Preparazione del campione per la profilazione metabolica utilizzando la spettrometria di massa MALDI

I metaboliti, gli intermedi o i prodotti finali del metabolismo, compresi i nucleotidi, gli amminoacidi o gli acidi organici, i lipidi, sono componenti chiave delle funzioni e dei processi biologici. La metabolomica, lo studio dei metaboliti, consente l'esplorazione delle loro interazioni biochimiche e la comprensione dei loro ruoli nel contesto della ricerca di base, traslazionale e clinica. I metaboliti sono fortemente associati ai fenotipi degli organismi e forniscono informazioni sulle attività biochimiche che si verificano durante il metabolismo cellulare¹. Pertanto, oltre alla genomica e alla proteomica, la metabolomica è emersa come uno strumento importante per comprendere sia le condizioni fisiologiche che patologiche. Ad esempio, la metabolomica viene utilizzata per chiarire i meccanismi alla base dei farmaci esistenti e la loro tolleranza. Nello sviluppo di farmaci, il metabolismo xenobiotico è utile per valutare l'attività o la tossicità dei metaboliti tra le specie, che in seguito si traduce nel sostenere la medicina personalizzata². Nonostante l'ampia applicazione della metabolomica, l'imaging dei metaboliti può essere difficile a causa della reattività chimica dei metaboliti, dell'eterogeneità strutturale e dell'ampio intervallo di concentrazione^3. Tuttavia, le concentrazioni di metaboliti labili tra cui composti ad alta energia, glucosio, lattato, glicolitico, via di shunt del pentoso e intermedi del ciclo TCA, fosfolipidi, neurotrasmettitori, composti di segnalazione, possono cambiare in pochi secondi e progredire in pochi minuti quando gli enzimi tissutali sono attivi durante le procedure di raccolta dei tessuti, come l'ischemia post mortem nella raccolta cerebrale^4,5,6 . Per garantire un'accurata acquisizione dei dati metabolomici, è fondamentale un'adeguata e attenta preparazione del campione^7,8. Le attuali piattaforme stabilite per la misurazione dei metaboliti includono NMR, saggi enzimatici e spettrometria di massa (compresa la cromatografia liquida e gassosa), l'ultima delle quali è discussa più avanti.

MALDI-MSI è una tecnica all'avanguardia che consente l'analisi di campioni complessi attraverso la rilevazione di singole specie molecolari. MALDI MSI garantisce il vantaggio di poter misurare in modo rapido e riproducibile vari composti molecolari in campioni biologici. L'imaging con spettrometria di massa consente inoltre la produzione di immagini che rappresentano la biologia tissutale basata sui suoi metaboliti compositi, e lo fa preservando la distribuzione spaziale dei metaboliti nel campione⁹. La capacità di MALDI di rilevare analiti in un campione senza l'uso di etichettatura anticorpale, modifiche strutturali o altri reagenti specializzati, come quelli utilizzati nell'immunostaining, insieme alla sua capacità di monitorare centinaia di molecole all'interno di un singolo esperimento comprendono solo alcuni dei vantaggi che l'imaging MS garantisce quando si tratta di profilazione metabolica^{10, 11}. Oltre alla matrice comunemente usata come l'acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) e la 9-aminoacridina (9-AA), recentemente scoperta una nuova matrice N -(1-Naftil) Etilendiammina Dicloridrato (NEDC), che è adatta per l'analisi di vari metaboliti a basso peso molecolare, ha ulteriormente migliorato l'applicazione di MALDI MSI nel profilo metabolico¹².

Nonostante l'ampia applicazione di MALDI MSI, l'elevato costo dello strumento e la complessità della procedura sperimentale ne impediscono una più ampia implementazione nei singoli laboratori di ricerca. Pertanto, la maggior parte degli studi MALDI MSI sono supportati attraverso strutture di base condivise. La preparazione del campione, compresa la preparazione del vetrino e il rivestimento della matrice, è la fase più critica in MALDI MSI. Tuttavia, la preparazione del vetrino viene normalmente eseguita nel laboratorio del singolo ricercatore, il che crea potenziali variazioni nella successiva acquisizione di MALDI MSI. Qui miriamo a fornire un protocollo dettagliato per la preparazione del campione di campioni biologici prima di procedere alle misurazioni MALDI MSI e utilizzare un profilo metabolomico del cervello del topo in via di sviluppo come esempio.

