Imaging a cellule vive time-lapse in vitro per esplorare la migrazione cellulare verso l'organo di Corti

La perdita dell'udito può verificarsi congenitamente o può essere causata progressivamente da diversi fattori, tra cui invecchiamento, farmaci e rumore. La perdita dell'udito è spesso difficile da trattare perché è molto difficile ripristinare la funzione compromessa una volta che le cellule ciliate responsabili dell'udito sono^{danneggiate 1}. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità, si stima che 461 milioni di persone in tutto il mondo abbiano ipoacusia, che rappresenta il 6,1% della popolazione mondiale. Di coloro che hanno ipoacusia, il 93% sono adulti e il 7% sono bambini.

Sono stati tentati diversi approcci per trattare la perdita dell'udito; in particolare, un approccio di rigenerazione che utilizza i CTC è emerso come un trattamento promettente. Quando il tessuto è danneggiato, i CSC vengono naturalmente rilasciati nel sistema circolatorio e migrano verso il sito della lesione dove secernono varie molecole per formare un microambiente che promuove la^{rigenerazione 2}. Pertanto, è importante sviluppare un metodo per trattare i tessuti danneggiati attraverso la migrazione dei CBC impiantati esternamente agli organi bersaglio e la loro successiva secrezione di molecole che causano una potente regolazione immunitaria, angiogenesi e anti-apoptosi per migliorare il ripristino della funzione^{cellulare danneggiata 3,4,5}.

Il processo di homing in cui i CSC migrano verso tessuti danneggiati può essere l'ostacolo più importante da superare. Gli MSC hanno un meccanismo sistemico di homing con passaggi sequenziali di tethering/rolling, attivazione, arresto, trasmigrazione/diapedesi e migrazione^6,7,8. Attualmente sono in corso sforzi per individuare modi per migliorare questi passaggi. Varie strategie, tra cui la modificazione genetica, l'ingegneria delle superfici cellulari, l'adescamento in vitro e la guida magnetica,^{sono state testate 6,7}. Inoltre, sono stati fatti diversi tentativi per promuovere la protezione e la rigenerazione delle cellule ciliate uditivi affinando i CTC nel sito della coclea danneggiata. Tuttavia, tenere traccia dei CSC in vivo richiede molto tempo e manodopera e richiede competenze altamente specializzate⁹.

Per risolvere questo problema, è stato messo a punto un metodo per osservare l'affinamento dei CFC nella coclizione attraverso la microscopia confocale time-lapse che fotografa la migrazione delle cellule per diverse ore (Figura 1). È stato sviluppato all'inizio del XX secolo^ed è recentemente diventato un potente strumento per studiare la migrazione di cellule specifiche.

Figura 1: Astratto grafico. (A) Dopo che l'organo sezionato di Corti è stato aderito su un copripasta di plastica con forcep, il copripasta viene posizionato su un piatto microscopico confocale con fondo di vetro da 35 mm e (B) il cilindro di vetro è posizionato. (C) Dopo aver riempito l'interno del cilindro di vetro con CCC con etichetta GFP media,(D)con mezzo vengono aggiunti con attenzione all'esterno del cilindro. (E) Dopo l'incubazione durante la notte,(F)il cilindro di vetro viene rimosso e le immagini vengono scattate con un microscopio confocale. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC = cellule staminali mesenchimali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgono topi ICR sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) della Yonsei University presso il Wonju College of Medicine. Gli esperimenti sono stati eseguiti secondo il Codice Etico della World Medical Association. In questo protocollo, i topi ICR in gravidanza sono stati tenuti in un ciclo chiaro / scuro di 12/12 h con libero accesso a cibo e acqua.

