Articolo metodologico

Un dispositivo di riscaldamento / contenimento contemporaneo per iniezioni efficienti della vena della coda in un modello di sepsi fungina murina

DOI:

10.3791/61961

⸱

6 novembre 2020

 ,  ,  , 
1Center for Oral and Craniofacial Biology, Louisiana State University Health-School of Dentistry, 2Department of Microbiology and Immunology, Tulane University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un metodo efficace ed efficiente per le iniezioni di vene della coda dei roditori utilizzando un dispositivo di riscaldamento / contenimento dal design unico. Semplificando l'avvio di processi di vasodilatazione e contenimento, questo protocollo consente iniezioni endovenose accurate e tempestive di grandi gruppi di animali con un disagio minimo.

Abstract

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Nei modelli di roditori, le iniezioni di vena della coda sono metodi importanti per la somministrazione endovenosa di agenti sperimentali. Le iniezioni della vena della coda in genere comportano il riscaldamento dell'animale per promuovere la vasodilatazione, che aiuta sia nell'identificazione dei vasi sanguigni che nel posizionamento dell'ago nel lume del vaso mentre trattiene saldamente l'animale. Sebbene le iniezioni della vena della coda siano procedure comuni in molti protocolli e non siano considerate altamente tecniche se eseguite correttamente, iniezioni accurate e coerenti sono fondamentali per ottenere risultati riproducibili e ridurre al minimo la variabilità. I metodi convenzionali per indurre la vasodilatazione prima delle iniezioni della vena della coda dipendono generalmente dall'uso di una fonte di calore come una lampada di calore, pastiglie termiche elettriche / ricaricabili o acqua preriscaldata a 37 ° C. Nonostante siano facilmente accessibili in un ambiente di laboratorio standard, questi strumenti soffrono evidentemente di scarsa / limitata capacità termoregolante. Allo stesso modo, sebbene siano disponibili in commercio varie forme di dispositivi di ritenuta, devono essere utilizzati con attenzione per evitare traumi agli animali. Queste limitazioni dei metodi attuali creano variabili non necessarie negli esperimenti o si traducono in risultati variabili tra esperimenti e / o laboratori.

In questo articolo, dimostriamo un protocollo migliorato utilizzando un dispositivo innovativo che combina un dispositivo di riscaldamento indipendente, regolato termicamente, con un'unità di ritenuta regolabile in un unico sistema per un'efficiente iniezione semplificata della vena della coda. L'esempio che usiamo è un modello endovenoso di infezione fungina del flusso sanguigno che provoca sepsi. L'apparecchio di riscaldamento è costituito da una scatola acrilica termoriflettente installata con un termostato automatico regolabile per mantenere la temperatura interna a una soglia preintenetata. Allo stesso modo, la larghezza e l'altezza dell'apparato di ritenuta del cono possono essere regolate per adattarsi in modo sicuro a varie dimensioni di roditori. Con le caratteristiche avanzate e versatili del dispositivo, la tecnica mostrata qui potrebbe diventare uno strumento utile in una serie di aree di ricerca che coinvolgono modelli di roditori che impiegano iniezioni di vena di coda.

Introduzione

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L'uso di modelli animali che coinvolgono roditori è stato un punto fermo della ricerca biomedica. Numerosi ceppi inbred e outbred, così come linee geneticamente modificate, sono disponibili e utilizzati abitualmente nei laboratori di tutto il mondo. L'iniezione della vena della coda è uno dei metodi essenziali nei modelli di roditori che richiedono la somministrazione endovenosa (i.v.) di agenti sperimentali. Generalmente, le iniezioni i.v. presentano importanti vantaggi rispetto ad altre vie di somministrazione come alti tassi di assorbanza bypassando i tessuti locali e il tratto digestivo e un'elevata tolleranza a soluzioni di una vasta gamma di concentrazioni o pH non fisiologico1,2,3,4. Tra le altre vie i.v. praticabili (ad esempio, vene safene, seno venoso retro-orbitale), le vene della coda sono considerate i vasi sanguigni più sicuri e facilmente accessibili neiroditori 2,3,5,6. Quindi, l'iniezione della vena della coda è stata ampiamente utilizzata in una serie di modelli di roditori tra cui modelli di malattie infettive7,8,9,trapianto di materiali biologici10,11,valutazione di terapie precliniche12,13e analisi tossicologiche14,15.

La coerenza e l'accuratezza del dosaggio sono un requisito fondamentale per il successo delle iniezioni di vena della coda. Sorprendentemente, la valutazione quantitativa e qualitativa delle iniezioni di vena della coda in letteratura implica frequenti iniezionierrate 16,17. Uno studio ha riportato che dodici iniezioni su trenta eseguite da iniettori addestrati hanno lasciato più del 10% delle dosi iniettate all'interno della coda18. Inoltre, la sicurezza e il comfort dell'animale che riceve iniezioni di vena della coda dovrebbero essere una preoccupazione primaria durante la procedura. Una contenzione impropria può portare a lesioni e una serie di patologie legate allo stress (ad esempio, perdita di peso, risposte immunitarie alterate) che potrebbero introdurre variabili sostanziali nella qualità del campione19,20. Questi errori possono causare una maggiore variabilità dei dati e una scarsa riproducibilità, influenzando così negativamente i risultati dello studio.

