Isolamento e differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati

Summary

Questo rapporto descrive un protocollo per l'isolamento simultaneo dei preadipociti primari marroni e bianchi dai topi appena nati. Le cellule isolate possono essere coltivate in coltura e indotte a differenziarsi in adipociti bianchi e marroni completamente maturi. Il metodo consente la caratterizzazione genetica, molecolare e funzionale delle cellule adipose primarie in coltura.

Abstract

La comprensione dei meccanismi alla base della differenziazione e della funzione degli adipocite ha notevolmente beneficiato dell'uso di linee cellulari preadipocite bianche immortalate. Queste linee cellulari coltivate, tuttavia, hanno dei limiti. Non catturano completamente il variegato spettro funzionale delle popolazioni di adipocite eterogenee che ora sono note per esistere all'interno dei depositi di adiposi bianchi. Per fornire un modello più fisiologicamente rilevante per studiare la complessità del tessuto adiposo bianco, è stato sviluppato e ottimizzato un protocollo per consentire l'isolamento simultaneo dei progenitori adipociti bianchi e marroni primari dai topi appena nati, la loro rapida espansione in coltura e la loro differenziazione in vitro in adipociti maturi e pienamente funzionali. Il vantaggio principale dell'isolamento delle cellule primarie dai topi appena nati, piuttosto che adulti, è che i depositi di adiposi si stanno attivamente sviluppando e sono, quindi, una ricca fonte di preadipociti proliferanti. I preadipociti primari isolati usando questo protocollo si differenziano rapidamente al raggiungimento della confluenza e diventano completamente maturi in 4-5 giorni, una finestra temporale che riflette accuratamente l'aspetto dei cuscinetti di grasso sviluppati nei topi appena nati. Le colture primarie preparate utilizzando questa strategia possono essere ampliate e studiate con elevata riproducibilità, rendendole adatte a schermi genetici e fenotipiche e consentendo lo studio dei fenotipi adipocite autonomi delle cellule dei modelli genetici di topo. Questo protocollo offre un approccio semplice, rapido ed economico per studiare la complessità del tessuto adiposo in vitro.

Introduction

L'obesità deriva da uno squilibrio cronico tra l'assunzione di energia e il dispendio energetico. Con lo sviluppo dell'obesità, gli adipociti bianchi subiscono una massiccia espansione delle dimensioni delle cellule che si traduce in ipossia nel microambiente, morte cellulare, infiammazione e resistenza all'insulina¹. Gli adipociti disfunzionali e ipertrofizzati non possono immagazzinare correttamente i lipidi in eccesso, che si accumulano invece in altri tessuti dove smorzano l'azione^{insulinica 2,3}. Si prevede che gli agenti che migliorano la funzione dell'adipocite e ripristinano la normale partizionamento lipidico tra i tessuti siano benefici per il trattamento delle condizioni associate all'obesità caratterizzate da resistenza all'insulina come il diabete di tipo 2. Gli schermi fenotipici negli adipociti utilizzando linee cellulari immortalate, come 3T3-L1, F442A e 10T 1/2, si sono dimostrati utili per identificare fattori genetici che regolano l'adipogenesi e per isolare molecole pro-adipogeniche con proprietà antidiabetiche^4,5,6,7. Queste linee cellulari, tuttavia, non riflettono pienamente l'eterogeneità dei tipi di cellule presenti nei depositi adiposi, che comprende sottotipi bianchi, marroni, beige e altri adipocite con caratteristiche uniche, che contribuiscono tutti all'omeostasi sistemica^8,9,10. Inoltre, le linee cellulari coltivate mostrano spesso una risposta diminuita agli stimoli esterni.

Al contrario, le culture degli adipociti primari ricapitolano più accuratamente la complessità dell'adipogenesi in vivo, e gli adipociti primari mostrano risposte funzionali robuste. I preadipociti primari sono tipicamente isolati dalla frazione vascolare stromale dei depositi adiposi di topi adulti^11,12,13,14. Tuttavia, poiché i depositi adiposi di animali adulti consistono principalmente in adipociti completamente maturi che hanno un tasso di turnover^{molto lento 15,16,17}, questo approccio produce una quantità limitata di preadipociti con un basso tasso di proliferazione. Pertanto, l'isolamento dei preadipociti dai topi appena nati è preferibile per ottenere grandi quantità di cellule in rapida crescita che possono essere differenziate in vitro. Qui è stato descritto un protocollo, ispirato al lavoro iniziale con gli adipociti marroni primari di Kahn et^al. Il vantaggio di isolare le cellule primarie dal neonato, al contrario dei topi adulti, è che i depositi adiposi stanno rapidamente crescendo e sono quindi una ricca fonte di preadipociti attivamente proliferabili¹⁷. Le celle isolate utilizzando questo protocollo hanno un'elevata capacità proliferativa, consentendo un rapido scale-up delle colture. Inoltre, i preadipociti dei cuccioli appena nati mostrano un maggiore potenziale di differenziazione rispetto ai progenitori adulti, il che riduce la variabilità bene-bene nell'estensione della differenziazione e quindi aumenta la riproducibilità.

