Articolo metodologico

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

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DOI:

10.3791/61991

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3 aprile 2021

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1Center for Gene Therapy, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 2Center for Cardiovascular Research, The Research Institute at Nationwide Children’s Hospital, 3The Heart Center, Nationwide Children’s Hospital, 4Division of Genetic and Genomic Medicine, Nationwide Children’s Hospital, 5Department of Human Genetics, The University of Utah School of Medicine, 6Department of Pediatrics, The Ohio State University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.

Abstract

Le indagini sia sulla fisiopatologia che sugli obiettivi terapeutici nelle distrofie muscolari sono state ostacolate dalla limitata capacità proliferativa dei mioblasti umani. Sono stati creati diversi modelli di topi, ma non rappresentano veramente la fisiopatologia umana della malattia o non sono rappresentativi dell'ampio spettro di mutazioni presenti nell'uomo. L'immortalizzazione dei mioblasti primari umani è un'alternativa a questa limitazione; tuttavia, dipende ancora dalle biopsie muscolari, che sono invasive e non facilmente disponibili. Al contrario, le biopsie cutanee sono più facili da ottenere e meno invasive per i pazienti. I fibroblasti derivati dalle biopsie cutanee possono essere immortalati e transdifferenziati in mioblasti, fornendo una fonte di cellule con un eccellente potenziale miogenico. Qui descriviamo un metodo di riprogrammazione rapido e diretto del fibroblasto in un lignaggio miogenico. I fibroblasti vengono trasdotti con due lentivirus: hTERT per immortalare la coltura primaria e un MYODtet-inducibile , che con l'aggiunta di doxiciclina, induce la conversione dei fibroblasti in mioblasti e poi miotubi maturi, che esprimono marcatori di differenziazione tardiva. Questo protocollo di transdifferenziazione rapida rappresenta un potente strumento per indagare i meccanismi patologici e studiare bioterapie innovative a base genica o farmacologica per disturbi neuromuscolari.

Introduzione

I modelli cellulari ottenuti direttamente dai tessuti umani sono utili per modellare molti disturbi genetici umani, con il vantaggio di avere il contesto genomico originale e, in molti casi, riprodurre gli stessi tratti distintivi molecolari e cellulari osservati nei pazienti. Nel campo dei disturbi neuromuscolari, le biopsie muscolari sono state una grande fonte di mioblasti umani e hanno contribuito alla spiegazione dei meccanismi patologici. Inoltre, sono uno strumento importante per il test in vivo di farmaci e terapie geniche. Da un lato, la derivazione dei mioblasti dai frammenti muscolari è relativamente facile. D'altra parte, la coltura e il mantenimento dei mioblasti primari sono impegnativi, a causa del loro limitato tasso di proliferazione e della senescenza replicativa in vitro1. Un'alternativa a queste limitazioni è immortalare i mioblasti conl'inserimentodella telomerasi umana (hTERT) e/o della chinasi ciclina-dipendente 4 (CDK4)geni 2,3 , con conservazione delle caratteristiche muscolari scheletriche4. Tuttavia, l'obtenzione dei mioblasti primari dipende ancora dalla biopsia muscolare, una procedura chirurgica con svantaggi per i pazienti, che, in molti casi, hanno i loro muscoli nella degenerazione avanzata. Pertanto, il muscolo di questi pazienti è composto da una proporzione significativa di tessuto fibrotico e / o adiposo e produce meno cellule muscolari, richiedendo la purificazione delle cellule in precedenza per l'immortalizzazione.

A differenza delle biopsie muscolari, le biopsie cutanee sono più accessibili e sono meno dannose per i pazienti. I fibroblasti primari possono essere derivati da frammenti cutanei in vitro. Sebbene i fibroblasti non siano principalmente influenzati da mutazioni che causano disturbi neuromuscolari, possono essere trasifferenti in mioblasti. Questo può essere ottenuto con l'inserimento del gene Myod, un fattore di trascrizione regolatore miogenico5. In questo manoscritto descriviamo il protocollo per ottenere mioblasti transdifferenziati, dalla creazione di colture di fibroblasti all'obtenzione di miotubi differenziati (un riassunto rappresentativo del metodo è raffigurato nella figura 1).

Il test preclinale delle strategie terapeutiche dipende da modelli cellulari e animali che portano mutazioni simili alle mutazioni riscontrate nei pazienti umani. Sebbene lo sviluppo di modelli animali sia diventato più fattibile con il progresso di tecnologie di editing genico come CRISPR/Cas96, è ancora impegnativo e costoso. Pertanto, le linee cellulari derivate dal paziente sono un'opzione accessibile per avere modelli, coprendo l'ampio spettro di mutazioni di malattie come la distrofia muscolare di Duchenne (DMD). L'obtenzione e la creazione di modelli cellulari sono cruciali per lo sviluppo di terapie personalizzate per tali patologie.

