Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Philipp Tomsits; Dominik Schüttler; Stefan Kääb; Sebastian Clauss; Niels Voigt

doi:10.3791/61964

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Articolo metodologico

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca²⁺ e corrente di calcio di tipo L

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DOI:

10.3791/61964

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3 novembre 2020

Philipp Tomsits^*¹^,²^,³ , Dominik Schüttler^*¹^,²^,³ , Stefan Kääb¹^,² , Sebastian Clauss^*¹^,²^,³ , Niels Voigt^*⁴^,⁵^,⁶

¹Department of Medicine I, University Hospital Munich, Campus Großhadern, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), ²Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), ³Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig-Maximilians University Munich (LMU), ⁴Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Göttingen, ⁵Partner Site Göttingen, DZHK (German Centre for Cardiovascular Research), ⁶Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Göttingen

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I modelli murini consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp. Qui viene descritto un metodo per isolare i miociti atriali e ventricolari murini tramite perfusione Langendorff a base di enzimi retrogradi, che consente misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L.

Abstract

I modelli murini svolgono un ruolo cruciale nella ricerca sull'aritmia e consentono di studiare i meccanismi chiave dell'aritmogenesi, tra cui l'alterata funzione dei canali ionici e la manipolazione del calcio. A tale scopo, sono necessari cardiomiociti atriali o ventricolari di alta qualità per eseguire misurazioni patch-clamp o per esplorare anomalie di manipolazione del calcio. Tuttavia, la resa limitata di cardiomiociti di alta qualità ottenuti dagli attuali protocolli di isolamento non consente entrambe le misurazioni nello stesso topo. Questo articolo descrive un metodo per isolare miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità tramite perfusione di Langendorff basata su enzimi retrogradi, per successive misurazioni simultanee di transitori di calcio e corrente di calcio di tipo L da un animale. Si ottengono cuori di topo e l'aorta viene rapidamente incannulata per rimuovere il sangue. I cuori vengono quindi inizialmente perfusi con una soluzione priva di calcio (37 °C) per dissociare il tessuto a livello dei dischi intercalati e successivamente con una soluzione enzimatica contenente poco calcio per distruggere la matrice extracellulare (37 °C). Il cuore digerito viene successivamente sezionato in atri e ventricoli. I campioni di tessuto vengono tagliati in piccoli pezzi e sciolti mediante pipettaggio accurato su e giù. La digestione enzimatica viene interrotta e le cellule vengono gradualmente reintrodotte alle concentrazioni fisiologiche di calcio. Dopo il caricamento con un indicatore fluorescente Ca²⁺, i cardiomiociti isolati vengono preparati per la misurazione simultanea di correnti di calcio e transitori. Inoltre, vengono discusse le insidie dell'isolamento e vengono forniti protocolli patch-clamp e tracce rappresentative di correnti di calcio di tipo L con misurazioni simultanee dei transitori di calcio in miociti murini atriali e ventricolari isolati come descritto sopra.

Introduzione

Le aritmie cardiache sono comuni e rappresentano una delle principali sfide sanitarie attuali poiché colpiscono milioni di persone in tutto il mondo. Le aritmie sono associate ad elevata morbilità e mortalità ^1,2 e rappresentano la causa sottostante della maggior parte delle morti cardiache improvvise³. Le opzioni di trattamento aggiornate hanno migliorato la sopravvivenza dei pazienti, ma sono ancora principalmente trattamenti sintomatici piuttosto che mirati ai meccanismi sottostanti. Pertanto, questi trattamenti hanno un'efficacia limitata e possono spesso causare gravi effetti colla....