Protocol

Questo protocollo segue tutte le linee guida della IACUC dello Scripps Research Institute e della University of Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.

1. Raccolta e digestione dei depositi adiposi (giorno 1)

1. Preparare due tubi da 1,5 ml per ogni cucciolo: uno per il tessuto adiposo marrone (BAT) e uno per il tessuto adiposo bianco (WAT). Aggiungere 250 μL di salina tamponata con fosfato (PBS) + 200 μL di tampone di isolamento 2x (123 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM CaCl₂, 5 mM di glucosio, 100 mM 4-(2-idrossietile)-1-piperazinaetanosilfonico (HEPES), penicillina-streptomicina e 4% albumina di siero bovino priva di acidi grassi) per ogni tubo. Mantenere le soluzioni sterili e sul ghiaccio.
2. Posizionare i cuccioli in piccole camere (ad esempio, un pozzo di una piastra di 6 po ') e metterli sul ghiaccio fino a quando non diventano ipotermici. Assicurati che non ci sia un contatto diretto tra i cuccioli e il ghiaccio. Pungere una zampa con una punta per assicurare la perdita di coscienza ed eutanasiare i cuccioli per decapitazione usando forbici affilate.
   NOTA: se si lavora con genotipi diversi, preparare un tubo aggiuntivo per raccogliere una biopsia della coda (taglio di 3 mm) per la genotipizzazione. Se il genotipizzazione viene eseguito immediatamente, tenere i cuccioli eutanasiati sul ghiaccio fino alla dissezione per raccogliere i depositi di adiposo.
3. Calcola e pesa la quantità di collagenasi necessaria per digerire tutti i depositi. Aggiungere 50 μL di 15 mg/ml di collagenasi di tipo I in tampone di isolamento 2x a ciascun tubo. Non rimescolare la collagenasi in tampone di isolamento fino a quando tutti i tessuti non sono stati raccolti.
4. Per raccogliere WAT sottocutaneo, tagliare la pelle intorno all'addome del cucciolo (evitare la rottura peritoneale) e tirare delicatamente la pelle sotto le gambe. Senza prendere la pelle, raccogliere attentamente il deposito di grasso, che apparirà come un chiaro (P1 o più giovane) o bianco (P2 e versioni precedenti), tessuto sottile e allungato attaccato all'interno o sopra il quadricipite(Figura 1B). Risciacquare il deposito di grasso in PBS e posizionarlo in uno dei tubi contenenti 250 μL di PBS + 200 μL di tampone di isolamento 2x. Tieniti sul ghiaccio.
   NOTA: I topi P0 e P1 danno la migliore resa. Nei cuccioli P0-1, il deposito WAT sottocutaneo è quasi trasparente. Nei topi P2 e versioni precedenti, il deposito è più facile da identificare perché sta già diventando bianco, indicando la presenza di adipociti bianchi completamente maturi, carichi di lipidi.
5. Per raccogliere bat interscapulare, estrarre la pelle dalle scapole sopra la testa. Sollevare la BAT - il tessuto rosso intenso tra le scapole - e fare con attenzione incisioni tutto intorno ad essa per staccarla dal corpo(Figura 1B). Verificare la coerenza e il colore; risciacquare con PBS; posizionarlo nell'altro tubo contenente 250 μL di PBS + 200 μL di tampone di isolamento 2x; e tenere sul ghiaccio.
   NOTA: Quando si raccoglie BAT da topi P2 e più anziani, rimuovere con cura il tessuto adiposo bianco che circonda la BAT. Consiste in un sottile, morbido foglio bianco di adipociti situati tra la pelle e la BAT, che è più profondo tra le scapole.
6. Una volta raccolti tutti i depositi, tritare delicatamente ogni deposito (4-6 volte) utilizzando piccole forbici direttamente all'interno dei tubi.
7. Resuspend collagenasi di tipo I nel volume appropriato di tampone di isolamento 2x per ottenere una soluzione di 10x stock a 15 mg/mL. Aggiungere 50 μL di 10x collagenasi ad ogni tubo, mantenendo i tubi sul ghiaccio fino a quando la collagenasi non è stata aggiunta a tutti i tubi.
8. Invertire rapidamente i tubi per mescolare e trasferirli in un miscelatore a temperatura controllata. Incubare i campioni per 30 min a 37 °C su uno shaker (frequenza di 1.400 giri/min per un'efficace miscelazione del campione).