L'induzione della dilatazione vascolare nell'animale è spesso necessaria quando si eseguono iniezioni di vena della coda a causa del piccolo diametro del vaso, stimato in 300 μm nei topi21. La vasodilatazione migliora la visibilità delle vene della coda e aiuta a raggiungere un allineamento ottimale ago-vena all'interno del lume venoso. Una varietà di metodi sono stati segnalati dai laboratori come immergere la coda in acqua calda22, applicare calore alla coda usando un drappo caldo, una lampada o un asciugacapelli23,24, o posizionare l'animale in un ambiente caldo usando una piastra riscaldante, un'incubatrice o una scatola combinata con una di queste fonti di calore25. I dispositivi possono essere fatti da sé per scopi specifici o disponibili presso fornitori commerciali. Tuttavia, molti mancano di capacità di termoregolazione e, se ce ne sono, la temperatura del dispositivo è mal mantenuta e spesso soggetta a variazioni della temperatura ambiente. Allo stesso modo, l'uso di un dispositivo di ritenuta è necessario per le iniezioni di vena della coda in quanto l'uso dell'anestesia non è raccomandato26,27. Sono stati sviluppati diversi tipi di dispositivi di ritenuta specifici per laboratorio o commerciali. Tipicamente, l'animale viene posto in un tubo conico monouso da 50 ml4,pareti in plexiglass a fessura, un tunnel o un cono28,che consentono un'ampia esposizione della coda limitando i movimenti dell'animale. Tuttavia, la maggior parte dei freni ha limitazioni di dimensioni a causa della rigidità dei materiali. Inoltre, i moderni dispositivi ad alta complessità, nonostante i design pratici e sofisticati, non sembrano essere fattibili per iniezioni che coinvolgono grandi gruppi di animali22.

I modelli murini di infezione del flusso sanguigno e sepsi associata sono un ottimo esempio di situazioni che richiedono l'uso di questa tecnica. Tra tutte le eziologia microbiche della sepsi clinica grave, la sepsi fungina è spesso una condizione fatale con tassi di mortalità del >40% nonostante la terapia antifungina29. Infatti, l'infezione da Candida albicans è stata segnalata come la quarta causa principale di infezione del flusso sanguigno acquisita in ospedale (candidemia)30,31. Nella candidosi intra-addominale, i microrganismi nel tratto gastrointestinale possono diffondersi attraverso il flusso sanguigno e causare sepsi polimicrobica con una mortalità ancora maggiore32,33,34. Poiché la maggior parte dei casi di candidemia nosocomiale emergono da cateteri di linea centrale contaminati o dispositivi medici a dimora35,36, l'inoculazione endovenosa con C. albicans mediante iniezione della vena della coda può rispecchiare da vicino lo sviluppo della sepsi umana ed è stato un metodo di base in un modello murino di candidosi ematogenamente disseminata37,38. In questo modello, la mortalità che si verifica in giorni può essere estesa o abbreviata regolando l'inoculo C. albicans i.v.39,40,41.

Recentemente, il nostro laboratorio ha sviluppato un protocollo innovativo per un'iniezione della vena della coda ottimizzata in modo ottimale utilizzando un dispositivo innovativo dotato di un'unità di riscaldamento termoregolata, abbinata a un'unità di ritenuta regolabile, in un unico comodo sistema. Questo protocollo consente ai ricercatori di eseguire iniezioni di vena della coda in modo accurato e tempestivo, mentre gli animali possono essere condizionati e trattenuti in modo sicuro per la procedura con il minimo disagio. Le tecniche qui dimostrate, con l'uso del dispositivo avanzato di riscaldamento e contenimento, potrebbero servire come strumento utile in varie aree di ricerca che impiegano modelli di roditori.

Protocollo

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Tutti i protocolli animali che prevedono iniezioni di vene della coda e l'uso del dispositivo di riscaldamento / contenimento sono stati esaminati e approvati dal comitato istituzionale per la cura degli animali (IACUC) locale.

1. Preparazione

  1. Acclimatare gli animali nell'ambiente abitativo per almeno 1 settimana e consentire cibo e acqua ad libitum.
    NOTA: Per la maggior parte dei nuovi utenti di questa tecnica di iniezione, i ceppi animali con pelliccia bianca o di colore chiaro possono essere preferibili in quanto le vene della coda sono facilmente visibili attraverso la pelle. I ceppi di topi di colore scuro (ad esempio, C57BL / 6) o ratti (ad esempio, Brown Norway) hanno code profondamente pigmentate, con conseguente debole contrasto di colore contro la vena. Si raccomanda vivamente che i nuovi utenti ricevano una formazione adeguata fino al raggiungimento della competenza.
  2. Agenti per iniezione della vena della coda
    1. Preparare tutti gli agenti e le soluzioni di test in modo asettico. Quando si somministrano organismi o materiali cellulari, prendere precauzioni durante tutte le fasi della lavorazione per mantenere condizioni prive di pirogeni.
    2. Utilizzare solo soluzione salina normale (0,9% p /v di cloruro di sodio) o soluzioni saline bilanciate come la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come veicoli per l'iniezione della vena della coda.
      ATTENZIONE: Non utilizzare mai acqua, olio o soluzioni viscose a causa del potenziale rischio di danni vascolari. Una vasta gamma di pH (4,5-8,0) è tollerabile a causa dell'effetto tampone del sangue e delle velocità di flusso sanguigno veloci nei roditori. Tuttavia, soluzioni altamente acide o alcaline possono causare inutili danni ai tessuti nel sito di iniezione e devono essere evitate.
    3. Limitare al minimo il volume e la frequenza di iniezione. Utilizzare i volumi raccomandati per topi e ratti (≤200 μL e ≤500 μL, rispettivamente) a temperatura corporea prima dell'iniezione per ridurre al minimo lo stress per l'animale3.
    4. Assicurarsi che ogni preparazione della siringa e dell'ago sia priva di bolle d'aria nella soluzione; se sono presenti bolle, eliminarle completamente per prevenire il rischio di embolia.
      NOTA: In genere, siringhe da 1 mL con aghi da 27 G, 1/2 in sono adeguate per la maggior parte delle iniezioni di vena della coda.
    5. Utilizzare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) richiesti dalla IACUC locale con il minimo di camici monouso o dedicati e guanti in lattice o nitrile. L'uso di occhiali di sicurezza è altamente raccomandato quando si esegue l'iniezione della vena della coda.
  3. Il dispositivo di riscaldamento e contenimento
    1. Ispezionare attentamente tutti i componenti prima dell'uso per assicurarsi che il dispositivo sia privo di difetti (Figura 1).
    2. Inizializzazione del dispositivo di riscaldamento (Figura 2A)
      1. Posizionare l'unità di riscaldamento su un piano di lavoro piatto pulito e accendere il dispositivo. Assicurarsi che la spia di alimentazione del termostato sia accesa di verde. Posizionare i materiali della lettiera all'interno della camera di riscaldamento per mantenere l'area asciutta e trattenere il calore.
    3. Configurazione del dispositivo di ritenuta (Figura 2B)
      1. Posizionare l'unità di ritenuta accanto all'unità di riscaldamento e determinare le dimensioni del cono appropriate per l'animale. Se necessario, regolare manualmente le larghezze di base del cono di alluminio flessibile per fornire un adeguato contenimento per l'animale. In alternativa, sostituire il cono con modelli personalizzati per ospitare topi o ratti di varie dimensioni corporee.