Tra le terapie personalizzate che sono state studiate, le strategie di salto dell'esone è una delle promettenti per diverse distrofiemuscolari 7,8. Questa strategia consiste nel produrre una proteina più corta ma funzionale. Questo viene eseguito nascondendo la definizione di esone allo spliceosoma, escludendo quindi l'esone mutato dal messaggero finale. Questa è una tecnologia molto promettente che è stata approvata dalla FDA per dmd. Pertanto, descriviamo anche in questo protocollo, metodi per trasfetto i mioblasti con due diverse tecnologie correlate che saltano l'esone: oligonucleotidi antisense (AON) e virus associato all'U7snRNA-adeno (AAV). La trasfezione AON è un buon strumento per lo screening iniziale di diverse sequenze progettate per promuovere l'esonesaltando 9. Tuttavia, l'attività degli AON è transitoria. Per ottenere un'espressione sostenuta delle sequenze di antisense, abbiamo anche esplorato piccoli RNA nucleari (snRNA) combinati con AAV, consentendo la localizzazione nucleare e l'inclusione nei macchinari di giunzione10. U7 è uno snRNA coinvolto nell'elaborazione dell'mRNA istono che può essere progettato per legare le proteine che lo reindirizzeranno allo spliceosoma e forniranno sequenze di antisense11. L'uso di U7 snRNA modificati in combinazione con vettori AAV supera i limiti delle AON con conseguente continua espressione delle AON e migliore trasduzione dei tessuti di interesse12. Usiamo cellule derivate da pazienti affetti da DMD per questo protocollo per illustrare la strategia di esone-salto.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti e le biopsie sono stati effettuati seguendo le regole etiche delle istituzioni coinvolte sotto l'approvazione del Nationwide Children's Hospital Institutional Review Board.

1. Inizio della coltura di fibroblasti dermici

  1. Istituzione della cultura dei fibroblasti
    1. Aliquota 10 mL di mezzo fibroblasto(tabella 1)in tubi conici da 15 ml. La biopsia cutanea deve essere posizionata e trasportata in questo mezzo. La biopsia può essere conservata a 4 °C fino a quando non viene lavorata, preferenzialmente lo stesso giorno.
      NOTA: Utilizzare la biopsia cutanea entro 24-36 ore per evitare una potenziale crescita della contaminazione.
    2. Aspirare il supporto dal tubo e risciacquare la biopsia con 10 mL 1X PBS (temperatura ambiente) tre volte. Dopo il terzo lavaggio, lasciare il PBS nel tubo.
    3. Versare il PBS e la pelle su un piatto da 10 cm2.
    4. Usando bisturi sterili, tagliare la biopsia nel più piccolo possibile frammenti.
    5. Utilizzando una pipetta, trasferire un singolo frammento di pelle e lasciarlo cadere in un piatto pulito da 10 cm2. Posizionare da 10 a 12 frammenti per piatto.
    6. Aspirare l'eccesso di PBS da ogni frammento. Fare attenzione a non aspirare il frammento.
    7. Coprire parzialmente i piatti con il coperchio e lasciare asciugare i frammenti di pelle per 5-20 minuti. Non lasciare asciugare eccessivamente i frammenti.
    8. Una volta che i frammenti sono asciutti, inclinare il piatto a 45 gradi e aggiungere lentamente 12 mL di mezzo fibroblasto all'angolo. Abbassare il piatto, distribuendo attentamente il supporto in modo che i frammenti non si sollevino dal supporto.
    9. Mettere i piatti nell'incubatrice (37 °C, 5% CO2). Sostituire il supporto in 5-7 giorni e una volta alla settimana dopo.
    10. Osservare i fibroblasti che emergono dal frammento (Figura 2) e, una volta confluenti, passare le cellule in mastri da 75 cm2. Rimuovere il mezzo, sciacquare le celle con PBS e aggiungere 1 mL 0,25 % di tripina. Incubare a 37 °C per 5 minuti o fino a quando tutte le cellule non vengono sollevate. Aggiungere un mezzo di crescita dei fibroblasti da 10 ml per inibire la tripparina e trasferire le cellule in un nuovo pallone.
      NOTA: Per la nomenclatura del numero di passaggio, P1 viene stabilito quando i primi fibroblasti emersi dalla biopsia cutanea vengono trasferiti in un nuovo pallone per la proliferazione.
  2. Crioconservazione delle linee primarie di fibroblasti
    1. Una volta che il pallone da 75 cm2 è confluente, sciacquarlo con 10 mL 1X PBS e aspirare PBS.
    2. Aggiungere 3 mL dello 0,25 % di tripina alla superficie cellulare. Posizionare il pallone nell'incubatrice per 5 minuti. Controllare i contenitori al microscopio per vedere se le cellule sono sollevate. In caso meno, riposizionare il pallone nell'incubatrice per altri 5 minuti.
    3. Una volta staccate le cellule, aggiungere 7 ml di mezzi fibroblasti al pallone e pipetta su e giù per rimostrare le cellule. Raccogliere le celle in un tubo conico da 50 ml.
    4. Preparare 100 μL aliquota di trypan blu, e rimuovere 100 μL dal campione che viene crioconservato, mescolare con il tripano blu. Caricare il mix sull'emocitometro per contare. Contare le cellule in quattro diversi campi dell'emocitometro al microscopio. Per calcolare il numero totale di celle, utilizzare la formula: (celle contate/100) * volume di impostazioni cultura.
    5. Ruotare i tubi conici a 300 x g per 10 minuti a temperatura ambiente o 4 °C.
    6. Aspirare il mezzo e rimospendare le cellule nel volume adeguato del mezzo di congelamento: 1 mL per ogni 1 milione di cellule/flaconcino. Pipetta su e giù per omogeneizzare e distribuire 1 mL ad ogni criooviale etichettato.
    7. Posizionare i flaconcini nella scatola di congelamento e lasciare congelare le fiale ad una velocità di 1 °C/min a -80 °C congelatore durante la notte.
    8. Il giorno seguente trasferire le fiale in un serbatoio di azoto liquido o in un congelatore a -150 °C.

