L'obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.
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Articolo metodologico
Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il metodo di clonazione golden gate consente il rapido assemblaggio di più geni in qualsiasi disposizione definita dall'utente. Utilizza enzimi di restrizione di tipo IIS che tagliano al di fuori dei loro siti di riconoscimento e creano una breve sporgenza. Questo sistema di clonazione modulare (MoClo) utilizza un flusso di lavoro gerarchico in cui diverse parti del DNA, come promotori, sequenze di codifica (CDS) e terminatori, vengono prima clonate in un vettore di ingresso. Più vettori di ingresso si assemblano quindi in unità di trascrizione. Diverse unità di trascrizione si connettono quindi in un plasmide multi-gene. La strategia di clonazione del Golden Gate è di enorme vantaggio perché consente un assemblaggio senza cicatrici, direzionale e modulare in una reazione a un vaso. Il flusso di lavoro gerarchico consente in genere la facile clonazione di una grande varietà di costrutti multi-gene senza bisogno di sequenziamento oltre i vettori di ingresso. L'uso di abbandoni proteici fluorescenti consente un facile screening visivo. Questo lavoro fornisce un protocollo dettagliato e dettagliato per l'assemblaggio di plasmidi multi-genico utilizzando il kit di clonazione modulare del lievito (MoClo). Mostriamo risultati ottimali e non ottimali dell'assemblaggio plasmide multi-genico e forniamo una guida per lo screening per le colonie. Questa strategia di clonazione è altamente applicabile per l'ingegneria metabolica del lievito e altre situazioni in cui è richiesta la clonazione plasmide multi-genica.
Introduzione
La biologia sintetica mira a progettare sistemi biologici con nuove funzionalità utili per l'industria farmaceutica, agricola e chimica. Assemblare un gran numero di frammenti di DNA in modo ad alta produttività è una tecnologia fondamentale nella biologia sintetica. Un processo così complicato può scomporsi in più livelli con complessità decrescente, un concetto preso in prestito dalle scienzeingegneristiche di base 1,2. In biologia sintetica, i frammenti di DNA di solito si assemblano gerarchicamente in base alla funzionalità: (i) Livello di parte: "parti" si riferisce a frammenti di DNA con una funzione spe....
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Protocollo
NOTA: Il protocollo di clonazione gerarchica offerto in questo toolkit può essere diviso in tre passaggi principali: 1. Clonazione di plasmidi di parte; 2. Unità di trascrizione della clonazione (TA); 3. Clonazione di plasmidi multi-genici(figura 1). Questo protocollo parte dal design del primer e termina con le applicazioni del plasmide multi-gene clonato.
1. Design primer per la clonazione della parte plasmide (pYTK001):
- Progettare i primer avanti e indietro contenenti nucleotidi di fianco TTT all'estremità 5', un sito di riconoscimento BsmBI con un nucleotide aggiuntivo (CGTCTCN), uno sbalzo a 4 nu....
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Risultati
Qui i risultati di quattro plasmidi multi-genico replicativi per β-carotene (giallo) e licopene (rosso). È stato costruito un plasmide multi-gene integrativo per interrompere il locus ADE2, le cui colonie sono rosse.
Clonazione di CDS nel vettore di ingresso (pYTK001)
ERG20 è stato amplificato dal genoma del lievito e dai tre geni carotenoidi crtE, crtYB, crtI dal .......
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Discussione
Il kit di clonazione basato su MoClo sviluppato da Lee et al. L'uso di questo kit elimina il collo di bottiglia di clonazione che richiede tempo che spesso esiste per esprimere più geni nel lievito.
