Articolo metodologico

Preparazione del campione dell'impianto per la misurazione del contenuto nucleoside/nucleotidico con hplc-MS/MS

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DOI:

10.3791/61956

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24 febbraio 2021

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1College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, 2Department of Criminal Science and Technology, Nanjing Forest Police College, 3Department of Molecular Nutrition and Biochemistry of Plants, Institute of Plant Nutrition, Leibniz University Hannover

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui viene descritto un metodo preciso e riproducibile per la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi nelle piante. Questo metodo utilizza un HPLC-MS/MS.

Abstract

Nucleosides/nucleotidi sono elementi costitutivi di acidi nucleici, parti di cosubstrati e coenzimi, molecole di segnalazione cellulare e portatori di energia, che sono coinvolti in molte attività cellulari. Qui descriviamo un metodo rapido e affidabile per la qualificazione assoluta del contenuto nucleoside/nucleotidico nelle piante. In breve, 100 mg di materiale vegetale omogeneizzato sono stati estratti con 1 mL di tampone di estrazione (metanolo, acetonitrile e acqua con un rapporto di 2:2:1). Successivamente, il campione è stato concentrato cinque volte in un essiccatore a congelatore e quindi iniettato in una colonna di HPLC-MS/MS. Le transizioni di massa di ogni nucleoside e nucleotide sono state monitorate dalla spettrometria di massa. Il contenuto dei nucleosidi e dei nucleotidi è stato quantificato in base ai loro standard esterni (ESTD). Utilizzando questo metodo, quindi, i ricercatori possono facilmente quantificare nucleosides / nucleotidi in diverse piante.

Introduzione

I nucleosides/nucleotidi sono componenti metabolici centrali in tutti gli organismi viventi, che sono i precursori degli acidi nucleici e di molti coenzimi, come la nicotinammide adenina dinucleotide (NAD), e importanti nella sintesi di macromolecole come fosfolipidi, glicolipidi e polisaccaridi. Strutturalmente, il nucleoside contiene una nucleobase, che può essere un'adenina, guanina, uracile, citosina o timina, e una moiety zuccherina, che può essere un ribosio o un deossiribosio1,2. I nucleotidi hanno fino a tre gruppi fosfatici che si legano alla posizione a 5 atomi di carbonio della moiety zuccherina dei nucleosidi3. Il metabolismo dei nucleotidi nelle piante è essenziale per la germinazione dei semi e la crescita dellefoglie 4,5,6. Per comprendere meglio il loro ruolo fisiologico nello sviluppo delle piante, è necessario stabilire i metodi per la quantificazione assoluta dei diversi nucleosidi/nucleotidi in vivo.

Uno degli approcci più comunemente usati per misurare nucleosidi/ nucleotidi utilizza una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata con un rivelatore uv-vis4,7,8,9,10,11. Nel 2013, utilizzando HPLC, Dahncke e Witte hanno quantificato diversi tipi di nucleosidi in Arabidopsis thaliana7. Hanno identificato un contenuto migliorato di guanosina in un mutante di inserimento del DNA T mirato nel gene della deaminasi della guanosina rispetto alla pianta di tipo selvatico. Un altro nucleoside pirimidina, la citidina, è stato anche rilevato quantitativamente nelle piante che utilizzano questo metodo, il che ha portato all'identificazione di un gene di deaminasi citidina in buona fede4. Basato sul rivelatore UV, questo metodo, tuttavia, non può facilmente distinguere i nucleosidi che hanno spettro e tempi di ritenzione simili, ad esempio guanosina o xanthosina. Il limite di rilevamento del metodo HPLC è relativamente alto, quindi, è frequentemente usato per la misurazione di alto contenuto di nucleosidi in vivo, come citidina, uridina e guanosina.