2. Istituzione della linea cellulare fibromioblasti (FM)

  1. Seme fibroblasti primari a circa il 30% di confluenza in due pozzi di una piastra da 12 porci (2 x 104 cellule/pozzo) al fine di avere circa il 50% di confluenza il giorno successivo.
  2. Per la trasduzione lentivirale, aggiungere da 2 a 5 x 109 vg (particelle del genoma virale) di hTERT-puromicina lentivirus in 400 μL di mezzo fibroblasto. Al secondo pozzo, aggiungere solo 400 μL di mezzo fibroblasto. Aggiungere 1 mL di supporti il giorno seguente.
    NOTA: I plasmidi per la produzione di lentivirus sono stati ottenuti dal gruppo che ha pubblicato il documento Chaouch et al, 2009. Sono anche descritti individualmente in Aure et al, 200713 per hTERT plasmide e Barde et al, 200614 per il sistema Tet-on utilizzato per la progettazione del plasmide MyoD. Sono stati ottenuti grazie ad un accordo di trasferimento materiale con Genethon, Francia (si prega di contattare il Dr. Vincent Mouly per ottenere questi plasmidi - vincent.mouly@upmc.fr). In breve, l'hTERT è costituito dalla variante 1 hTERT guidata da un promotore CMV mentre la puromicina è guidata da un promotore PGK. Il plasmide MyoD contiene una variante MyoD 1 guidata da un promotore CMV sotto il controllo del repressore rtTA2. Questo plasmide contiene anche la selezione di igromicina espressa grazie al promotore SV40.
    I lentivirus sono stati prodotti utilizzando una produzione lentivirale regolare (vedi protocollo Wang e McManus JoVe15). In breve, l'aiutante MDL, Rev-Helper, SVS-G-helper sono stati trasfetati attraverso la precipitazione del cloruro di calcio anche di plasmidi hTERT o MyoD. Dopo 48 ore, il supernatante è stato raccolto, e poi per altri tre giorni. Tutti i supernatanti sono stati poi concentrati per ultracentrifugazione. Il pellet è stato quindi rimescolato nel tampone Tris-HCL+NaCl+EDTA. La stima del titer è stata valutata mediante test qPCR del lentivirus standard.
  3. Uno o due giorni dopo, trasferire le cellule in una piastra da 6 po 'e farle crescere fino a raggiungere il 60-70% di confluenza.
  4. Integrare il mezzo fibroblasto con 1 μg/mL di puromicina e aggiungere 2 mL ad ogni pozzo.
  5. Tenere le celle sotto selezione fino a quando tutte le celle del pozzo di controllo sono morte (fino a 12 giorni), cambiando i supporti ogni 2-3 giorni. Passare le cellule dal piatto da 6 pozzi in due piatti da 10 cm2 per un'ulteriore proliferazione.
  6. Congelare fiale di fibroblasti dopo la selezione. Etichetta come F(hTer).
  7. Semi di fibroblasti che esprimono hTERT (F(hTer)) a circa il 30% di confluenza nel mezzo fibroblasto, in due pozzi di una piastra da 12 pozza, per avere circa il 50% di confluenza il giorno successivo.
  8. Per la trasduzione del lentivirus, mescolare da 2 a 5 x10 9 vg di MyoD-hygromicinaB lentivirus in 400 μl di mezzo fibroblasto e aggiungere ai rispettivi pozzi; al terzo bene aggiungere 400 μl mezzo fibroblasto. Aggiungere 1 mL di mezzo il giorno successivo.
  9. Uno o due giorni dopo trasferiscono le cellule in una piastra a 6 po 'e crescono fino al 60-70% di confluenza.
  10. Integrare il mezzo di crescita dei fibroblasti con igromicina B (400 μg/mL) e aggiungere 2 mL ad ogni pozzo.
  11. Tenere le celle sotto selezione fino a quando tutte le celle del pozzo di controllo sono morte (fino a 12 giorni), cambiando i supporti ogni 2-3 giorni.
  12. Congelare fiale di fibroblasti dopo la selezione. Etichetta come FM seguita dal numero/nome di identificazione della cella.