Abbiamo testato cinque diverse condizioni per i cicli di digestione / legatura della clonazione del Golden Gate con T4 DNA ligasi. Abbiamo scoperto che 30 cicli di digestione a 37 °C per 5 minuti e legatura a 16 °C per 5 minuti seguiti da una fase finale di digestione a 50 °C per 10 minuti e una fa.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Research Foundation per la State University of New York (Premio #: 71272) e dall'IMPACT Award of University at Buffalo (Premio #: 000077).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 mm Perle di vetro | RPI prodotti di ricerca | 9831 | Per la lisi di cellule di lievito |
| Bacto Agar | BD & Azienda | 214010 | Componente del lievito completo sintetico (CSM) |
| Bacto Peptone | BD& Azienda | 211677 | Componente dell'estratto di lievito peptone destrosio medium (YPD) |
| BsaI-HFv2 | New England Biolabs | R3733S | una versione altamente efficiente dell'enzima di restrizione BsaI |
| Carbenicillina | Fisher Bioreagents | 4800-94-6 | Antibiotico per lo screening a livello di unità di trascrizione |
| Chloramphenicol | Fisher Bioreagents | 56-75-7 | Antibiotico per lo screening al livello vettoriale di ingresso |
| CSM-His | Sunrise Sciences | 1006-010 | Integratore di aminoacidi del lievito completo sintetico (CSM) |
| Destrosio | Fisher Chemical | D16-500 | Fonte di carbonio del lievito completo sintetico (CSM) |
| Difco lievito azoto base senza aminoacidi | BD & Azienda | 291940 | Fonte di azoto del lievito completo sintetico (CSM) |
| dNTP mix | Promega | U1515 | dNTP per PCR |
| Esp3I | New England Biolabs | R0734S | un isoschizomero altamente efficiente di BsmBI |
| Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit | Zymo Research | T2001 | Per la trasformazione del lievito |
| Hexanes | Fisher Chemical | H302-1 | Per l'estrazione di carotenoidi da cellule di lievito |
| Kanamycin | Fisher Bioreagents | 25389-94-0 | Antibiotico per lo screening a livello di plasmidi multigenici |
| LB Agar, Miller | Fisher Bioreagents | BP1425-2 | Terreno di agar lisogenico per E. coli che coltiva |
| il brodo LB, Miller | Fisher Bioreagents | BP1426-2 | Terreno liquido lisogenico per E. coli coltura di |
| licopene | Cayman prodotti chimici | NC1142173 | Per la quantificazione del licopene |
| MoClo YTK | Addgene | 1000000061 Laboratorio di deposito: John Deuber | |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | New England Biolabs | T1010L | Per la purificazione di plasmidi da E.coli |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND2000c | Per misurare con precisione le concentrazioni di DNA |
| NotI-HF | New England Biolabs | R3189S | Enzima di restrizione per la linearizzazione integrativa di plasmidi multigenici |
| Nourseotricina Solfato | Goldbio | N-500-100 | Marcatore di selezione antibiotica per il plasmide pCAS utilizzato in questo studio |
| Phusion HF reaction Buffer (5X) | New England Biolabs | B0518S | Buffer per PCR utilizzando Phusion polimerasi |
| Phusion DNA polimerasi ad alta fedeltà | New England Biolabs | M0530S | Polimerasi ad alta fedeltà per tutte le reazioni PCR |
| pLM494 | Addgene | 100539 | Plasmide utilizzato per amplificare crtI, crtYB e crtE utilizzato in questo studio |
| Cuvetta di quarzo | Thermo Electron | 10050801 | Per quantificare carotenoidi |
| T4 ligasi | New England Biolabs | M0202S | Ligasi per Golden Termociclatore per clonazione a cancello |
| BIO-RAD | 1851148 | Per l'esecuzione di tutte le reazioni di PCR e clonazione | |
| Omogeneizzatore tissutale | Frullatore a proiettile | Modello: BBX24 | Per l'omogeneizzazione di cellule di lievito |
| Spettrofotometro UV-Vis | Thermo Scientific | Genesys 150 | Per la quantificazione dei carotenoidi |
| Estratto di lievito | Fisher Bioreagents | BP1422-500 | Componente dell'estratto di lievito peptone destrosio medio (YPD) |
| β-carotene | Alfa Aesar | AAH6010603 | Per la quantificazione del β-carotene |
Riferimenti
- Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
- Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
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Ristampe e permessi