Inoltre, la gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) può essere utilizzata anche nella misurazione nucleoside. Beneficiando di esso, Hauck et. al. ha rilevato con successo uridina e acido urico, che è un metabolita a valle della via catabolica nucleoside, nei semi di A. thaliana12. Tuttavia, gc viene normalmente utilizzato per separare i composti volatili ma non adatto alle sostanze termo labili. Pertanto, una cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS) è probabilmente una tecnica analitica più adatta e accurata per l'identificazione, la separazione e la quantificazione in vivo dei nucleosidi/nucleotidi13,14. Diversi studi precedenti hanno riferito che una colonna HILIC può essere utilizzata per la separazione di nucleosidi e nucleotidi15,16 e standard interni isotopicamente etichettati sono stati utilizzati per la quantificazione composta17. Tuttavia, entrambi i componenti sono relativamente costosi, in particolare gli standard commerciali etichettati isotopici. Qui, segnalamo un approccio LC-MS/MS economicamente applicabile per la misurazione di nucleosidi / nucleotidi. Questo metodo è già stato utilizzato con successo per la quantificazione di diversi nucleosidi /nucleotidi, tra cui ATP, N6-metil-AMP, AMP, GMP, uridina, citidina e pseudouridina1,5,6,18, nelle piante e Drosophila. Inoltre, il metodo che qui riferiamo può essere utilizzato anche in altri organismi.

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Protocollo

1 Crescita delle piante e raccolta dei materiali

  1. Assicurarsi che i semi di Arabidopsis siano sterilizzati in etanolo al 70% per 10 minuti e seminati sulle piastre di agar, che sono state preparate con nutrienti Murashige e Skoog a metà resistenza.
  2. Incubare le piastre contenenti semi di Arabidopsis sotto scuro a 4 °C per 48 ore, quindi trasferirle in una camera di crescita controllata sotto 16 ore di luce di 55 μmol m-2 s-1 a 22 °C e 8 h scure a 20 °C.
  3. Raccogliere 100 mg di piantine di 2 settimane (peso fresco) e congelare l'azoto liquido per l'estrazione dei metaboliti.
    ATTENZIONE: I ricercatori devono indossare in modo appropriato guanti, occhiali protettivi e un camice da laboratorio per evitare la contaminazione dei tessuti umani durante la raccolta dei materiali.

2 Estrazione nucleosidi/nucleotidi

  1. Macinato 100 mg di tessuti vegetali congelati con 7-8 perline d'acciaio in un miscelatore pre-freddo per 5 minuti ad una frequenza di 60 Hz.
  2. Preparare la soluzione di estrazione, che contiene metanolo, acetonitrile e acqua in un rapporto di 2:2:1.
  3. Rimostrare i materiali omogeneizzati (compresa la maggior parte dei metaboliti ma non le proteine) con 1 mL di soluzione di estrazione.
  4. Centrifugare la soluzione risultante a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.
  5. Trasferire 0,5 ml della sospensione in un nuovo tubo da 1,5 ml e congelare l'azoto liquido.
  6. Evaporare il campione congelato in un tintore congelante e rimescolare in 0,1 mL di acetonitrile al 5% e 95% di acqua.
  7. Centrifugare la soluzione risultante (0,1 mL) a 40.000 x g per 10 min a 4 °C. Caricare il supernatante in una fiala per la misurazione LC-MS/MS.

3 Misurazione LC-MS/MS

  1. Preparare un tampone di acetato di ammonio da 10 mM sciogliendo 1,1 g di acetato di ammonio in 2 L di acqua doppia deionizzata (fase mobile A). Regolare il pH al 9,5 per il 10% di ammonio e acido acetato.
  2. Preparare 2 L di metanolo ultrapuro al 100% (fase mobile B1) per la misurazione dei nucleosidi. Inoltre, preparare 2 L di acetonitrile ultrapuro al 100% (fase mobile B2) per la misurazione dei nucleotidi.
  3. Iniettare 0,02 mL di estrazione di metaboliti pretrattati di ciascun campione dal passaggio 2.7 in un sistema HPLC con pompe binarie (LC) accoppiate con un triplo spettrometro di massa quadrupolo (MS).
    ATTENZIONE: il sistema HPLC utilizza una colonna C18 (50 x 4,6 mm, dimensione delle particelle 5 μm; lavoro a 25 °C) tamponamento con fase mobile A e B1(Figura 1A)per la separazione dei nucleosidi e utilizzare una colonna di carbonio grafitico poroso (PGC) (50 x 4,6 mm, dimensione delle particelle 5 μm; lavorando a 25 °C) con fase mobile A e B2(figura 1B)per la separazione dei nucleotidi. Ogni campione è stato iniettato tre volte per la replica tecnica.
  4. Programmate il metodo come illustrato nella tabella 1 per la colonna C18 e il metodo come illustrato nella tabella 2 per la colonna PGC. Impostare una portata di 0,65 mL min-1.
    NOTA: Le transizioni di massa (tabella 3) sono state monitorate da spettrometro di massa. Le condizioni di analisi dello spettro di massa di otto nucleosidi e cinque nucleotidi contenenti quelli canonici e modificati sono elencate nella tabella 3.
  5. Registrare le aree di picco di ogni composto bersaglio (Figura 1).