1. Dissezione delle cocche

1. Sterilizzare la cappa di coltura del tessuto di flusso laminare accendendo la luce ultravioletta per ~ 30 minuti e spruzzare tutte le superfici con il 70% di etanolo prima dell'uso. Lasciare asciugare le superfici.
2. Posizionare gli strumenti di dissezione in etanolo al 70% per 10 minuti e asciugare prima dell'uso.
3. Utilizzare una lama operativa per decapitare topi postnatali di 3-4 giorni (Figura 2A).
4. Posizionare il cranio sotto uno stereomicroscopio nella cappa di flusso laminare e immergere il tessuto in etanolo al 70%.
5. Immergere rapidamente il tessuto nella soluzione di dissezione tissutale (1x soluzione di sale bilanciato di Hank, 1 mM HEPES) per rimuovere l'etanolo.
6. Tagliare l'altura del cranio con una lama chirurgica(Figura 2B,C).
7. Esporre il cranio tirando la pelle anteriormente e tagliando il canale uditivo esterno dell'orecchio (Figura 2D).
8. Tagliare dalla parte anteriore a quella posteriore del cranio attraverso la linea degli occhi (Figura 2E).
9. Aprire il cranio e rimuovere ilencefalo, il cervelletto e il tronco encefalico con forcep smussate (Figura 2F,G).
10. Utilizzando micro forcep, separare i coclea dall'osso temporale (Figura 2H).
11. Trasferire le cocche in una piastra di Petri contenente soluzione di dissezione tissutale.
12. Sezionare con cura tutta la capsula otica cocleare, lasciando solo il tessuto molle cocleare interno(Figura 2I,J).
13. Tenere il modiolo delle coclee con le flessori e il condotto cocleare con un'altra coppia di forcelle e separare lentamente i due tessuti (Figura 2K).
14. Rimuovere la vascolarizzazione della striata e la membrana tectoriale staccandole delicatamente(Figura 2L,M).
15. Posizionare un coverslip di plastica sterilizzato in una nuova soluzione di dissezione tissutale, quindi posizionare l'organo di Corti su un coverslip di 9 mm di diametro, assicurandosi che la membrana basilare sia rivolta verso il basso(Figura 2N-P).
16. Immobilizzare il tessuto premendo la membrana del Reissner e il tessuto di modiolo rimanente sul copriletto con pinze(Figura 2N-P).
17. Trasferire il copriletto con il tessuto incorporato al centro di un piatto confocale di 35 mm di diametro.
18. Posizionare il cilindro di clonazione del vetro sul piatto, con l'espianto cocleare posizionato al centro del piatto, e aggiungere 100 μL di mezzo di coltura di espianto (DMEM/F12, 10% siero bovino fetale (FBS), 1% di integratore N2, ampicillina (10 μg/mL))¹⁰ all'interno del cilindro(Figura 2Q).
19. Piastra 5 × 10^{3 cellule} di MSC con proteina fluorescente verde derivata dal midollo osseo del topo (GFP) in 2 mL di mezzo di coltura (45% DMEM + 45% DMEM/F12, 10% FBS, 1% supplemento N2, 10 μg/mL di ampicillina) al di fuori del cilindro divetro (Figura 2R).
    1. Quando gli MBC sono confluenti all'80-90%, passare loro staccandoli con acido tetraacetico tripsideina-etilendiammina.
20. Trasferire con cura il piatto confocale in un incubatore umidificato e incubare durante la notte a 37 °C in un'atmosfera di CO_{2 al 5%.}
21. Aspirare tutto il mezzo all'interno e all'esterno del cilindro, quindi rimuovere il cilindro di vetro dal piatto confocale.
22. Aggiungere 2 mL di mezzo di coltura fresco al piatto confocale e incubare il piatto di coltura tissutale in un incubatore umidificato fino a quando non è pronto per l'analisi.

Figura 2. Dissezione di una coclea di topo e cocultura dell'organo di Corti e MSC. (A) Decapitazione del topo, (B) e (C) dissezione saligittale mediana della testa, (D) e(E) dissezione coronale del cervello, (F) e (G) rimozione del cervello e dell'osso temporale, (H) coclea, (I) rimozione della parete cocleare ossea, (J) isolamento della coclea, (K) separazione del condotto cocleare dal modiolo, (L) separazione della vascolarizzazione della striata (SV) e legamento a spirale (SL) dall'organo di Corti, (M) rimozione della membrana tectoriale, (N-P) fissazione della coccina su un foglietto di copertura di plastica, (Q) posizione di coverslip e cilindro di vetro nella piastra confocale,(R)inoculazione di MSC. Barra in scala bianca (A-E) = 1 cm; barra di scala arancione (F, G, P) e gialla (H,I) = 1 mm; barra in scala verde (J-O) = 0,5 mm.