2. Iniezione della vena della coda

  1. Regolazioni degli apparecchi
    1. Impostazione della temperatura interna
      1. Utilizzando la ghiera di controllo, impostare il termostato alla temperatura desiderata. Assicurarsi che l'indicatore del riscaldatore sia illuminato di rosso e che la lampadina si illumini. Monitorare attentamente la visualizzazione della temperatura interna mentre la lampadina è illuminata (riscaldamento). Il termostato inattiva automaticamente la lampadina una volta raggiunta la temperatura target, approssimativamente in 10-15 minuti.
        NOTA: l'impostazione di una temperatura superiore alla temperatura ambiente attiva il riscaldatore. In generale, la temperatura di alloggiamento raccomandata in condizioni di vivaio standard varia, compresa tra 20 e 26 °C, mentre la temperatura neutra (cioè confortevole) per i topi da laboratorio è considerata compresa tra 30 e 32 °C42. Pertanto, si raccomanda che la temperatura interna della camera di riscaldamento sia leggermente superiore alla termoneutralità, approssimativamente a 32-36 °C. Non impostare mai il termostato al di sopra della temperatura corporea.
    2. Posizionamento della piattaforma di ritenuta
      1. Utilizzando la manopola di regolazione dell'altezza, regolare l'altezza del cono al livello ottimale per l'utente.
  2. Trattamento termico (Figura 3A)
    1. Una volta raggiunta la temperatura target (32-36 °C), trasferire delicatamente gli animali dalla gabbia di stabulazione nella camera di riscaldamento.
      NOTA: Il trattamento termico per 5-10 minuti è sufficiente per indurre la vasodilatazione e migliorare la visibilità delle vene della coda. Tuttavia, gli animali possono essere tranquillamente tenuti nella camera termoregolata per tutta la durata della procedura (in genere 20-30 minuti senza alcun segno di ipertermia). La camera di riscaldamento può contenere in modo sicuro 4-6 topi o un ratto.
    2. Monitorare l'animale per eventuali segni di stress da calore acuto (ad esempio, respirazione rapida, letargia, comportamento di fuga di salto).
      ATTENZIONE: Gli animali che presentano segni di ipertermia devono essere riportati nella loro gabbia e monitorati fino a quando non riprendono la normale attività prima del riutilizzo. Se ciò è dovuto al fatto che la temperatura interna supera l'intervallo ottimale, assicurarsi che il dispositivo di riscaldamento sia spento.
  3. Fasi di iniezione
    1. Sollevare l'animale dalla base della coda e rimuoverlo dalla camera di riscaldamento. Introdurre l'animale sull'apertura del cono dell'unità di ritenuta.
      ATTENZIONE: non sollevare mai i topi dall'estremità della coda; questo può causare gravi lesioni. Metodi alternativi di manipolazione dovrebbero essere usati per topi obesi o gravidi28.
    2. Mentre l'animale si aggrappa al bordo più lontano del cono con le zampe anteriori, tira delicatamente la coda all'indietro e passa la coda attraverso la fessura aperta. Fissare l'estremità posteriore dell'animale alla base del cono con una zampa posteriore che sporge dal cono in modo che la vena laterale sia mostrata in una posizione di ore 12. Entrambe le zampe posteriori possono essere sporgenti in quanto ci sono due vene laterali, una su ciascun lato (Figura 3B).
    3. Afferrare la coda a metà dei due terzi di lunghezza con la mano non dominante tra il pollice e l'indice, mettendo leggera tensione sulla vena laterale per mantenere il posizionamento della coda e la vasodilatazione.
      NOTA: una maggiore visibilità delle vene dilatate mediante trattamento termico consente all'utente di determinare rapidamente un sito di iniezione per ottenere i migliori risultati (Figura 4).
    4. Pulire la pelle del sito di iniezione con una spugna di garza o un tampone inumidito con alcool al 70%. Pulire il più delicatamente e rapidamente possibile per evitare irritazioni alla coda.
      NOTA: Questa procedura può essere omessa a discrezione della IACUC istituzionale.
    5. Tenere la siringa con la mano dominante e posizionare l'ago parallelamente alla coda. Inserire l'ago verso la direzione del flusso sanguigno, smussare con un angolo di 10-15 ° (Figura 5A-B) e avanzare ulteriormente nel lume della vena penetrando 2-4 mm (Figura 5C-D). Iniettare lentamente la soluzione.
      NOTA: se l'iniezione ha successo, non si deve sentire alcuna resistenza sullo stantuffo e il fluido può essere visto muoversi attraverso la vena. In caso di resistenza o vesciche bianche sopra il sito di iniezione, rimuovere l'ago e tentare una seconda iniezione in un sito sopra il posizionamento originale dell'ago. Non tenti di iniettare al di sotto del sito di iniezione iniziale poiché il fluido rilascerà attraverso il sito iniziale. Se l'iniezione di una vena laterale non ha successo, riposizionare l'animale sul lato opposto e fare più tentativi sulla vena controlaterale. Il numero massimo di tentativi dipenderà da dove si inizia il tentativo di iniezione lungo la vena e il gonfiore che può verificarsi con tentativi mancati. Consultare i regolamenti istituzionali IACUC per iniezioni errate e lesioni associate.
    6. Rimuovere l'ago e premere con fermezza con il pollice per evitare il riflusso della soluzione iniettata e/o del sangue. Continuare ad applicare una compressione delicata con una garza/salvietta pulita o un tessuto fino a quando il sanguinamento non si è fermato (Figura 6).
    7. Riportare l'animale nella sua gabbia e monitorare per almeno 5 minuti. Assicurarsi che l'animale riprenda la normale attività senza ulteriori sanguinamenti.