3. Protocollo di transdifferenziazione

  1. Seme trasdotto FM su 10 cm2 piatti con confluenza 30-40%. In una piastra di 12 po ', seme 6 x 104 cellule (questo dipende dalla singola linea cellulare).
    NOTA: Per l'immunosocienza, le cellule di semi su coprispasmi di vetro o scivoli da camera rivestiti con Matrigel. Diluire Matrigel a 1:10 nel mezzo DMEM, aggiungere un volume sufficiente a coprire la superficie e lasciare che le diapositive si siedano a temperatura ambiente per un'ora. Aspirare subito prima di seminare le cellule.
  2. Per l'induzione dei mioblasti, quando i fibroblasti hanno raggiunto il 70% di confluenza(figura 3A),sciacquare la superficie cellulare con PBS e aggiungere mezzi di mioblasto fresco integrati con dossiciclina fresca da 8 μg/mL.
    NOTA: Il successo della differenziazione è compromesso oltre l'80% di confluenza.
  3. Dopo due o tre giorni dopo, le cellule sono confluenti al 90-95% e la loro morfologia sarà cambiata (Figura 3B). Risciacquare la superficie cellulare con PBS e aggiungere nuovi mezzi di differenziazione integrati con dossiciclina fresca da 8 μg/mL.
  4. Continuare a cambiare i supporti ogni 2-3 giorni senza passare fino a quando non vengono stabiliti miotubi (confermare tramite morfologia) (Figura 3C).
  5. Da sette a dieci giorni dopo aver iniziato la differenziazione del miotubo, le cellule dovrebbero essere completamente differenziate e possono iniziare a staccarsi o morire. Prima che ciò accada, raccogli i miotubi per ulteriori analisi.
    NOTA: Il decorso del tempo della formazione del miotubo dipende dalla linea cellulare. Mutazioni nelle proteine correlate ai muscoli possono interferire nel potenziale miogenico. Quando i miotubi iniziano ad apparire luminosi e sembrano bianchi ai bordi, è un segnale che stanno iniziando a staccarsi (Figura 4).
  6. Per raccogliere i miotubi, raccogliere i supporti e trasferirli su un tubo conico da 50 ml. Il mezzo può contenere miotubi che si sono staccati.
  7. Risciacquare i miotubi con PBS da 5 ml e trasferire PBS nel tubo da 50 ml.
  8. Aggiungere 3 mL dello 0,25 % di tripina alla superficie cellulare. Mettere il piatto nell'incubatrice per 5 minuti. Controllare il piatto al microscopio per vedere se le cellule sono sollevate. In caso meno, riposizionare nell'incubatrice per altri 5 minuti.
  9. Una volta staccate le cellule, aggiungere 7 mL di mezzi fibroblasti al piatto e pipettare su e giù per risospendare le cellule. Raccogliere le celle nel tubo conico da 50 ml.
  10. Centrifuga a 1.200 x g per 7 min a 4 °C.
  11. Aspirare con cura il liquido, senza disturbare il pellet. Conservare i pellet a -80 °C fino a un'ulteriore lavorazione.

4. Immunostaining di miotubi differenziati

NOTA: Per l'immunosocienza, far crescere le cellule in coverlips di vetro o vetrine da camera come notato sopra.

  1. Una volta che i miotubi sono completamente differenziati, aspirare i supporti e risciacquare accuratamente le diapositive con PBS. Aspirare pbs off.
  2. Aggiungere pfa fresco al 4% (500 μL per pozzo di una piastra da 12 pozzetti) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Aspirare pfa off.
  3. Risciacquare con 1 mL PBS.
  4. Incubare con glicina 0,2 M a temperatura ambiente, per 10 minuti. Aspirare la glicina.
  5. Permeabilize con PBS 0,5% TritonX-100 (300 μL/pozzo di una piastra da 12 pozzetti), per 10 min con agitazione delicata.
  6. Blocco con 300 μL/pozzo di soluzione di blocco, per 10 min con agitazione delicata.
  7. Incubare con anticorpo primario diluito 1:50 in 300 μL di soluzione di blocco, per 2 ore a temperatura ambiente, con tremori delicati.
  8. Risciacquare tre volte con 1 mL/pozzetti di PBS per 5 minuti, con delicati scuotimenti.
  9. Incubare con anticorpo secondario diluito 1:500 in 300 μL di soluzione di blocco, per 1 ora, a temperatura ambiente, con delicata agitazione. Coprire la piastra con un foglio di alluminio.
  10. Risciacquare tre volte con 1 mL/pozzetti di PBS per 5 minuti, con delicati scuotimenti.
  11. Incubare con DAPI diluito in PBS per 10 minuti. Risciacquare tre volte con 1 mL/pozzo di PBS.
  12. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio a uno scivolo di vetro. Rimuovere il coverslip con le forcep e posizionarlo a faccia in giù sulla goccia del mezzo di montaggio.
  13. Invertire lo scorrimento su un tovagliolo di carta e premere delicatamente per rimuovere bolle ed eccesso di mezzo di montaggio.
  14. Sigillare gli scivoli con smalto e conservare a 4 °C fino all'imaging.