2. Placcare i preadipociti (giorno 1)

1. Dopo aver digerito i tessuti, riposizionare i tubi sul ghiaccio.
   NOTA: Da questo passaggio in poi, tutto il lavoro viene eseguito in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza.
2. Filtrare i tessuti digeriti attraverso un colino cellulare da 100 μm in nuovi tubi da 50 ml. Se si lavora solo con topi WT, o se sono noti genotipi, mettere in comune i BAT pertinenti e dissociati; ripetere questa situazione per i WAT. Per massimizzare la resa cellulare, sciacquare ogni tubo con 1 ml di mezzo di isolamento (mezzo aquila modificato (DMEM) + 20% siero bovino fetale (FBS), 10 mM HEPES, 1% di penicillina-streptomicina) e filtrarlo attraverso il filtro cellulare. Se si lavora con genotipi sconosciuti, passare al passaggio 2.4
   NOTA: FBS è un fattore determinante sia della proliferazione che della differenziazione dei preadipociti. Testa rigorosamente diversi lotti di FBS per garantire alte prestazioni e coerenza tra i lotti.
3. Diluire le sospensioni BAT e WAT per placcare 2-3 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti per ogni campione di BAT e 4-6 pozzetti di una piastra da 6 pozzetti per ogni campione WAT. Ad esempio, se 6 BAT e 6 WAT sono stati raggruppati insieme, diluire la sospensione cellulare BAT fino a 24-36 mL e la sospensione della cella WAT fino a 48-72 mL. Piastra 2 mL delle sospensioni cellulari per pozzo.
4. Per campioni con genotipi sconosciuti, tenere separato ogni campione; posizionare un filtro cellulare da 100 μm sopra ogni pozzo di una piastra di 6 po 'e filtrare un campione per pozzo. Risciacquare il tubo con 1,5 ml di mezzo di isolamento e passarlo attraverso il filtro, fino a 2 ml per pozzo. Scartare il filtro cellulare, posizionare il coperchio sulla piastra e trasferire la piastra nell'incubatrice.
   NOTA: Il mezzo nei pozzi dovrebbe sembrare torbido a causa di cellule del sangue galleggianti, detriti cellulari e lipidi provenienti da cellule lese.
5. 1-1,5 ore dopo la placcatura, aspirare i mezzi e lavare con 2 mL di DMEM senza siero. Agitare delicatamente la piastra per staccare le cellule del sangue dal fondo dei pozzi. Dopo 3 lavaggi, aggiungere 2 mL di mezzo di isolamento fresco e trasferire le cellule all'incubatore (37 °C, 5% CO₂).
   NOTA: Controllare le cellule al microscopio. Il materiale galleggiante (cellule del sangue, detriti cellulari) dovrebbe essere minimo. I preadipociti marroni appariranno come piccole cellule non traslucide, mentre i preadipociti bianchi mostrerà una forma più allungata. Sia i preadipociti marroni che bianchi dovrebbero essere strettamente attaccati al piatto.