3. Un modello murino di infezione fungina del flusso sanguigno e sepsi

  1. Ceppi di topo
    1. Acclimate female Swiss Webster ha superato i topi a 6 settimane di età secondo le linee guida istituzionalmente raccomandate. In alternativa, utilizzare ceppi inbred/geneticamente modificati (ad esempio, C57BL/6 background) per questo protocollo con inoculi modificati (vedi NOTA).
      NOTA (vedi Discussione per i dettagli): Le vene della coda dei topi con pelliccia scura sono spesso meno visibili di quelle con pelliccia più chiara a causa della coda profondamente pigmentata (Figura 4). C'è una diversa suscettibilità alla sepsi fungina / letalità tra diversi ceppi di topo. L'uso di ceppi di topo diversi da Swiss Webster può richiedere un'ulteriore ottimizzazione del protocollo considerando fattori rilevanti (ad esempio, background genetico, età, sesso, dimensioni corporee) che potrebbero influenzare lo stato immunitario dell'ospite. Ad esempio, una sfida letale nei topi C57BL/6 richiede in genere inoculi più elevati (fino a 10x) per raggiungere il livello di mortalità osservato nei topi Webster svizzeri.
  2. Microrganismi
    1. Per una sfida letale (sepsi), strisciare le scorte congelate di Candida albicans ceppo DAY185 (o ceppi a scelta) su Sabouraud destrosio agar e incubare a 30 °C per 2 giorni.
    2. Trasferire una singola colonia in 10 ml di brodo di estratto di lievito-peptone-destrosio e colturare nella fase stazionaria di crescita per 18 ore a 30 °C con agitazione.
  3. Soluzioni per inoculi
    1. Il giorno di una sfida letale, raccogliere la coltura del brodo e lavare il pellet 3 volte per centrifugazione (800 × g)in PBS sterile.
    2. Identificare le cellule di lievito vitali mediante esclusione del colorante blu trypan ed enumerare utilizzando un emocitometro. Regolare la concentrazione cellulare a 1 x10 6 cellule/mL in PBS sterile a temperatura ambiente.
      NOTA: Ogni animale riceverà 100 μL della soluzione di inoculo. Preparare un volume in eccesso dell'inoculo (>500 μL) per consentire una potenziale perdita durante la procedura di iniezione. L'inoculo finale è 1 x 105 cellule per topo. Il volume dell'inoculo può essere aumentato fino a 200 μL regolando di conseguenza la concentrazione cellulare.
      ATTENZIONE: La soluzione di inoculo fungino deve essere mantenuta a temperatura ambiente prima dell'iniezione. Il riscaldamento della soluzione di inoculo alla temperatura corporea può indurre un cambiamento morfologico dalle cellule di lievito alle ife. Al contrario, la somministrazione in bolo di soluzioni fredde può abbassare rapidamente la temperatura corporea dell'animale e dovrebbe essere evitata.
  4. Inoculazione endovenosa
    1. Riscaldare gli animali e indurre la vasodilatazione seguendo le procedure di cui al paragrafo 2.
    2. Iniettare 100 μL della soluzione di inoculo nella vena della coda utilizzando una siringa da 1 mL con un ago da 27 G, 1/2 pollici.
  5. Monitoraggio post-inoculazione
    1. Monitorare gli animali per i seguenti segni di morbilità indotta da sepsi: i) aspetto del pelo (ad esempio, liscio, arruffato), ii) attività (ad esempio, muoversi liberamente, non rispondente), iii) postura (ad esempio, curvo, rigido), iv) comportamento (ad esempio, lento, nessun trasferimento), v) movimenti del torace (ad esempio, respirazione normale, dispnea), vi) palpebre (ad esempio, aperto, chiuso)43.
  6. Punteggio sepsi
    1. Valutare la morbilità osservata in base a un punteggio di valutazione clinica del topo modificato per la sepsi (M-CASS) in una scala di classificazione a quattro punti da 0 a 3 in ciascuna categoria: 0, normale; 1, lieve; 2, moderato; 3, grave43.
  7. Protocollo opzionale: vaccinazione contro la sepsi fungina
    1. Quattordici giorni prima di una sfida letale, inoculare topi con Candida dubliniensis ceppo Wü284 o ceppi attenuati di C. albicans, come Δefg1/Δcph1 mutante (1x105 cellule per topo), come descritto nei paragrafi 3.2-3.4 al posto di C. albicans DAY185.
    2. Condurre una sfida letale nei topi vaccinati, come descritto nei settori 3.2–3.4, e monitorare i segni di morbilità indotta da sepsi descritti nei tratti 3.5–3.6.

