Campionamento ed elaborazione della spazzolatura nasale mediante videomicroscopia ciliare digitale ad alta velocità – Adattamento alla pandemia COVID-19

Summary

Per garantire un'analisi funzionale ciliare di successo e di alta qualità per la diagnosi di PCD, è essenziale un metodo preciso e attento per il campionamento e il trattamento dell'epitelio respiratorio. Per continuare a fornire un servizio diagnostico PCD durante la pandemia COVID-19, il protocollo di videomicroscopia ciliare è stato aggiornato per includere adeguate misure di controllo delle infezioni.

Abstract

La discinesia ciliare primitiva (PCD) è una ciliopatia genetica mobile, che porta a una significativa malattia otosinopolmonare. La diagnosi di PCD è spesso mancata o ritardata a causa di sfide con diverse modalità diagnostiche. La videomicroscopia ciliare, che utilizza la videomicroscopia digitale ad alta velocità (DHSV), uno degli strumenti diagnostici per la PCD, è considerata il metodo ottimale per eseguire l'analisi funzionale ciliare (CFA), che comprende l'analisi della frequenza del battito ciliare (CBF) e del pattern di battito (CBP). Tuttavia, il DHSV manca di una procedura operativa standardizzata e pubblicata per l'elaborazione e l'analisi dei campioni. Utilizza anche l'epitelio respiratorio vivente, un significativo problema di controllo delle infezioni durante la pandemia di COVID-19. Per continuare a fornire un servizio diagnostico durante questa crisi sanitaria, il protocollo di videomicroscopia ciliare è stato adattato per includere adeguate misure di controllo delle infezioni.

Qui, descriviamo un protocollo rivisto per il campionamento e l'elaborazione di laboratorio di campioni respiratori ciliati, evidenziando gli adattamenti apportati per conformarsi alle misure di controllo delle infezioni COVID-19. Vengono descritti i risultati rappresentativi del CFA da campioni di spazzolatura nasale ottenuti da 16 soggetti sani, elaborati e analizzati secondo questo protocollo. Illustriamo anche l'importanza di ottenere e trattare strisce ciliate epiteliali di qualità ottimale, poiché i campioni che non soddisfano i criteri di selezione della qualità ora consentono CFA, riducendo potenzialmente l'affidabilità diagnostica e l'efficienza di questa tecnica.

Introduction

La discinesia ciliare primitiva (PCD) è una ciliopatia mobile eterogenea ereditaria, in cui le ciglia respiratorie sono stazionarie, lente o discineetiche, portando a compromissione della clearance mucociliare e malattia cronica oto-sino-polmonare 1,2,3,4. Le manifestazioni cliniche della PCD sono tosse umida cronica e congestione nasale cronica che inizia nella prima infanzia, infezioni ricorrenti o croniche del tratto respiratorio superiore e inferiore che portano a bronchiectasie e otite media e sinusite ricorrenti o croniche

Protocol

L'approvazione è stata ottenuta dal comitato etico dell'ospedale di Liegi e dal Dipartimento universitario per l'igiene e la protezione della salute sul lavoro.

1. Campionamento dell'epitelio ciliato respiratorio

1. Assicurarsi che i soggetti siano privi di infezione per almeno 4-6 settimane e privi di farmaci nasali e inalati, prima del campionamento.
2. Preparare la preparazione integrata di M199: Integrare il terreno di coltura cellulare 199 (M199) (500 ml) con soluzione antibiotica (5 ml di streptomicina/penicillina (50 μg/ml)) e soluzione antifungina (5 ml di amfotericina B (2,5μg/ml)).
3. Preparare 2 (uno per ogni....

Results

Per illustrare l'efficacia della tecnica, presentiamo i risultati del CFA in una serie di 16 volontari adulti sani (5 maschi, fascia di età 22-54 anni).

I campioni di spazzolatura nasale di 14 (4 maschi, fascia di età 24-54 anni) su un totale di 16 volontari hanno fornito bordi epiteliali appropriati sufficienti che soddisfacevano i criteri di selezione necessari per eseguire la CFA. Da questi 14 campioni di spazzolatura nasale, sono stati registrati un totale di 242 bordi ciliati e 212 bordi .......

Discussion

Questo documento mira a fornire una procedura operativa standard per CFA utilizzando campioni di spazzolatura nasale, con modifiche apportate per appropriate considerazioni sul controllo delle infezioni durante la pandemia COVID-19. La diagnosi di PCD è impegnativa e attualmente richiede un pannello di diversi test diagnostici, secondo le raccomandazioni internazionali, tra cui la misurazione dell'ossido nitrico nasale, CFA utilizzando DHSV, analisi ultrastrutturale ciliare mediante microscopia elettronica a trasmissione.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette coniche da 15 mL	FisherScientific	352096	Provetta conica in polipropilene ad alta trasparenza da 15 ml con coperchio
Amfotericina B	LONZA	17-836E	Soluzione antimicotica
Pinze nasali Blakesley-weil	NOVO SURGICAL	E7739-12	Utilizzato per tenere lo spazzolino per eseguire lo spazzolamento nasale
Spazzola per citologia bronchiale	CONMED	129	Utilizzato per nasale tampone
di cotone	NUOVA APTACA	2150/SG	Utilizzato per i test COVID-19
Telecamera digitale per videomicroscopia ad alta velocità	IDTeu Innovazione in movimento	CrashCam Mini 1510
Vetrino	ThermoScientific	12372098	Vetrini per microscopio utilizzati per creare la camera di visualizzazione
Scatola riscaldata	Celle IBIDI a fuoco	10918	Utilizzato per riscaldare il campione
Microscopio a luce invertita	Zeiss	AXIO Vert.A1
Lens Heater	TOKAI HIT	TPiE-LH	Utilizzato per riscaldare la lente ad immersione in olio
Medium 199 (M199), HEPES	TermoFisher Scientific	12340030	Cell Culture Medium
Motion Studio X64	IDT Motion	versione 2.14.01	Software
Oil	FischerScientific, Carl Zeiss
Vetrino coprioggetto rettangolare	VWR	631-0145	Utilizzato per coprire la camera di visualizzazione
Distanziatore (Ispacer) 0,25 mm	Sunjinlab	IS203	Utilizzato per la creazione della camera di visualizzazione ermetica chiusa
Vetrino coprioggetto quadrato	VWR	631-0122	Utilizzato per la creazione di una camera di visualizzazione aperta costruita in laboratorio
Streptomicina/Penicillina	FisherScientific, Gibco	11548876	soluzione di antiobiotici