Vengono descritte le procedure sperimentali per l'esecuzione di etichette covalenti a base di dietilpirrocarbonato con rilevamento spettrometrico di massa. Il dietilpirrocarbonato viene semplicemente miscelato con il complesso proteico o proteico di interesse, portando alla modifica di residui di amminoacidi accessibili al solvente. I residui modificati possono essere identificati dopo la digestione proteolitica e l'analisi della cromatografia liquida/spettrometria di massa.
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Articolo metodologico
Etichettatura covalente con dietilpirocarbonato per lo studio della struttura proteica di ordine superiore mediante spettrometria di massa
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Caratterizzare la struttura di ordine superiore di una proteina è essenziale per comprenderne la funzione. La spettrometria di massa (SM) è emersa come un potente strumento a questo scopo, specialmente per i sistemi proteici che sono difficili da studiare con i metodi tradizionali. Per studiare la struttura di una proteina da parte della SM, vengono eseguite reazioni chimiche specifiche in soluzione che codificano le informazioni strutturali di una proteina nella sua massa. Un approccio particolarmente efficace è quello di utilizzare reagenti che modifichino covalentemente catene laterali di amminoacidi accessibili ai solventi. Queste reazioni portano ad aumenti di massa che possono essere localizzati con risoluzione a livello di residuo se combinati con digestione proteolitica e spettrometria di massa tandem. Qui descriviamo i protocolli associati all'uso del dietilpirocarbonato (DEPC) come reagente di etichettatura covalente insieme al rilevamento MS. Il DEPC è una molecola altamente elettrofila in grado di etichettare fino al 30% dei residui nella proteina media, fornendo così un'eccellente risoluzione strutturale. Il DEPC è stato utilizzato con successo insieme alla SM per ottenere informazioni strutturali per piccole proteine monodominio, come la β2-microglobulina, a grandi proteine multidominio, come gli anticorpi monoclonali.
Introduzione
Le proteine sono biomolecole essenziali praticamente in ogni processo fisiologico. La varietà di funzioni che le proteine svolgono sono possibili a causa delle strutture che adottano e delle interazioni che hanno con altre biomolecole. Per comprendere la funzione proteica a un livello più profondo, sono necessari strumenti biochimici e biofisici per chiarire queste importanti caratteristiche strutturali e interazioni. Tradizionalmente, la cristallografia a raggi X, la microscopia elettronica criogenica e la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare (NMR) hanno fornito i dettagli desiderati a livello atomico per rivelare la struttura proteica. Tuttavia, numerosi sis....
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Protocollo
1. Preparazione di proteine e reagenti
NOTA: questo protocollo include un flusso di lavoro di esempio per l'etichettatura di una proteina con DEPC. Alcune condizioni e concentrazioni di reagenti elencate possono variare in base alla proteina scelta.
- Preparare tutte le soluzioni di reagente in tubi microcentrifugo da 1,5 ml.
- Preparare una soluzione proteica della concentrazione desiderata, di solito nell'intervallo di decine di μM, in un tampone di acido propanosolfonico (MOPS) 10 mM 3-(N-morfolino) a pH 7,4. In alternativa, preparare una soluzione proteica esistente a scambio tampone in MOPS 7.4 pH 10 mM se il campione c....
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Risultati
Identificazione dei siti di modifica DEPC e delle percentuali di modifica
L'aggiunta di massa dovuta all'etichettatura covalente può essere misurata ai livelli di (a) proteina intatta e (b) peptidici8,9. A livello intatto, una distribuzione di specie proteiche con un numero diverso di etichette può essere ottenuta dall'analisi diretta o LC-MS di campioni proteici etichettati. Per ottenere informazioni strutturali a risoluzione più elevata (ad esempio,.......
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Discussione
Passaggi critici
Per quanto riguarda la progettazione sperimentale, si dovrebbero prendere in considerazione diversi punti per garantire risultati di etichettatura affidabili. In primo luogo, per massimizzare l'etichettatura delle proteine, è necessario evitare tamponi con gruppi fortemente nucleofili (ad esempio Tris) perché possono reagire con DEPC e abbassare l'estensione dell'etichettatura. È anche concepibile che tali tamponi possano reagire con residui etichettati, causando la rimozione dell'etichetta e.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il sostegno dei National Institutes of Health (NIH) nell'ambito di Grant R01 GM075092. Lo spettrometro di massa Thermo Orbitrap Fusion utilizzato per acquisire alcuni dei dati qui descritti è stato acquisito con fondi della sovvenzione dei National Institutes of Health S10OD010645.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL | Thermo Fisher Scientific | 3448 | |
| acido 3-(N-morfolino)propansolfonico | Millipore Sigma | M1254 | |
| 3-(N-morfolino)acido propansolfonico sale sodico | Millipore Sigma | M9381 | |
| Acclaim PepMap RSLC C18 Colonna | Thermo Scientific | 164537 | 300 μ m x 15 cm, C18, 2 μ m, 100 A |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-1 | |
| Dietilpirocarbonato | Millipore Sigma | D5758 | |
| Acqua di grado HPLC | Fisher Scientific | W5-1 | |
| Imidazole | Millipore Sigma | I5513 | |
| Chimotripsina immobilizzata | ProteoChem | g4105 | |
| Tripsina immobilizzata, TPCK Trattato | Thermo Fisher Scientific | 20230 | |
| Iodoacetamide | Millipore Sigma | I1149 | |
| Tris(2-carbossietil)fosfina | Millipore Sigma | C4706 |
Riferimenti
- Katta, V., Chait, B. T., Carr, S. Conformational Changes in Proteins Probed by Hydrogen-exchange Electrospray-ionization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5, 214-217 (1991).
- Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrog....
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Ristampe e permessi