5. Trasfezione oligonucleotide antisenso

NOTA: Il protocollo sottostante è per la trasfezione di una piastra a 6 po'. Regolare i volumi di conseguenza per piastre più piccole o più grandi. La trasfezione viene eseguita in mioblasti confluenti al 100% quando le cellule sono pronte per la fase di differenziazione.

  1. Aspirare il supporto di crescita del mioblasto e sciacquare le cellule con 1 mL PBS.
  2. Aggiungere 500 μL/porsi di mezzi OptiMEM e incubare a 37 °C per 1 ora.
  3. Diluire l'oligonucleotide antisense (AON) in 100 μL di OptiMEM alla concentrazione finale desiderata (cioè 50 nM, 100 nM, 200 nM, 500 nM). Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
    NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per AON da 2'ometil-fosforotioato.
  4. Mescolare la lipofectamina con OptiMEM (volume finale di 100 μL) per dare un rapporto finale di 1:1 (μg DNA: μL lipofectamina). Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti.
  5. Unire la lipofectamina diluita con l'AON diluito. Mescolare delicatamente con pipettazione e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente per consentire una formazione complessa. Evitare bolle d'aria.
  6. Aggiungere 200 μL di lipofectamina e miscela AON ai rispettivi pozzi. Incubare le cellule durante la notte a 37 °C, 5% CO2.
  7. Il giorno seguente rimuovere la miscela di trasfezione e aggiungere 2 mL di mezzi di differenziazione calda integrati con doxiciclina.
  8. Raccogliere le cellule almeno tre giorni dopo per l'estrazione dell'RNA o da sette a 21 giorni in caso di analisi proteica.
    NOTA: I giorni di differenziazione necessari per rilevare l'RNA e/o l'espressione proteica possono variare di conseguenza al gene di interesse o alla linea cellulare. Nel caso di DMD, è possibile rilevare il suo mRNA entro tre giorni. Il rilevamento delle proteine della distrofica richiede almeno sette giorni. Questo varia a seconda della linea cellulare. Alte concentrazioni di AON e reagente di trasfezione possono influire sulla transdifferenziazione.

6. Trasduzione AAV1-U7

NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per piastre a 6 pozzi. Regolare i volumi proporzionalmente all'area della superficie di coltura. La trasduzione viene eseguita in mioblasti confluenti al 100% quando le cellule sono pronte per la fase di differenziazione. AAV1 è il sierotipo AAV con la migliore capacità di trasduzione dei mioblasti coltivati.

  1. Aspirare il mezzo di crescita del mioblasto e sciacquare le cellule con 1 mL PBS.
  2. Diluire 0,5-1 x 1011 particelle virali di AAV1-U7 in 700 μL di mezzi di differenziazione calda integrati con doxiciclina.
    NOTA: Usiamo qPCR per determinare la concentrazione virale. La quantità di virus da utilizzare può variare a seconda del metodo di quantificazione e deve essere determinata in precedenza utilizzando un saggio reporter.
  3. Aggiungere il mix virale al pozzo facendolo cadere in modo omogeneo.
  4. Il giorno seguente, aggiungere 1,3 mL di mezzi di differenziazione calda integrati con doxiciclina.
  5. Raccogliere le cellule almeno tre giorni dopo per l'estrazione dell'RNA o da sette a 21 giorni in caso di analisi proteica.

7. Estrazione dell'RNA

NOTA: Tutto il materiale utilizzato durante questo passaggio deve essere privo di RNasi.