Risultati

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La temperatura all'interno della camera di riscaldamento viene continuamente rilevata dal sensore interno e autoregolata dal termostato. Innanzitutto, la ghiera di controllo del termostato è stata posizionata a 78, 85, 90 o 95 ° F (26, 29, 32 o 95 ° C) per selezionare le temperature impostate. Una volta attivato il riscaldatore(Figura 7,punti gialli), l'emissione di calore da parte della lampadina ha rapidamente aumentato la temperatura interna durante i primi 5-15 minuti, a seconda della temperatura impostata. Il riscaldatore ha disattivato la lampadina se la temperatura interna rilevata ha superato la temperatura impostata (punti grigi). Le temperature di picco iniziali dovrebbero salire a 5-7 °C al di sopra delle temperature impostate in tutti i gruppi per compensare la perdita di temperatura durante il trasferimento degli animali. Successivamente, il dispositivo continua a ripetere automaticamente il ciclo di calore e mantiene la camera di riscaldamento alla temperatura impostata.

Un esempio di dati sperimentali ottenuti da iniezioni di vena della coda di successo utilizzando il protocollo corrente è mostrato nella Figura 8. In un modello murino di candidosi del flusso sanguigno con conseguente sepsi, una sfida per via e.v. con Candida albicans (1 x 105 cellule per topo) nei topi Webster svizzeri ha causato una rapida insorgenza di sepsi e la diffusione degli organismi, portando ad un'elevata mortalità entro 3-4 giorni (punti aperti) (Figura 8A). Al contrario, gli animali potrebbero essere protetti dalla sepsi mediante una precedente pre-immunizzazione/vaccinazione per via e.v. con un ceppo di lievito avirulento, Candida dubliniensis,raggiungendo una sopravvivenza >95% a seguito della letale sfida per via e.v. con C. albicans virulenti (punti solidi). Questi risultati in mortalità progressiva rispetto alla protezione mediata dal vaccino sono stati ottenuti in modo riproducibile in quattro esperimenti indipendenti (Figura supplementare 1). Una protezione simile potrebbe essere ottenuta utilizzando altri ceppi di lievito avirulento come i mutanti attenuati di C. albicans (Δefg1/Δcph1) (dati non mostrati). Anche la sepsi potrebbe essere monitorata e correlata alla mortalità; gli animali non vaccinati con infezione letale hanno avuto un aumento significativo della morbilità indotta dalla sepsi, mentre il gruppo vaccinato ha mostrato sintomi minimi dopo la sfida letale (Figura 8B).

Esperimento di conducibilità termica; misura dell'emissività a infrarossi; apparecchio; configurazione sperimentale.
Figura 1: Descrizione del dispositivo di riscaldamento e di ritenuta dei roditori. A) mostra la vista esterna del dispositivo di riscaldamento, che consiste in:

  1. Coperchio del termostato: sollevare verso l'alto dalla maniglia per esporre il termostato
  2. Involucro elettrico – sigillato in modo permanente per la protezione
  3. Coperchio della camera - sollevare verso l'alto durante il trasferimento dell'animale da / verso
  4. Camera di riscaldamento – rimovibile, coprire il pavimento con biancheria da letto prima dell'uso
  5. Apparecchio di ritenuta – riponibile con il dispositivo di riscaldamento mentre non è in uso
  6. Interruttore di alimentazione – interruttore a bilanciere in linea per le principali funzioni di accensione/spegnimento
  7. Cavo di alimentazione - tensione / corrente: 120V / 10A

B) mostra l'interno del dispositivo di riscaldamento:

  1. Lampadina a incandescenza – emissione luminosa a 100 Watt
  2. Schermo protettivo della lampadina – rimovibile per la sostituzione della lampadina
  3. Sonda sensore di temperatura – situata all'interno della camera
  4. Termometro di temperatura interno – posto all'interno della camera per il monitoraggio della temperatura

C) mostra i componenti del termostato del dispositivo di riscaldamento:

  1. Termometro di temperatura interno
  2. Termostato – autoregola il riscaldatore
  3. Leva di controllo del setpoint – minimo/massimo: 78 °F/108 °F (25 °C/42 °C)
  4. Indicatore di potenza del termostato: la luce verde indica il normale funzionamento
  5. Indicatore del riscaldatore del termostato - illuminato di rosso durante il ciclo di riscaldamento

D) mostra i componenti del dispositivo di ritenuta:

  1. Cono – foglio di alluminio flessibile progettato per il contenimento dei roditori
  2. Canale di coda – sagomato per consentire un posizionamento regolare della coda
  3. Piattaforma di sollevamento a cono - fornisce un robusto sollevamento della base del cono
  4. Manopola di regolazione dell'altezza – progettata per la regolazione manuale dell'altezza
  5. Jack a forbice – gamma di altezza da 45-140 mm (1,77-5,52")
  6. Piastra di supporto - installata con piedini in gomma per fornire stabilità Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Configurazione della spettroscopia con apparecchiatura di eccitazione ottica in laboratorio, due viste etichettate A e B.
Figura 2: Il dispositivo di riscaldamento e di contenimento dei roditori. (A) Prima dell'uso, le due parti del dispositivo sono affiancate su un piano di lavoro pulito. (B) Una volta acceso il dispositivo di riscaldamento, il termostato attiva il riscaldatore. La lampadina rimane accesa ed emette calore fino a quando la camera di riscaldamento non ha raggiunto la temperatura impostata. Il dispositivo di riscaldamento ripete automaticamente il ciclo di calore per mantenere la temperatura interna. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Configurazione dello studio comportamentale del topo; immagine A: osservazione dell'habitat dei topi, immagine B: apparecchio per test di inclinazione.
Figura 3: Topi (C57BL/6) collocati nel dispositivo di riscaldamento e di ritenuta. (A) Topi sottoposti a trattamento termico per vasodilatazione. Gli animali (4-6 topi per trattamento) vengono trasferiti dalla loro gabbia abitativa nella camera di riscaldamento del dispositivo e trattati termicamente per un minimo di 5-10 minuti. (B) Un topo trattenuto per l'iniezione della vena della coda. Il mouse viene trasferito dalla camera di riscaldamento all'apertura del cono del dispositivo di ritenuta con la coda che passa attraverso la fessura aperta. Il mouse viene delicatamente tirato all'indietro fino al bordo più lontano del cono fino a quando la base della coda raggiunge la punta del cono. Poiché l'animale viene attirato verso la base del cono con una leggera rotazione laterale, una zampa posteriore è posizionata verso l'alto in modo che sporga dalla fessura aperta consentendo di posizionare la vena laterale della coda a ore 12. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Biopsie della coda di roditore, tabella di confronto dei metodi per lo studio della ricerca.
Figura 4: Identificazione delle vene laterali della coda nei topi. (A) La coda di un topo Webster svizzero non trattato. Il mouse viene inserito nel dispositivo di ritenuta senza previo trattamento termico per la vasodilatazione. La vena laterale della coda può essere identificata come un sottile vaso scuro che scorre sotto la pelle. (B) La coda di un topo Webster svizzero trattato con il dispositivo di riscaldamento per 10 min. Il topo trattato termicamente viene trattenuto per l'iniezione della vena della coda. La vena laterale della coda è facilmente visibile attraverso la pelle a causa del diametro del vaso allargato indotto dalla vasodilatazione. (C) La coda di un topo C57BL/6 trattato con il dispositivo di riscaldamento per 10 minuti e trattenuto per l'iniezione della vena della coda. La vasodilatazione migliora la visibilità della vena della coda attraverso la pelle profondamente pigmentata, anche se la vena non è così facilmente visibile come nei topi Webster svizzeri di colore chiaro a causa di un debole contrasto di colore contro la vena. Le frecce rosse denotano la posizione della vena laterale della coda. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Esperimento di iniezione di tessuto muscolare di topo, analisi comparativa, immagine a quattro pannelli, etichettata Topo 1 e 2.
Figura 5: Iniezione della vena della coda eseguita in topi trattati termicamente (Swiss Webster). (A–B) Inserimento dell'ago nella vena laterale della coda nel sito di iniezione. L'ago (27 G, 1/2-in) è posizionato parallelamente alla vena della coda con la smussatura verso l'alto e puntato verso il flusso sanguigno e inserito. (C–D) Posizionamento dell'ago nella vena della coda e iniezione. La punta dell'ago è ulteriormente avanzata di 2-4 mm nel lume della vena. Il pollice è posizionato sullo stantuffo della siringa e il volume desiderato viene erogato con una pressione lenta e costante. I cerchi ovali indicano i siti di iniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Procedura di biopsia della coda di topo, diagramma che mostra il metodo per il campionamento dei tessuti nell'analisi genetica.
Figura 6: Procedura post-iniezione. (A) Un'area di sanguinamento nel sito di iniezione. Sanguinamento e riflusso della soluzione iniettata si verificano immediatamente dopo la rimozione dell'ago. Questo può essere ridotto al minimo applicando una solida compressione sul sito di iniezione con il pollice. (B) Formazione di coaguli di sangue nel sito di iniezione. La compressione delicata con una garza / salvietta pulita facilita la coagulazione del sangue sulla ferita da iniezione. Le frecce indicano i siti di iniezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Grafico della temperatura interna della camera, ciclo di calore, intervallo ottimale, temperatura impostata, tempo rispetto a °C.
Figura 7: La temperatura interna della camera di riscaldamento durante l'uso. Il dispositivo di riscaldamento è stato attivato per il riscaldamento alle temperature impostate designate. La camera di riscaldamento del dispositivo è stata monitorata per la temperatura interna dell'aria e i cicli di calore (lampadina accesa / punti gialli, punti spenti / grigi) sono stati registrati nell'arco di 45 minuti. L'area arancione indica l'intervallo di temperatura ottimale per l'induzione della vasodilatazione nei roditori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Grafico del punteggio di sopravvivenza e sepsi; giorni post-sfida letale; confronto dei dati; ricerca biomedica.
Figura 8: Mortalità per sepsi vs protezione mediata da vaccino a seguito di una sfida letale con Candida albicans. I topi (femmine svizzere Webster di 8 settimane) sono stati vaccinati per via endovenosa con Candida dubliniensis Wü284 (Cd) avirulenta viva , seguita da una sfida endovenosa letale con C. albicans WILD DAY 185 (1 x 105 cellule per topo) 14 giorni dopo. (A)La mortalità è stata valutata nell'arco di 10 giorni dopo la sfida letale. (B) Gli animali sono stati monitorati per la morbilità da sepsi e valutati in base a un punteggio di valutazione clinica del topo modificato per la sepsi (M-CASS)43. I dati sono cumulativi di 4 esperimenti indipendenti con 10 topi per gruppo e analizzati utilizzando il test log-rank di Mantel-Cox. p < 0,0001. SEM, errore standard della media. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1: Riproducibilità della mortalità per sepsi e sopravvivenza mediata da vaccino da una sfida di Candida albicans nel flusso sanguigno. Ogni pannello rappresenta i dati di quattro esperimenti indipendenti inclusi in un risultato cumulativo mostrato nella Figura 8A. Ogni esperimento è stato condotto utilizzando 10 topi per gruppo e analizzato utilizzando il test log-rank di Mantel-Cox. Ca, Candida albicans. Cd, Candida dubliniensis. p < 0,0001. p < 0,01. Fare clic qui per scaricare questa figura.