4 Generazione delle curve di calibrazione standard

  1. Mettere insieme sei estrazioni di campioni, prodotte seguendo la descrizione della sezione 2, e vortice. Quindi, aliquota di nuovo a sei estrazioni (stesso volume) per ottenere ogni sfondo.
  2. Aggiungere sei diverse concentrazioni di ogni norma a queste sei estrazioni, rispettivamente, e iniettarle una per una dopo il passaggio 3.3.
  3. Registrare le aree di picco di ogni standard a diverse concentrazioni attraverso le transizioni di massa come descritto nei passaggi 3.4 e 3.5.
  4. Tracciate l'area di picco rispetto alla concentrazione nominale di ogni standard per generare una curva a sei punti.
    NOTA: Le aree di picco dei nucleosidi/nucleotidi registrate nel passaggio 3.5 dovrebbero rientrare nell'intervallo delle curve di taratura standard.
  5. Calcolare l'equazione di una linea retta per ogni composto standard: Y = aX + b

5 Quantificazione dei metaboliti

  1. Calcolare il contenuto dei metaboliti utilizzando l'area di picco registrata nel passaggio 3.5 e l'equazione dal passaggio 4.5.

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Risultati

Qui, mostriamo l'identificazione e la quantificazione della N1-metilladenosina, un nucleoside modificato noto, nelle piantine di tipo selvatico Arabidopsis (Col-0) di 2 settimane come esempio. Il profilo della spettrometria di massa indica che gli ioni prodotto generati dallo standard N1-metilladenosina sono 150 m/z e 133 m/z(figura 2A), e lo stesso profilo si osserva anche nell'estrazione Col-0(figura 2B).<...

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Discussione

Gli organismi contengono vari nucleosidi/nucleotidi, inclusi quelli canonici e aberranti. Tuttavia, l'origine e gli endpoint metabolici di essi, in particolare i nucleosidi modificati, sono ancora oscuri. Inoltre, l'attuale comprensione della funzione e dell'omeostasi del metabolismo dei nucleosidi/nucleotidi deve ancora essere esplorata ed ampliata. Per studiarli, è necessario utilizzare un metodo preciso e standard per questi metaboliti di identificazione e quantificazione. Qui, abbiamo descritto un protocollo che util...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dai Fondi di ricerca fondamentali per le università centrali (KJQN202060), dalla National Natural Science Foundation of China (31900907), dalla Fondazione per le scienze naturali della provincia di Jiangsu (BK20190528), dal Centro internazionale per l'ingegneria genetica e le biotecnologie (CRP / CHN20-04_EC) a M.C., e i Fondi di Ricerca Fondamentale per le Università Centrali (LGZD202004) a X.L.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
acetonitrileSigma-Aldrich1000291000
adenosinaSigma-AldrichA9251-1G
acetato di ammonioSigma-Aldrich73594-100G-F
AMPSigma-Aldrich01930-5G
CMPSigma-AldrichC1006-500MG
citidinaSigma-AldrichC122106-1G
GMPSigma-AldrichG8377-500MG
guanosinaSigma-AldrichG6752-1G
colonna HypercarbThermo Fisher Scientific GmbH35005-054630
IMPSigma-Aldrich57510-5G
inosinaSigma-AldrichI4125-1G
metanoloSigma-Aldrich34860-1L-R
N1-metiladenosinaCarbosynthNM03697
O6-metilguanosinaCarbosynthNM02922
Murashige e Skoog MediumDuchefa BiochemieM0255.005
colonna Polaris 5 C18AAgilent TechnologiesA2000050X046
pseudouridinaCarbosynthNP11297
UMPSigma-AldrichU6375-1G
uridinaSigma-AldrichU3750-1G