  1. Aggiungere più volte 500 μL di TRIzol per pellet e pipettare su e giù per assicurarsi che le cellule siano lysed omogeneamente.
  2. Trasferire il lisato cellulare in un tubo da 1,5 ml e incubarlo per 5 minuti a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 100 μL di cloroformio e agitare manualmente per 15 s. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Centrifuga a 12.000 x g per 15 min a 4 °C. Raccogliere la fase acquosa (superiore) e trasferirla in un nuovo tubo da 1,5 ml.
  5. Per 1 volume della fase acquosa, aggiungere 1 volume di etanolo al 100% e mescolare mediante pipettazione.
    NOTA: Si consiglia la purificazione e la concentrazione delle colonne.
  6. Trasferire il campione in una colonna IC Zymo-Spin in un tubo di raccolta e centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
  7. Per la digestione DNasi I in colonna, pre-lavare la colonna con tampone di lavaggio RNA da 400 μL. Centrifuga a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
  8. Preparare 40 μL di miscela di reazione di DNasi per campione. Mescolare 5 μL di DNA I con tampone di digestione del DNA da 35 μL.
  9. Aggiungere la combinazione direttamente alla matrice di colonne. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
  10. Aggiungere 400 μL RNA Prep Buffer alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
  11. Aggiungere 700 μL RNA Wash Buffer alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 30 s. Scartare il flusso.
  12. Aggiungere 400 μL RNA Wash Buffer alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 2 min per garantire la completa rimozione del tampone di lavaggio. Trasferire la colonna con attenzione in un tubo RNasi-free da 1,5 ml.
  13. Aggiungere 15 μL di acqua priva di nucleasi direttamente alla matrice della colonna. Incubare per 5 minuti e centrifugare a 12.000 x g per 1 minuto.
    NOTA: Raccogliere l'RNA eluitato e applicarlo di nuovo alla colonna per aumentare la resa. Centrifuga a 12.000 x g per 1 minuto.
  14. Posizionare i campioni sul ghiaccio e quantificare i campioni in una Nanodrop.
  15. Conservare i campioni a -80 °C.

8. Analisi RT-PCR

NOTA: In questo passaggio, presentiamo un suggerimento di reagenti per rilevare l'espressione dell'mRNA di distroficina, ma può essere facilmente adattato ad altri reagenti di scelta.

  1. Trascrizione inversa
    1. Scongelare tutti i reagenti e tenerli sul ghiaccio.
    2. Preparare un mix con 4 μL di 5x Reaction Buffer, 2 μL di dNTP Mix (10 mM), 1 μL di RiboLock RNasi Inhibitor e 1 μL di RevertAid RT.
    3. Mescolare delicatamente il tubo e centrifugare brevemente.
    4. Nei tubi PCR da 0,2 ml, aggiungere il volume adeguato di RNA per avere 1 μg per reazione. Aggiungere acqua priva di nucleasi q.s.p 12 μL. Includere un tubo senza la transcriptasi inversa come controllo negativo e un tubo con acqua priva di nucleasi al posto dell'RNA.
    5. Distribuire 8 μL di miscela di reazione per tubo. Il volume totale è di 20 μL.
    6. Posizionare i tubi in un termociclo e incubare per 5 minuti a 25 °C, seguiti da 60 min a 42 °C. Interrompere la reazione riscaldando a 70 °C per 5 minuti.
    7. Posizionare i tubi sul ghiaccio o a -20 °C per una conservazione più lunga.
  2. PCR
    NOTA: Progettare i primer alle giunzioni di esonero preferibilmente.
    1. Reagenti vortice e spin down prima dell'uso.
    2. Preparare una miscela master utilizzando primer in avanti da 0,5 μL (25 μM), primer inverso da 0,5 μL (25 μM), 12,5 μL 2x PCR Master Mix e 8,5 μL di acqua priva di nucleasi per campione.
    3. Aliquota 22 μL di master mix in un tubo per ogni campione.
    4. Aggiungere 3 μL di cDNA (150 ng) al rispettivo tubo PCR. Aggiungere 3 μL di acqua priva di nucleasi al tubo di controllo negativo PCR.
    5. Vortice e spin giù per i tubi PCR.
    6. Incubare i tubi in un termociclo a 95 °C per 3 min, 95 °C per 30 s, (Tm-5) °C per 30 s, 72 °C per (1 min/kb) 34 volte, 72 °C per 5 min.
      NOTA: La temperatura di ricottura ottimale può essere determinata empiricamente. Per la miscela master suggerita, sottrarre 5 °C dalla temperatura di fusione del primer.
    7. Caricare 12 μL della reazione PCR su un gel di agarosio e congelare i campioni a -20 °C.

9. Rilevamento dell'espressione di distrofina da parte di Western Blotting

NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per la distrofica, una grande proteina di membrana. Possono essere necessarie condizioni specifiche per diverse proteine.