Il protocollo segue le linee guida del comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Advanced Science Research Center (ASRC) della City University of New York (CUNY).

1. Raccogli il tessuto

1. Preparare la barca in alluminio. Preparare un rettangolo di alluminio 10cm x 20 cm, piegare al centro per fare 10 cm quadrato a doppio strato. Etichettare le informazioni del campione su un lato e piegare l'altro lato per formare una barca con una superficie inferiore di circa 4 cm x 4 cm.
2. Preraffreddare la barca sull'azoto liquido (LN₂) in una scatola di polistirolo.
   NOTA: Se la barca è troppo piccola, il campione potrebbe cadere dalla barca e diventare troppo congelato contattando direttamente LN₂, il che potrebbe causare frammentazione durante la criosezione.
3. Eutanasizzare l'animale per lussazione cervicale seguendo le linee guida istituzionali IACUC, sezionare immediatamente il tessuto di interesse.
   1. Mantenere l'intervallo tra l'anestesia animale e il congelamento a scatto il più breve possibile, per ridurre al minimo l'alterazione dei metaboliti durante la raccolta dei tessuti, in particolare i metaboliti labiali nel cervello a causa dell'ischemia post-mortem.
      NOTA: La perfusione dell'animale con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) aumenterà la durata dell'ischemia, alterando ulteriormente le concentrazioni di metaboliti labili ed esagerando i risultati artefatti. Pertanto, la perfusione o il lavaggio del tessuto con PBS non è raccomandato, a meno che la contaminazione del sangue o del fluido corporeo non sia più interessata del deterioramento dei metaboliti o del washout per singolo progetto.
4. Posizionare immediatamente il tessuto nella barca di alluminio che galleggia su azoto liquido, chiudere il coperchio della scatola di polistirolo e congelare per 2-10 minuti a seconda delle dimensioni del tessuto: 2 minuti, 5 minuti, 7 minuti per il giorno 1 postnatale (P1), P21, cervello di topo P60, rispettivamente, e 10 minuti per il cervello di ratto P60.
   NOTA: Non congelare il tessuto per un tempo prolungato (ad esempio, 5 minuti per il cervello del topo P1) poiché l'eccessivamente congelato potrebbe portare alla frammentazione dei tessuti durante la criosezione.
5. Rimuovere la barca con una pinze, piegare la lamina per avvolgere il tessuto, trasportare su ghiaccio secco e conservare a -80 °C per un uso successivo. Se seguito da un sezionamento immediato, portare i campioni su ghiaccio secco al criostato.
   NOTA: Per preservare meglio i metaboliti, si preferisce conservare il campione in tessuto intatto e sezionarlo subito prima di procedere all'imaging MALDI. Il tessuto può essere conservato a -80 °C per un massimo di 24 mesi.

2. Criosezione del tessuto

NOTA: indossare guanti in ogni momento quando si maneggiano i vetrini di tinoxuro di indio (ITO). Evitare la respirazione diretta sul vetrino o indossare maschere (opzionali) per prevenire la contaminazione della saliva umana sulla sezione del tessuto.

