Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Camila F. Almeida; Emma C. Frair; Nianyuan Huang; Reid Neinast; Kim L. McBride; Robert B. Weiss; Kevin M. Flanigan; Nicolas Wein

doi:10.3791/61991

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Articolo metodologico

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

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DOI:

10.3791/61991

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3 aprile 2021

Camila F. Almeida¹ , Emma C. Frair¹ , Nianyuan Huang¹ , Reid Neinast² , Kim L. McBride²^,³^,⁴^,⁶ , Robert B. Weiss⁵ , Kevin M. Flanigan¹^,⁶ , Nicolas Wein¹^,⁶

¹Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, ²Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, ³The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, ⁴Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, ⁵Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, ⁶Department of Pediatrics, The Ohio State University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.

Abstract

Le indagini sia sulla fisiopatologia che sugli obiettivi terapeutici nelle distrofie muscolari sono state ostacolate dalla limitata capacità proliferativa dei mioblasti umani. Sono stati creati diversi modelli di topi, ma non rappresentano veramente la fisiopatologia umana della malattia o non sono rappresentativi dell'ampio spettro di mutazioni presenti nell'uomo. L'immortalizzazione dei mioblasti primari umani è un'alternativa a questa limitazione; tuttavia, dipende ancora dalle biopsie muscolari, che sono invasive e non facilmente disponibili. Al contrario, le biopsie cutanee sono più facili da ottenere e meno invasive per i pazienti. I fibroblasti derivati dalle biopsie cutanee possono essere immortalati e transdifferenziati in mioblasti, fornendo una fonte di cellule con un eccellente potenziale miogenico. Qui descriviamo un metodo di riprogrammazione rapido e diretto del fibroblasto in un lignaggio miogenico. I fibroblasti vengono trasdotti con due lentivirus: hTERT per immortalare la coltura primaria e un MYODtet-inducibile , che con l'aggiunta di doxiciclina, induce la conversione dei fibroblasti in mioblasti e poi miotubi maturi, che esprimono marcatori di differenziazione tardiva. Questo protocollo di transdifferenziazione rapida rappresenta un potente strumento per indagare i meccanismi patologici e studiare bioterapie innovative a base genica o farmacologica per disturbi neuromuscolari.

Introduzione

I modelli cellulari ottenuti direttamente dai tessuti umani sono utili per modellare molti disturbi genetici umani, con il vantaggio di avere il contesto genomico originale e, in molti casi, riprodurre gli stessi tratti distintivi molecolari e cellulari osservati nei pazienti. Nel campo dei disturbi neuromuscolari, le biopsie muscolari sono state una grande fonte di mioblasti umani e hanno contribuito alla spiegazione dei meccanismi patologici. Inoltre, sono uno strumento importante per il test in vivo di farmaci e terapie geniche. Da un lato, la derivazione dei mioblasti dai frammenti muscolari è relativamente facile. D'altra parte, la coltura e il mantenime....