Discussione

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Un dosaggio coerente e accurato sono requisiti chiave per l'affidabilità sperimentale nei modelli animali. Ciò è particolarmente importante nei casi di somministrazione per via e.v. in cui la biodisponibilità sistemica degli agenti iniettati è considerevolmente più elevata/più veloce rispetto ad altre vie di somministrazione3. Pertanto, gli errori nell'iniezione della vena della coda potrebbero avere un impatto negativo sui risultati dello studio. Storicamente, l'iniezione intraperitoneale (i.p.), piuttosto che i.v., è stato il metodo più comune per l'accesso sistemico nei roditori a causa della semplicità tecnica e della convenienza. Tuttavia, le vie di somministrazione diventano più cruciali quando si traducono le lettura precliniche dagli animali in contesti clinici. Quindi, c'è bisogno di un miglioramento continuo nei protocolli dei roditori che potrebbero facilitare il successo dell'iniezione della vena della coda.

Il progresso chiave nel presente protocollo è l'innovativo dispositivo di riscaldamento termoregolato che consente un'efficace induzione della vasodilatazione nei roditori, che migliora notevolmente la visibilità delle vene della coda e l'allineamento dell'ago. I metodi di riscaldamento che sono scarsamente termoregolati (ad esempio, lampade), vasodilatatori topici o irritanti per la pelle (ad esempio, xileni) non sono solo inaffidabili, ma sono anche pericolosi per l'animale e dovrebbero essere evitati44. Contrariamente ad altri metodi convenzionali, come l'immersione della coda in acqua tiepida, la capacità di autoregolazione di questo dispositivo può condizionare in modo sicuro più animali contemporaneamente. Inoltre, questo protocollo viene ulteriormente rafforzato utilizzando il dispositivo di ritenuta progettato in modo ottimale e consentendo un'immobilizzazione rapida e sicura dell'animale in una posizione che mostra meglio la vena laterale della coda.

I formati tubolari trasparenti visti in molti restrainer attuali, sebbene praticamente ben progettati, richiedono più tempo di manipolazione con ogni animale, prolungando così il processo di ritenuta45. Questo può essere più problematico nei ceppi di roditori con tratti aggressivi che offrono una cooperazione limitata46,47. Al contrario, la struttura a cono semi-chiusa del dispositivo di ritenuta consente un rapido posizionamento dell'animale e aiuta a ridurre al minimo la durata del contenimento. Insieme, il protocollo semplificato che utilizza l'innovativo sistema di riscaldamento/contenimento altamente ottimizzato accelera la procedura di iniezione, consentendo un dosaggio rapido ed efficace di grandi gruppi di animali. Nel nostro laboratorio, in genere completiamo un'intera procedura di iniezione di 30 topi dal trattamento termico al monitoraggio post-iniezione entro 1 ora utilizzando questo protocollo.

Nonostante le funzionalità avanzate, questo dispositivo presenta alcuni apparenti svantaggi: il primo è il costo del dispositivo e la sostituzione della lampadina di routine nella camera di riscaldamento. Tuttavia, oltre all'efficienza e alla velocità delle iniezioni, il dispositivo è durevole per l'uso ripetuto e compatibile con i disinfettanti più comuni, consentendo un'accurata pulizia del dispositivo tra un uso e l'altro. Insieme, questo compensa l'investimento iniziale. Insituazioni con spazio di lavoro limitato, uno svantaggio di questo protocollo può essere la necessità di un'area di panca dedicata abbastanza grande da posizionare le due unità, fianco a fianco, durante l'esecuzione dell'iniezione. Tuttavia, poiché il dispositivo può essere ampiamente utilizzato in diversi protocolli di roditori che coinvolgono iniezioni i.v., è possibile che il dispositivo possa servire come strumento principale simile ad altre apparecchiature di vivaio comuni come i vaporizzatori isoflurano. Indipendentemente da ciò, le due unità sono facilmente trasportabili e possono essere raggruppate e riposte mentre non sono in uso.

Il modello di sfida i.v. letale della sepsi fungina murina descritto in questo protocollo imita da vicino le infezioni del flusso sanguigno di C. albicans nell'uomo ed è stato ampiamente utilizzato per studiare la virulenza fungina, testare l'efficacia delle terapie antifungine e caratterizzare le risposte immunitarie dell'ospite all'infezione37,39,48. Per ottenere un'infezione riproducibile, l'inoculazione endovenosa tramite iniezione della vena della coda è il passo più vitale del protocollo per garantire una consegna accurata degli organismi nel flusso sanguigno. In effetti, gli animali rispondono in modo molto diverso ai vari livelli di sfide per via e-v.; la somministrazione di quantità troppo basse di inoculo comporterà recuperi spontanei indesiderati, mentre gli animali che ricevono dosi troppo elevate soccomberanno prematuramente. La finestra specifica delle dimensioni dell'inoculo per un dato organismo per indurre un livello costante di sepsi / mortalità dipende in gran parte sia dai ceppi fungini che dai ceppi di topo.

L'attuale protocollo che utilizza topi Webster svizzeri all'inoculo di 1 x 105 wild-type C. albicans ha indotto in modo riproducibile l'insorgenza della morbilità da sepsi entro 1 giorno, seguita da una mortalità progressiva con conseguente letalità al 100% di 5-7 giorni. Al contrario, gli inoculi superiori a 1 x 105 in genere portano a morti accelerate (cioè 1-2 giorni a 1 x 106, 3-4 giorni a 5 x 105), e quelli inferiori a 1 x 105 sono sub-letali. In linea con numerosi riporti in letteratura, l'uso di specie candida nonalbicans al posto di C. albicans si traduce in una significativa diminuzione della letalità40,49. Inoltre, la scelta dei ceppi di topo, o anche l'origine delle colonie, può avere un impatto considerevole sugli esiti delle infezioni a causa delle diverse suscettibilità tra i ceppi di topo, come riportato da altri39,40,41,50,51,52,53,54,55. Quindi, entrambi dovrebbero essere presi in considerazione quando si progettano esperimenti.