2. Imaging time-lapse

1. Per gli esperimenti qui presentati, utilizzare un sistema di microscopia confocale con un sistema di incubazione superiore dello stadio.
2. Accendere il microscopio confocale, la luce fluorescente e il computer.
3. Impostare le condizioni dell'incubatore stage-top posto sul palco del microscopio confocale a 37 °C e al 5% di atmosfera di CO_2.
4. Posizionare il piatto campione sul recipiente di fissaggio del piatto, coprire con il coperchio di fissaggio del piatto e chiudere la camera con il coperchio del riscaldatore superiore.
5. Regola lo zoom e lo stato attivo per localizzare l'organo di Corti e MSC nel campo visivo.
6. Aprire il software di elaborazione delle immagini. Nell'opzione di individuazione selezionare un obiettivo Plan-Apochromat 20x (apertura numerica 0.8) e una superficie di ritaglio 0,5x.
7. In Acquisizionefare clic su configurazione intelligente e selezionare EGFP.
8. Aprire la linguetta del canale in Acquisizionee impostare la potenza laser su 0,2%, il foro stenopeica a 44 μm, il guadagno principale a 750 Ve il guadagno digitale su 1,0.
9. Fare clic su ESID in fase di configurazione dell'imaging e impostare il guadagno ESID su 4 e il guadagno digitale su 7.5.
10. Clicca su Tessere e palo per produrre 210 tessere.
11. Aprire la strategia focus e selezionare la modalità messa a fuoco.
12. In serie temporaliimpostare la durata su 24 h e l'intervallo su 10 min.
13. In Acquisizioneimpostare la dimensione del fotogramma su 512 x 512 pixel, la velocità di scansione su 8, la direzione in bidirezionale, la media su 4x e i bit per pixel su 16.
14. Clicca sull'esperimento iniziale per iniziare l'esperimento.

3. Modifica del file di immagine

1. In elaborazionefare clic su cucituree impostare la sovrapposizione minima sul 5% e il passaggio massimo al 10%.
2. Fare clic sull'esportazionedei film , impostare uncompressoe impostare la velocità su 7.5.

4. Immunostaining

1. Aspirare il mezzo con attenzione e lavare il campione due volte con soluzione salina tamponata da fosfati (PBS) per 5 minuti.
2. Fissare il campione con formalina al 4% in PBS per 15 minuti e lavare il campione 3 volte con PBS per 5 minuti.
3. Permeabilizzare il campione nello 0,1% di Tritone X-100 in PBS per 10 minuti e lavare 3 volte con PBS per 5 minuti.
4. Aggiungere 250 μL di reagente phalloidin-iFluor 647 (diluizione 1:1000 in PBS) e incubare il campione per 1 h a temperatura ambiente sullo shaker.
5. Lavare il campione 3 volte con PBS per 5 minuti.
6. Trasferire il coverslip sullo scivolo di vetro e aggiungere 2 gocce di soluzione di montaggio.
7. Posizionare delicatamente una coverlip sullo scivolo.
8. Sigillare il copripago con smalto chiaro e conservare a 4 °C al buio fino a quando non si osservano le cellule.
9. Immagina la diapositiva usando un microscopio confocale con un filtro appropriato a eccitazione/emissione (Ex/Em)=650/665 nm per la filloidina e a Ex/Em=488/507 nm per EGFP.