  1. Estrazione di proteine
    1. Dopo 7-21 giorni di differenziazione, raccogliere cellule con 5 mL di PBS con 100 μL 0,5 M EDTA e 50 μL inibitori della proteasi. Incubare a 37 °C fino a quando le cellule non si staccano. Centrifuga a 1.200 x g per 5 min a 4 °C. Schioccare congelare il pellet immergere il tubo in azoto liquido. Conservare il pellet a -80 °C o procedere alla fase dilisi.
    2. Preparare il tampone di lysis aggiungendo 1% di digitonina, 1% inibitore della proteasi, 10% inibitore della fosfatasi e buffer di base al volume totale (60 μL per pellet cellulare).
    3. Aggiungere 60 μL di tampone dilisi al pellet cellulare, sul ghiaccio. Sonicare per 5 s. Siediti sul ghiaccio per 8 s. Ripetere due volte i passaggi di sonicazione e riposo.
    4. Incubare campioni sul ghiaccio per 30 minuti.
    5. Centrifuga a 14.000 x g per 20 min a 4 °C.
    6. Trasferire il supernatante in tubi puliti.
    7. Quantificare i campioni mediante saggio di acido bicinchoninico (BCA), seguendo le istruzioni del produttore.
    8. Mescolare la soluzione proteica con il volume appropriato del tampone Diemmli. Fare aliquote di 100 μg. Se necessario, regolare il volume a 25 μl con tampone dilisi di base. Conservare i campioni a -80 °C.
  2. Gonfiore occidentale
    1. Scongelare i campioni sul ghiaccio.
    2. Denaturare i campioni a 100 °C per 5 minuti, quindi raffreddarli nel ghiaccio, girare verso il basso.
    3. Diluire il tampone di funzionamento 20X Tris-acetato SDS in 200 mL dH2O e aggiungere 500 μL antiossidante.
    4. Preparare il gel di poliacrilammide tris-acetato al 3-8% rimuovendo il pettine e risciacquando con dH2O. Assemblare il gel nell'apparato di elettroforesi. Riempire la camera interna con il buffer di corsa.
    5. Caricare 5 μL di scala proteica e 25 μL di campione nel gel. Riempire la camera esterna con il buffer di corsa.
    6. Correre a 80 V per 1 h a 4 °C. Quindi, a 120 V per 2 h a 4 °C.
    7. Preparare 3 L di tampone di trasferimento 1X con 150 mL di metanolo 20X, 150 mL di tampone di trasferimento 20X e 2.700 mL di dH2O. Raffreddarlo fino a 4 °C.
    8. Tagliare 4 pezzi di carta da filtro e un pezzo di membrana nitrocellulosa. Immergere il filtro della carta e la membrana in un vassoio con tampone di trasferimento.
    9. Rimuovere delicatamente il gel dalla custodia e assemblarlo nell'apparato di trasferimento con carta da filtro, membrana e spugne. Il gel è posto sul lato negativo e la membrana sul lato positivo.
    10. Eseguire il trasferimento a 300 mA, mescolando, a 4 °C, durante la notte.
    11. Bloccare la membrana in 10 mL di tampone di blocco per 1 h con agitazione delicata, a temperatura ambiente.
    12. Preparare la soluzione di anticorpi primari con 10 mL di tampone di blocco e 50 μL di anticorpo di distrofica (1:200).
    13. Scartare il tampone di blocco e aggiungere la soluzione anticorpale primaria. Incubare con agitazione delicata per almeno 2 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 °C.
    14. Risciacquare la membrana tre volte con lo 0,1% di Tween PBS, per 5 minuti con agitazione delicata.
    15. Preparare la soluzione anticorpale secondaria utilizzando 10 mL di soluzione di blocco, 2 μL di anticorpo anti-coniglio (1:5000) e 20 μL di 0,2% Tween.
    16. Aggiungere la soluzione anticorpale secondaria alla membrana. Incubare per 1 h con delicata agitazione, rivestita con foglio di alluminio per proteggere dalla luce.
    17. Scartare la soluzione anticorpale e sciacquare la membrana 3 volte con lo 0,1% di Tween PBS, per 5 minuti con agitazione delicata, protetta dalla luce.
    18. Esposizione e immagine della membrana su un dispositivo di imaging.
    19. Macchiare la membrana per proteine totali con la macchia proteica totale Revert 700, seguendo le istruzioni del produttore.
      NOTA: Il rilevamento della distrofica mediante gonfiore occidentale dipende dall'età / mutazione del paziente e dalla capacità della cellula di fondersi e rimanere attaccata abbastanza tempo per accumulare abbastanza distrofina.

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Risultati

Questo protocollo mostra come stabilire colture di fibroblasti derivati dalla pelle umana e convertirle in mioblasti e quindi in miotubi differenziati. Questo tipo di linea cellulare è estremamente utile per lo studio dei disturbi neuromuscolari e il test in vitro di potenziali terapie.

Una rappresentazione schematica della conversione dei fibroblasti è illustrata nella figura 1. La figura 2A mostra un frammento di pelle e i ...

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Discussione

Per ottenere linee cellulari FM di buona qualità, alcuni passaggi sono fondamentali. Prima viene elaborata la biopsia cutanea, maggiori sono le probabilità di ottenere fibroblasti sani. Anche il numero di passaggi delle colture di fibroblasti è importante. Le cellule primarie hanno una capacità proliferativa limitata e dopo molti passaggi, entrano in senescenza replicativa. Pertanto, è meglio avere uno stock di fibroblasti a un basso numero di passaggi e trasformare le cellule al primo passaggio possibile.