A seguito di una letale sfida per vie e.v., le cellule fungine si diffondono rapidamente attraverso il flusso sanguigno e iniziano a invadere più organi, tra cui i più colpiti sono i reni41. Altri organi colpiti sono il cervello, la milza e il midollo osseo48,56. Indipendentemente da ciò, la sepsi acuta è la causa ultima di morte ai primi puntitemporali 37. Come mostrato nei risultati rappresentativi, la gravità della sepsi può essere valutata quantitativamente dal Mouse Clinical Assessment Score for Sepsis (M-CASS) sulla base dei segni mostrati di una condizione di sepsi negli animali sfidati43,57. Tra i numerosi marcatori surrogati di sepsi letale, l'ipotermia è stata suggerita come predittore critico per la morte imminente nella sepsi sia clinica che sperimentale43,58,59.

Sebbene non siano stati condotti studi formali per confrontare direttamente topi consanguinei e topi di razza in questo modello, i dati ottenuti dall'attuale protocollo utilizzando topi Webster svizzeri di razza sono eccezionalmente riproducibili in vari parametri di sepsi, nonostante la presunta eterogeneità genetica. Generalmente, un modello di mortalità che cade entro 3-5 giorni è un modello solido di sepsi acuta, come evidenziato dal rapido aumento della morbilità della sepsi e dei livelli di marcatori infiammatori entro poche ore dalla sfida post-letale50,51. Per tempi di sopravvivenza più lunghi (7-10 giorni), la mortalità è probabilmente il risultato di un carico microbico che porta a danni tissutali letali negli organi bersaglio e nel sistema nervoso centrale. La scelta della sepsi o del carico microbico può essere applicata come necessario per valutare le funzioni immunitarie o le risposte a regimi antinfiammatori o terapie / vaccini antifungini, come determinato dall'inoculo utilizzato.

Oltre al modello di sfida i.v. letale, l'infezione intra-addominale con C. albicans nei topi tramite una sfida i.p. può anche portare a candidosi disseminata e successiva sepsi, sebbene la co-inoculazione con il patogeno batterico, Staphylococcus aureus, aumenta sinergicamente la mortalità rispetto a C. albicans mono-infezione51,60,61. Nel modello di sfida letale i.p., sono necessari inoculi microbici sostanzialmente più elevati (1,75 x10 7C. albicans/8 x10 7S. aureus per topo) per causare peritonite polimicrobica e diffusione degli organismi dalla cavità addominale nel flusso sanguigno. Allo stesso modo, l'infezione gastrointestinale da C. albicans nei topi trattati con agenti immunosoppressivi e/o dannosi per le mucose porta alla traslocazione delle cellule fungine nel flusso sanguigno e provoca sepsi fungina62,63. Nonostante le vie di inoculazione distintive, il meccanismo della conseguente sepsi fungina è in gran parte analogo tra i tre modelli di malattia, coinvolgendo una risposta proinfiammatoria sistemica incontrollata alla Candida che porta all'insufficienza d'organo37,51,61. Allo stesso modo, nell'uomo, è questo processo di risposta dell'ospite, non semplicemente candidemia, che causa l'elevata morbilità / mortalità associata alla candidosi ematogenamente disseminata acquisita in contesti sanitari64,65.

Utilizzando l'attuale modello di sepsi fungina, dimostriamo qui che la protezione contro l'infezione letale da C. albicans può essere ottenuta attraverso la pre-immunizzazione / vaccinazione i.v. con C. dubliniensis (avirulenta) o mutanti attenuati di C. albicans, in concomitanza con una significativa riduzione della morbilità della sepsi. La protezione è mediata da cellule soppressori innate gr-1+ derivate dal mieloide che sembrano essere indotte nel midollo osseo come una forma di immunità innata addestrata66,67. Sono in corso sforzi per estendere la comprensione di questa nuova forma di protezione immuno-mediata innata contro le infezioni del flusso sanguigno di C. albicans.

In conclusione, l'innovativo dispositivo di riscaldamento/ contenimento dei roditori è stato determinante nel far progredire la nostra capacità di eseguire iniezioni i.v. di studi su animali multi-gruppo su larga scala in modo efficiente ed efficace. Come tale, abbiamo coniato il termine, Mouse a Minute, per il dispositivo. Le specifiche del dispositivo sono disponibili presso l'autore corrispondente su richiesta di acquisto di un dispositivo simile. Le tecniche qui dimostrate potrebbero servire come strumento utile nei modelli di roditori che impiegano iniezioni di vena della coda in una vasta gamma di aree di ricerca.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla LSUHSC Foundation (PLF), e in parte da U54 GM104940 del National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, che finanzia il Louisiana Clinical and Translational Science Center.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Candida albicans ceppo DAY185Carnegie Melon UniversityN/Afornito dal laboratorio di Aaron Mitchell
Candida albicans ceppo efg1Δ/Δ cph1Δ/Δ Centro di Scienze della Salute dell'Università del TennesseeN/Afornito dal laboratorio di Glen Palmer
Candida dubliniensis ceppo Wü 284Trinity College, Dublino, IrlandaN/Afornito dal laboratorio di Gary Moran
TopiCharles River Laboratories551NCICr:SWFemmina Swiss Webster; 6-8 settimane di età
TopiCharles River Laboratories556NCIC57BL/6Femmina C57BL/6; 6-8 settimane di età
Aghi, 27G, ½-inBecton Dickinson305109può essere sostituito da altri fornitori
La soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)GESH30028.02può essere sostituita da altri fornitori
Dispositivo di riscaldamento e contenimento dei roditori (Mouse a Minute)Ordine personalizzatoLSU HealthMouse a Minute è disponibile per ordini personalizzati da LSU Health
Sabouraud destrosio agar (SDA)Becton Dickinson211584può essere sostituito da altri fornitori
Siringhe, 1 mLBecton Dickinson309659può essere sostituito da altri fornitori Soluzione
blu di tripanoSigmaT8154
Brodo di peptone destrosio di lievitoFisher ScientificBP2469può essere sostituito da altri fornitori

Riferimenti

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