3. Espansione della cultura preadipocita (giorno 2 al giorno 5)

1. Il giorno successivo, aspirare il mezzo, lavare le cellule con 2 mL di DMEM senza siero e aggiungere indietro 2 mL del mezzo di isolamento.
2. Ripetere il passaggio 3.1 una volta ogni 2 giorni fino a quando le celle raggiungono la confluenza dell'80-90%.
   NOTA: Per i preadipociti marroni primari, raggiungere l'80-90% di confluenza può richiedere 4-5 giorni. Per i preadipociti bianchi primari, di solito ci vogliono 2-3 giorni. Una volta che i preadipociti raggiungono il 60% di confluenza, possono essere infettati in modo efficiente da particelle virali per esperimenti di knockdown o overexpression. Infettare i preadipociti con una carica virale appropriata fino a 8 ore. L'uso di polimeri cationici per aumentare l'efficienza delle infezioni è scoraggiato, in quanto spesso si traduce in tossicità e in una significativa riduzione del potenziale adipogenico dei preadipociti infetti.
3. Per dividere le cellule, rivestire nuove piastre di destinazione utilizzando una soluzione sterile di 0,1% con gelatina (sciolta in acqua distillata; non utilizzare calore). Utilizzare abbastanza volume per coprire il fondo del pozzo / piatto. Incubare le piastre a 37 °C fino a quando le cellule non sono pronte per essere sementi (almeno 10 min).
   NOTA: questo passaggio è facoltativo. Il rivestimento delle piastre di coltura cellulare non influisce sul potenziale di resa o differenziazione, ma semplifica sostanzialmente il mantenimento e la manipolazione di adipociti differenzianti.
4. Quando le cellule raggiungono la densità sub-confluente (85-95%), aspirano il mezzo, lavano con PBS e aggiungono tripina per 3 minuti per staccare le cellule. Bloccare l'attività della tripina aggiungendo un volume di tripina 2,5 volte il volume del supporto di isolamento. Pipettare la sospensione cellulare su e giù per massimizzare il recupero cellulare e trasferirlo in un nuovo tubo. Lavare i pozzali con 1 mL di mezzo di isolamento e aggiungerli alla prima collezione.
5. Centrifugare le cellule per 5 minuti a 800-1200 × g, aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 3-5 mL del mezzo di isolamento. Contare le cellule e diluirle alla densità finale desiderata.
   NOTA: Ad esempio, 50.000-80.000 celle/mL (rispettivamente 2,5, 1 e 0,5 mL per piastre a 6, 12 e 24 pozza) si tradurranno in pozzi completamente confluenti entro 72-96 ore.
6. Aspirare la soluzione di rivestimento nel passaggio 3.3 e lavare via la gelatina in eccesso con PBS. Seminare le cellule e riportare le piastre nell'incubatrice fino a quando non sono completamente confluenti.

4. Differenziazione dei preadipociti bianchi e marroni (giorni 7 - 12)

1. Quando i preadipociti diventano confluenti, aspirano il mezzo e lo sostituiscono con un mezzo di differenziazione costituito da 10% FBS in DMEM contenente 170 nM di insulina, 1 μM di desametasone e 0,5 mM 3-isobutil-1-metilxantina. Se si differenziano i preadipociti BAT, aggiungere anche 1 nM di triiodotironina (T3). Segna il giorno in cui la differenziazione adipogenica è indotta come giorno 0 di differenziazione.
   NOTA: Sia i preadipociti bianchi che marroni possono differenziarsi spontaneamente al raggiungimento della confluenza. Tuttavia, per massimizzare la differenziazione degli adipociti, dovrebbe essere usato il tradizionale cocktail pro-adipogenico descritto sopra (più T3 per i preadipociti di BAT).
2. Dopo 48 ore (giorno 2 di differenziazione), aggiornare il mezzo con mezzo di manutenzione composto per il 10% da FBS in DMEM e 170 nM di insulina (più 1 nM T3 per bat).
   NOTA: Il secondo giorno, piccole goccioline lipidiche che si accumulano nelle cellule al microscopio possono essere osservate utilizzando un campo luminoso standard.
3. Ripetere il passaggio 4.2 una volta ogni 2 giorni fino a quando le celle non vengono utilizzate per gli esperimenti.
   NOTA: Il giorno 4 o 5 di differenziazione, la maggior parte delle cellule apparirà carica di lipidi. Gli adipociti differenzianti terminali possono essere mantenuti in coltura più a lungo o utilizzati in questa fase per esperimenti.

5. Ri-placcatura per esperimenti di bioenergetica

NOTA: Se l'intenzione è quella di eseguire studi di bioenergetica in adipociti maturi nel formato a 96 po ', è necessario adottare le seguenti misure. Idealmente, dovrebbero essere utilizzate cellule che hanno appena completamente differenziato (giorno 4 o 5). La procedura descritta di seguito inizia da 1 pozzo di una piastra da 6 po '.