La migrazione in vitro dei CSC in modalità tridimensionale è stata valutata da un sistema Transwell o dal tradizionale metodo di guarigione delle ferite per osservare la migrazione in modalità bidimensionale (2D)11. L'organo di Corti è una struttura complessa composta da varie cellule come cellule boettcher, cellule claudio, cellule deiters, cellule di pilastro, cellule di Hensen, cellule ciliate esterne, cellule ciliate interne, fibre nervose, membrana basiolare e lamina reticolare12. Quando i CSC vengono trapiantati in tessuti composti da cellule così complesse, l'uso della tecnologia per accertare dove le cellule vengono reclutate e stabilizzate è fondamentale per comprendere il meccanismo della terapia cellulare e della rigenerazione utilizzando i CBC. Inoltre, per determinare come i CSC sono localizzati in presenza o assenza di danni, un metodo 2D come un metodo di guarigione delle ferite è più adatto di un sistema Transwell in cui le cellule si muovono casualmente verso il basso in una direzione.

In questo studio, il percorso bidimensionale dei CSC è stato tracciato in un metodo di guarigione delle ferite semplicemente usando un cilindro di vetro come barriera tra i CSC e l'organo di Corti e rimuovendo il cilindro dopo che i CSC sono stati attaccati. Quando l'organo di Corti è stato coltivato, i fibroblasti sono cresciuti molto rapidamente verso l'esterno dalle cellule ciliate esterne presenti nello strato più esterno (Figura 3, Video 1). Pertanto, la maggior parte dei CSC etichettati GFP sembrava essere spinta fuori dai fibroblasti in rapida crescita (Video 1). Tuttavia, alcuni MSC etichettati GFP penetrarono lo strato di fibroblasti e migrarono con successo all'organo di Corti (Figura 3, Video 1).

Figura 3. Immagine confocale dell'organo dei CBC con etichetta Corti e GFP. Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 4 ore di incubazione, sono state eseguite fissazioni e colorazioni. Barra di scala =100 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC: cellule staminali mesenchimali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Microscopia confocale time-lapse dell'organo dei CBC etichettati Corti e GFP. Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 4 ore di incubazione, sono state eseguite fissazioni e colorazioni. Barra di scala =100 μm. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; MSC: cellule staminali mesenchimali. Clicca qui per scaricare questo video.

I risultati di 72 ore di incubazione hanno mostrato che i CSC migravano all'organo di Corti ed erano principalmente localizzati nel modiolo e nell'area in cui venivano raccolte le fibre nervose cocleari separate dal modiolo; la morfologia dei CSC è stata alterata a una forma radiale simile a quella delle fibre nervose (Figura 4B). Curiosamente, le cellule sono state trasformate in una forma lineare lungo la linea limbus piuttosto che nell'area delle cellule ciliate(Figura 4E,vedi freccia). Sebbene le estremità apicali e basali dell'organo di Corti siano state combinate per impedire ai CSC di spostarsi sul lato mediale della membrana basiolare, i CSC sono stati in grado di migrare e crescere nell'area di raccolta delle fibre nervose penetrando nei vari strati cellulari e barriere fisiche(Figura 4E). Quando i danni alle cellule ciliate sono stati indotti dal trattamento con 1 mM di kanamicina per 16 ore e le cellule sono state coltivate per altre 72 ore dopo la rimozione della kanamicina, i CSC sono stati localizzati non solo nel modiolo, ma anche nelle cellule ciliate esterne(Figura 4C,D).

Figura 4. Immagini confocali dell'organo dei CBC con etichetta Corti e GFP. (A) Dopo la rimozione del cilindro di vetro e altre 16 ore di incubazione, è stata scattata un'immagine dopo la fissazione e la colorazione. La barra di scala =200 μm. (B) I CSC erano distribuiti prevalentemente nell'area del modiolo, barra di scala =20 μm. Dopo la rimozione del cilindro di vetro dal piatto, le cellule sono state ulteriormente incubate con kanamicina da 1,0 mM per 16 ore, coltivate con mezzo privo di kanamicina per 72 ore, e quindi fissate e macchiate. Immagini della regione esterna delle cellule cieche (C), barra di scala= 20 μm; (D) regione di modiolo, barra di scala= 50 μm; e (E) cochlea intera, barra di scala= 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Questi risultati indicano che il sistema sperimentale dimostrato in questo studio sarebbe un utile strumento di prova per lo sviluppo di strategie terapeutiche cellulari utilizzando i CSC e può essere applicato specificamente allo studio della perdita dell'udito causata da vari fattori.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.