Riferimenti

  1. Liu, B., Winkler, F., Herde, M., Witte, C. -P., Großhans, J. A link between deoxyribonucleotide metabolites and embryonic cell-cycle control. Current Biology. 29 (7), 1187-1192 (2019).
  2. Zrenner, R., Stitt, M., Sonnewald, U., Boldt, R. Pyrimidine and purine biosynthesis and degradation in plants. Annual Review of Plant Biology. 57, 805-836 (2006).
  3. Witte, C. -P., Herde, M. Nucleotide metabolism in plants. Plant Physiology. 182 (1), 63-78 (2020).
  4. Chen, M., Herde, M., Witte, C. -P. Of the nine cytidine deaminase-like genes in Arabidopsis, eight are pseudogenes and only one is required to maintain pyrimidine homeostasis in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 799-809 (2016).
  5. Chen, M., et al. m6A RNA degradation products are catabolized by an evolutionarily conserved N6-methyl-AMP deaminase in plant and mammalian cells. The Plant Cell. 30 (7), 1511-1522 (2018).
  6. Chen, M., Witte, C. -P. A kinase and a glycosylase catabolize pseudouridine in the peroxisome to prevent toxic pseudouridine monophosphate accumulation. The Plant Cell. 32 (3), 722-739 (2020).
  7. Dahncke, K., Witte, C. -P. Plant purine nucleoside catabolism employs a guanosine deaminase required for the generation of xanthosine in Arabidopsis. The Plant Cell. 25 (10), (2013).
  8. Jung, B., et al. Uridine-ribohydrolase is a key regulator in the uridine degradation pathway of Arabidopsis. The Plant Cell. 21 (3), 876-891 (2009).
  9. Jung, B., Hoffmann, C., Moehlmann, T. Arabidopsis nucleoside hydrolases involved in intracellular and extracellular degradation of purines. Plant Journal. 65 (5), 703-711 (2011).
  10. Riegler, H., Geserick, C., Zrenner, R. Arabidopsis thaliana nucleosidase mutants provide new insights into nucleoside degradation. New Phytologist. 191 (2), 349-359 (2011).
  11. Zrenner, R., et al. A functional analysis of the pyrimidine catabolic pathway in Arabidopsis. New Phytologist. 183 (1), 117-132 (2009).
  12. Hauck, O. K., et al. Uric acid accumulation in an Arabidopsis urate oxidase mutant impairs seedling establishment by blocking peroxisome maintenance. The Plant Cell. 26 (7), 3090-3100 (2014).
  13. Qu, C., et al. Comparative analysis of nucleosides, nucleobases, and amino acids in different parts of Angelicae Sinensis Radix by ultra high performance liquid chromatography coupled to triple quadrupole tandem mass spectrometry. Journal of Separation Science. 42 (6), 1122-1132 (2019).
  14. Zong, S. -Y., et al. Fast simultaneous determination of 13 nucleosides and nucleobases in Cordyceps sinensis by UHPLC-ESI-MS/MS. Molecules. 20 (12), 21816-21825 (2015).
  15. Moravcová, D., et al. Separation of nucleobases, nucleosides, and nucleotides using two zwitterionic silica-based monolithic capillary columns coupled with tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. A. 1373, 90-96 (2014).
  16. Guo, S., et al. Hydrophilic interaction ultra-high performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry for determination of nucleotides, nucleosides and nucleobases in Ziziphus plants. Journal of Chromatography. A. 1301, 147-155 (2013).
  17. Seifar, R. M., et al. Simultaneous quantification of free nucleotides in complex biological samples using ion pair reversed phase liquid chromatography isotope dilution tandem mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 388 (2), 213-219 (2009).
  18. Baccolini, C., Witte, C. -P. AMP and GMP catabolism in Arabidopsis converge on xanthosine, which is degraded by a nucleoside hydrolase heterocomplex. The Plant Cell. 31 (3), 734-751 (2019).

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