1. Prima della digestione della tripsiderina, preparare il rivestimento per piastre da 96 porvi. Aggiungere 50 μL di gelatina allo 0,1% ad ogni pozzo. Lasciare la piastra in un'incubatrice di coltura tissutale fino a quando le cellule sono pronte per essere sementi.
2. Il giorno 4 o 5 di differenziazione, aspirare il mezzo, lavare con 1 mL di PBS e aggiungere 300 μL dello 0,25% di acido tetraacetico tripside-etilendiammina (per 1 pozzo di una piastra a 6 po pompini). Inclinare delicatamente la piastra per assicurarsi che la triptina copra completamente il fondo del pozzo; incubare per 2 minuti a temperatura ambiente. Bloccare l'azione della tripside con 700 μL di mezzo di manutenzione, pipettare su e giù per massimizzare il recupero cellulare e trasferire la sospensione cellulare in un nuovo tubo da 1,5 ml.
3. Centrifugare le cellule a 1200 × g per 5 min. Rimuovere il supernatante, resospendare il pellet in 1 mL di mezzo di manutenzione e contare le celle.
   NOTA: Un pozzo di una piastra a 6 po 'dovrebbe produrre circa 1,5-1,8 milioni di cellule.
4. Diluire le cellule per avere una concentrazione finale da 60.000 a 80.000 cellule/mL per gli adipociti marroni e da 100.000 a 120.000 cellule/mL per gli adipociti bianchi. Piastra 100 μL della sospensione cellulare per pozzo in piastre a 96 pozzi rivestite di gelatina.
   NOTA: Un pozzo di una piastra a 6 po 'fornisce abbastanza celle per un massimo di due piastre da 96 po '. Per gli esperimenti di bioenergetica, è necessaria una placcatura a bassa densità (confluenza del 30-40%) per consentire una misurazione accurata del consumo di ossigeno ed evitare l'esaurimento dell'ossigeno nei pozzi durante il saggio.
5. Lasciare che le cellule aderiscano al fondo della piastra per almeno 48 ore. Se le cellule vengono conservate nella piastra per più di 48 ore, aggiornare il supporto dopo 2 giorni.
6. Il giorno del saggio, aspirare il mezzo e sostituirlo con il mezzo di dosaggio. Incubare per 1 h a 37 °C in un incubatore non_{controllato da}CO 2 ed eseguire il test secondo le istruzioni del produttore.

Results

La sezione 1 del protocollo produrrà una sospensione eterogenea delle cellule visibili al microscopio a luce standard. Il filtraggio dei tessuti digeriti con un colino cellulare (sezione 2) rimuoverà il tessuto non digerito. Tuttavia, alcuni detriti cellulari, cellule del sangue e adipociti maturi passeranno attraverso (Figura 1C). I lavaggi delicati 1 h dopo la placcatura rimuoveranno le cellule non rilevanti poiché i preadipociti si attaccano rapidamente al...

Discussion

Il tessuto adiposo è fondamentale per la sensibilità sistemica all'insulina e l'omeostasi^{del glucosio 20}. La disfunzione adipocite legata all'obesità è strettamente associata all'insorgenza del diabete di tipo 2. Pertanto, una maggiore comprensione della biologia di base e della fisiologia del tessuto adiposo può consentire la progettazione di nuovi trattamenti per i disturbi metabolici. Come complemento all'analisi funzionale diretta e trascrizionale degli adipociti maturi isolati dai depositi

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX)	Sigma-Aldrich	I7018
Piastre a 6 pozzetti	Corning	353046
AdipoRed (Nile Red)	Lonza	PT-7009
Antimicina A	Sigma-Aldrich	A8674
BenchMark Siero fetale bovino	Gemini Bioproducts LLC	100-106
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
Filtro cellulare	Fisher Scientific	22363549
Collagenasi, Tipo 1	Worthington Biochemical Corp	LS004196
ddH2O	Sigma-Aldrich	6442
Desametasone	Sigma-Aldrich	D4902
DMEM	Sigma-Aldrich	D5030	Per studi di bioenergetica
DMEM, alto glucosio, Glutamax	Gibco	10569010
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190144
Senza acidi grassi BSA	Sigma-Aldrich	A8806
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920
Gelatina	Sigma-Aldrich	G1890
Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399
Insulina	Sigma-Aldrich	I6634
KCl	Sigma-Aldrich	P9333
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Noradrenalina	Cayman Chemical	16673
Oligomicina	Sigma-Aldrich	75351
Pen/Strep	Gibco	15140122
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Rotenone	Sigma-Aldrich	557368
Cavalluccio marino XFe96 FluxPak	Agilent Technologies	102416-100	Per studi di bioenergetica
Pinze chirurgiche	ROBOZ Surgical Instrument Co	RS-5158
Forbici chirurgiche	ROBOZ Surgical Instrument Co	RS-5880
ThermoMixer	Eppendorf	T1317
triiodotironina (T3)	Sigma-Aldrich	642511