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Dichiarazioni

Nationwide Children's Hospital ha concesso in licenza il programma di salto exon 2 descritto nel presente documento ad Audentes Therapeutics. K.M.F. e N.W. hanno ricevuto pagamenti di royalty a seguito di questa licenza.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il Dr. Vincent Mouly per aver condiviso le sue conoscenze in passato riguardo al modello. Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health National Institute of Neurological Disorders and Stroke (R01 NS043264 (K.M.F., e R.B.W.)), il National Institutes of Health National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) (P50 AR070604-01 (K.M.F., K.M., R.N., e N.W.). N.W. ha ricevuto il sostegno di borse di studio dall'Ohio State University / Nationwide Children's Hospital Muscle Group e dalla Philippe Foundation. Questo lavoro è stato sostenuto anche da fondi discrezionali interni e parte del lavoro di salto di exon 2 è stato sostenuto anche da CureDuchenne (K.M.F.) e Association Francaise Contre Les Myopathies. Numero IRB: IRB #: IRB10-00358/ CR00005138 e IBCSC#: IBS00000123.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piatto da 100 mmCorning430167
0,25% tripsina-EDTA, rosso fenoloThermo Fisher2500056
10X Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Fisher ScientificBP3994
Piastra a 12 pozzettiCorning3513
20X Tampone di trasferimentoThermo FisherNP00061
20X Tris-acetato SDS tampone di corsaThermo FisherLA0041
gel di acetato di tris 3-8%Thermo FisherEA0378BOX
pallone da 75 cm2Corning430641U
Antibiotico-Antimicotico 100XThermo Fisher15240062
Anti-miosina catena pesante, anticorpo sarcomeroStudi sullo sviluppo Hybridome BankMF20 surnatanteDiluizione 1:50
AntiossidanteThermo FisherNP0005
BCA Protein AssayThermo Fisher23227
CloroformioSigma-AldrichC2432
DAPIThermo FisherD3571Diluizione 1:1000
DigitoninMillipore Sigma300410250MG
Dimetil solfossidoSigma-AldrichD2438
DMEM, glicemia alta, integratore GlutaMAX, piruvatoThermo Fisher10569044
DNAsi I set (250U)Zymo Research CorporationE1010
Doxiciclina cloridratoFisher ScientificBP2653-5
Dup2 primer umaniFw_5' GCTGCTGAAGTTTGTTGG
TTTCTC 3'Rv_5		' CTTTTGGCAGTTTTTGCC
CTGT 3'Distrofina
anticorpoAbcamab15277Diluizione 1:200
Siero fetale bovinoThermo Fisher16000
GlicinaSigma-AldrichG8898
Capra anti-topo, Alexa Fluor 488Thermo FisherA11001Diluizione 1:1000
Halt Cocktail di inibitori della proteasi 100XThermo Fisher78430
EmocitometroHausser Scientific3100
Igromicina BThermo Fisher10687010
IRDye 680RD capra anti-coniglio IgG (H+L)Li-Cor926-68071Diluizione 1:5000
Lab-Tek II CC2 sistema di vetrini a cameraThermo Fisher15852
LaemmliBioworld105700201
Reagente di trasfezione Lipofectamine 3000Thermo FisherL3000008
Matrigel GFR matrice di membranaCorning354230
MetanoloFisher ScientificA412P-4
Contenitore di congelamento Mr. FrostyThermo Fisher51000001
Membrana in nitrocellulosa 0,45 e micro; mGE Healthcare Life Sciences10600002
Controllo del siero normale di capraThermo Fisher10000C
Odyssey Blocking Buffer (PBS)Li-Cor927-40003Tampone bloccante per Western blot
Opti-MEM I Siero ridotto MediumThermo Fisher11058021
ParaformaldeideSigma-Aldrich158127
PCR master mixThermo FisherK0172
Inibitore della fosfatasiThermo FisherA32957
Precision Plus Protein Dual Color Standards BioRad1610374
PuromicinaThermo FisherA1113803
Revert 700 Colorazione proteica totale per la normalizzazione Western BlotLi-Cor926-11021
RevertAid kitThermo FisherK1691
RNA Clean & Concentratore-25Zymo Research CorporationR1018
BisturiAspen Surgical372611
Terreno di differenziazione delle cellule muscolari scheletrichePromocellC23061
Terreno di crescita delle cellule muscolari scheletrichePromocellC23060
Triton X-100Acros Organics215682500
reagenteTRIzolThermo Fisher15596026
Tween 20Fisher ScientificBP337500
Congelatore a bassissima temperaturaThermo Scientific7402
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0Thermo Fisher15575020
Vectashield mezzo di montaggio antisbiadimentoVector LabsH1000

Riferimenti

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