Preparazione del campione dell'impianto per la misurazione del contenuto nucleoside/nucleotidico con hplc-MS/MS

Sommario

Qui viene descritto un metodo preciso e riproducibile per la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi nelle piante. Questo metodo utilizza un HPLC-MS/MS.

Abstract

Nucleosides/nucleotidi sono elementi costitutivi di acidi nucleici, parti di cosubstrati e coenzimi, molecole di segnalazione cellulare e portatori di energia, che sono coinvolti in molte attività cellulari. Qui descriviamo un metodo rapido e affidabile per la qualificazione assoluta del contenuto nucleoside/nucleotidico nelle piante. In breve, 100 mg di materiale vegetale omogeneizzato sono stati estratti con 1 mL di tampone di estrazione (metanolo, acetonitrile e acqua con un rapporto di 2:2:1). Successivamente, il campione è stato concentrato cinque volte in un essiccatore a congelatore e quindi iniettato in una colonna di HPLC-MS/MS. Le transizioni di massa di ogni nucleoside e nucleotide sono state monitorate dalla spettrometria di massa. Il contenuto dei nucleosidi e dei nucleotidi è stato quantificato in base ai loro standard esterni (ESTD). Utilizzando questo metodo, quindi, i ricercatori possono facilmente quantificare nucleosides / nucleotidi in diverse piante.

Introduzione

I nucleosides/nucleotidi sono componenti metabolici centrali in tutti gli organismi viventi, che sono i precursori degli acidi nucleici e di molti coenzimi, come la nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), e importanti nella sintesi di macromolecole come fosfolipidi, glicolipidi e polisaccaridi. Strutturalmente, il nucleoside contiene una nucleobase, che può essere un'adenina, guanina, uracile, citosina o timina, e una moiety zuccherina, che può essere un ribosio o un deossiribosio^1,2. I nucleotidi hanno fino a tre gruppi fosfatici che si legano alla posizione a 5 atomi di carbonio della moiety zuccherina dei....

Protocollo

1 Crescita delle piante e raccolta dei materiali

1. Assicurarsi che i semi di Arabidopsis siano sterilizzati in etanolo al 70% per 10 minuti e seminati sulle piastre di agar, che sono state preparate con nutrienti Murashige e Skoog a metà resistenza.
2. Incubare le piastre contenenti semi di Arabidopsis sotto scuro a 4 °C per 48 ore, quindi trasferirle in una camera di crescita controllata sotto 16 ore di luce di 55 μmol m^-2 s^-1 a 22 °C e 8 h scure a 20 °C.
3. Raccogliere 100 mg di piantine di 2 settimane (peso fresco) e congelare l'azoto liquido per l'estrazione dei metaboliti.
   ATTENZIONE: I ricercatori ....

Risultati

Qui, mostriamo l'identificazione e la quantificazione della N¹-metilladenosina, un nucleoside modificato noto, nelle piantine di tipo selvatico Arabidopsis (Col-0) di 2 settimane come esempio. Il profilo della spettrometria di massa indica che gli ioni prodotto generati dallo standard N¹-metilladenosina sono 150 m/z e 133 m/z(figura 2A), e lo stesso profilo si osserva anche nell'estrazione Col-0(figura 2B).<.......

Discussione

Gli organismi contengono vari nucleosidi/nucleotidi, inclusi quelli canonici e aberranti. Tuttavia, l'origine e gli endpoint metabolici di essi, in particolare i nucleosidi modificati, sono ancora oscuri. Inoltre, l'attuale comprensione della funzione e dell'omeostasi del metabolismo dei nucleosidi/nucleotidi deve ancora essere esplorata ed ampliata. Per studiarli, è necessario utilizzare un metodo preciso e standard per questi metaboliti di identificazione e quantificazione. Qui, abbiamo descritto un protocollo che util.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
acetonitrile	Sigma-Aldrich	1000291000
adenosina	Sigma-Aldrich	A9251-1G
acetato di ammonio	Sigma-Aldrich	73594-100G-F
AMP	Sigma-Aldrich	01930-5G
CMP	Sigma-Aldrich	C1006-500MG
citidina	Sigma-Aldrich	C122106-1G
GMP	Sigma-Aldrich	G8377-500MG
guanosina	Sigma-Aldrich	G6752-1G
colonna Hypercarb	Thermo Fisher Scientific GmbH	35005-054630
IMP	Sigma-Aldrich	57510-5G
inosina	Sigma-Aldrich	I4125-1G
metanolo	Sigma-Aldrich	34860-1L-R
N1-metiladenosina	Carbosynth	NM03697
O6-metilguanosina	Carbosynth	NM02922
Murashige e Skoog Medium	Duchefa Biochemie	M0255.005
colonna Polaris 5 C18A	Agilent Technologies	A2000050X046
pseudouridina	Carbosynth	NP11297
UMP	Sigma-Aldrich	U6375-1G
uridina	Sigma-Aldrich	U3750-1G