. 117 (2), 758-795 (2017).
  11. Romei, M. G., Lin, C. -Y., Mathews, I. I., Boxer, S. G. Electrostatic control of photoisomerization pathways in proteins. Science. 367 (6473), 76-79 (2020).
  12. Benson, N., Suleiman, O., Odoh, S. O., Woydziak, Z. Ryrazole, Imidazole, and Isoindolone Dipyrrinone Analogues: pH-Dependent Fluorophores That Red-Shift Emission Frequencies in a Basic Solution. Journal of Organic Chemistry. 84 (18), 11856-11862 (2019).
  13. Xie, P., Gao, G., Liu, J., Jin, Q., Yang, G. A New Turn on Fluorescent Probe for Selective Detection of Cysteine/Homocysteine. Journal of Fluorescence. 25 (5), 1315-1321 (2015).
  14. Alty, I. G., et al. Intramolecular Hydrogen-Bonding Effects on the Fluorescence of PRODAN Derivatives. Journal of Physical Chemistry A. 120 (20), 3518-3523 (2016).
  15. Yang, Y., Li, D., Li, C., Liu, Y. F., Jiang, K. Hydrogen bond strengthening induces fluorescence quenching of PRODAN derivative by turning on twisted intramolecular charge transfer. Spectrochimica Acta, Part A. 187, 68-74 (2017).
  16. Zhang, L., Liu, J., Gao, J., Zhang, F., Ding, L. High solid fluorescence of a pyrazoline derivative through hydrogen bonding. Molecules. 22 (8), 1(2017).
  17. Williams, A. T. R., Winfield, S. A., Miller, J. N. Relative fluorescence quantum yields using a computer-controlled luminescence spectrometer. Analyst. 108 (1290), 1067-1071 (1983).
  18. Eaton, D. F. Reference materials for fluorescence measurement. Pure and Applied Chemistry. 60 (7), 1107-1114 (1988).
  19. Dawson, W. R., Windsor, M. W. Fluorescence yields of aromatic compounds. Journal of Physical Chemistry. 72 (9), 3251-3260 (1968).
  20. Zhang, X. -F., Zhang, J., Lu, X. The Fluorescence Properties of Three Rhodamine Dye Analogues: Acridine Red, Pyronin Y and Pyronin B. Journal of Fluorescence. 25 (4), 1151-1158 (2015).
  21. Zanker, V., Rammensee, H., Haibach, T. Measurements of the relative quantum yields of the fluorescence of acridine and fluorescein dyes. Zeitschrift für Angewandte Physik. 10, 357-361 (1958).
  22. Mujumdar, R. B., Ernst, L. A., Mujumdar, S. R., Lewis, C. J., Waggoner, A. S. Cyanine dye labeling reagents: Sulfoindocyanine succinimidyl esters. Bioconjugate Chemistry. 4 (2), 105-111 (1993).
  23. Battersby, A. R., Dutton, C. J., Fookes, C. J. R. Synthetic studies relevant to biosynthetic research on vitamin B12. Part 7. Synthesis of (±)-bonellin dimethyl ester. Journal of the Chemical Society, Perkin Transactions. 1 (6), 1569-1576 (1988).
  24. Pfeiffer, W. P., Lightner, D. A. (m.n)-Homorubins: syntheses and structures. Monatschfte für Chemie. 145 (11), 1777-1801 (2014).
  25. Huggins, M. T., Musto, C., Munro, L., Catalano, V. J. Molecular recognition studies with a simple dipyrrinone. Tetrahedron. 63 (52), 12994-12999 (2007).
  26. Groselj, U., et al. Synthesis of Spiro-δ2-Pyrrolin-4-One Pseudo Enantiomers via an Organocatalyzed Sulfa-Michael/Aldol Domino Sequence. Advanced Synthesis & Catalyst. 361 (22), 5118-5126 (2019).
  27. El-Shwiniy, W. H., Shehab, W. S., Mohamed, S. F., Ibrahium, H. G. Synthesis and cytotoxic evaluation of some substituted pyrazole zirconium(IV) complexes and their biological assay. Applied Organometallic Chemistry. 32 (10), (2018).
  28. Murray, L., O'Farrell, A. -M., Abrams, T. Preparation of indolinone compounds for treatment of excessive osteolysis. US Patent. , US20040209937A1 (2004).
  29. Lozinskaya, N. A., et al. Synthesis and biological evaluation of 3-substituted 2-oxindole derivatives as new glycogen synthase kinase 3β inhibitors. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 27 (9), 1804-1817 (2019).
  30. Montforts, F. P., Schwartz, U. M. A directed synthesis of the chlorin system. Liebigs Annalen der Chemie. (6), 1228-1253 (1985).
  31. Uddin, M. I., Thirumalairajan, S., Crawford, S. M., Cameron, T. S., Thompson, A. Improved synthetic route to C-ring ester-functionalized prodigiosenes. Synlett. (17), 2561-2564 (2010).
  32. Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Aromatic congeners of bilirubin: synthesis, stereochemistry, glucuronidation and hepatic transport. Tetrahedron. 57 (37), 7813-7827 (2001).
  33. Clift, M. D., Thomson, R. J. Development of a Merged Conjugate Addition/Oxidative Coupling Sequence. Application to the Enantioselective Total Synthesis of Metacycloprodigiosin and Prodigiosin R1. Journal of the American Chemical Society. 131 (40), 14579-14583 (2009).
  34. Brower, J. O., Lightner, D. A., McDonagh, A. F. Synthesis of a New Lipophilic Bilirubin. Conformation, Transhepatic Transport and Glucuronidation. Tetrahedron. 56 (40), 7869-7883 (2000).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Sintesi del dipirrinonefluorofori pH dipendentienolato vinilogicoanaloghi fluorescenti del dipirrinoneriflusso con idrossido di potassiocromatografia su strato sottilecromatografia flash su colonnaspettroscopia UV Visspettroscopia di fluorescenza

Articoli correlati