1. Prima di sezionare il tessuto, raccogliere il numero desiderato di vetrini rivestiti ITO compatibili MALDI.
2. Testare la conduttività della slitta utilizzando un voltmetro impostato sulla resistenza. Etichettare il lato in cui viene letta una misurazione della resistenza: questo sarà il lato a cui aderiscono le sezioni di tessuto. Posizionare sempre la diapositiva su un tovagliolo di carta pulito per evitare contaminazioni.
3. Pre-raffreddare i vetrini in un criostato impostato a -20 °C.
4. Se i campioni di tessuto sono stati rimossi da -80 °C, lasciare che il tessuto si equilibra nella camera criostatica per circa 45-60 minuti a seconda delle dimensioni del tessuto. Se i campioni vengono rimossi dal ghiaccio secco, equilibrarlo per circa 30 minuti.
5. Pulire accuratamente il criostato con il 70% di etanolo. Pre-raffreddare tutti gli strumenti necessari, tra cui pennello d'artista a punta sottile e pinna nella camera criostata.
6. Impostare la temperatura della camera criostata e della testa del campione in base al tipo di tessuto: -14 °C per il fegato, -20 °C per il muscolo e -25 °C per la pelle⁹.
7. Montare il tessuto sul mandrino utilizzando il composto di incorporamento criossutale OCT, evitando OCT dalla regione di interesse.
8. Posizionare una lama pulita nel palco e bloccare. Regolare la posizione del palco e l'angolo del campione per ottenere l'angolo di taglio desiderato.
   NOTA: se devono essere tagliati diversi tipi/genotipi di tessuto, assicurarsi di riposizionare il campione in modo da utilizzare una parte pulita della lama o passare a una nuova lama prima di tagliare il campione successivo per evitare contaminazioni incrociate.
9. Continuare a tagliare fino a quando non viene trovata la regione di interesse (ad esempio, il corpo calloso nel cervello). Assicurati di mantenere pulito il palco spazzolando via pezzi extra con un pennello d'artista che è stato bilanciato nel criostato.
10. Una volta rivelata la regione desiderata, tagliare sezioni più piccole di 10-12 μm di spessore. Se la sezione tende a sfaldarsi o a sfaldarsi facilmente, aumentare la temperatura del criostato, rimanendo nell'intervallo da -22 °C a -11 °C. Abbiamo scoperto che la temperatura di taglio ottimale per il tessuto cerebrale è da -15 °C a - 18 °C.
11. Una volta tagliata una buona sezione, aderisci alla slitta ITO (opera nella camera criostata).
12. Trasferire una sezione del tessuto su vetrini ITO utilizzando la punta del pennello dell'artista.
13. Riscaldare la sezione posizionando un dito sotto la diapositiva per riscaldare la sezione per garantire un montaggio sicuro. La sezione tissutale diventerà prima trasparente in 5-10 s e poi diventerà opaca in circa 30-60 s.
14. Mettere da parte con attenzione la diapositiva nel criostato.
15. Ripetere i passaggi per altri campioni di tessuto, assicurandosi che ogni sezione del tessuto sia posizionata uniformemente sul vetrino e sia il più allineata possibile.
16. Poiché il target MALDI può contenere fino a due diapositive, posizionare le sezioni di più campioni della stessa coorte su una singola diapositiva o su due diapositive, per garantire che possano essere analizzate contemporaneamente.
17. Al termine, posizionare le diapositive ITO in una scatola sottovuoto e trasferirle in un essiccatore con essiccante. Asciugare sottovuoto il vetrino per 45-60 min.
    NOTA: Se un essiccatore sottovuoto non è disponibile in laboratorio, tenere i vetrini sotto i -20 °C per tutto il tempo per evitare il deterioramento dei metaboliti.
18. Stoccaggio e spedizione dei vetrini: a meno che il campione non sia preparato dalle strutture principali di imaging MALDI per procedere direttamente all'imaging MALDI, conservare i vetrini a -80 °C o spedirlo alle strutture principali o ad altri laboratori di ricerca MALDI su ghiaccio secco.
19. Per preservare al meglio i campioni, posizionare i vetrini nel trasportatore di diapositive, riempirlo di azoto (opzionale), sigillare con parafilm, metterlo in un sacchetto con cerniera, che viene quindi inserito in un altro sacchetto con cerniera contenente essiccante. Etichettare il sacchetto esterno con zip.
20. Procedere allo stoccaggio a -80 °C (fino a 6 mesi) o alla spedizione con ghiaccio secco adeguato.

3. Preparazione della matrice

1. Preparare la matrice.
   NOTA: Tutti i reagenti devono essere di grado HPLC.
   1. Preparare NEDC ad una concentrazione di 10 mg/ml. Preparare 10 ml di matrice disciolta in un solvente al 70% di metanolo (100 mg di NEDC, 7 ml di metanolo, 3 ml di H₂O).
   2. Preparare inoltre un extra di 10 ml di metanolo al 70%: soluzione acquosa per lavare il sistema di spruzzatura prima di riempire la matrice.
2. Una volta disidratate le diapositive nel passaggio 2.17, posizionare i segni "X" sullo spazio vuoto del vetrino al di fuori delle sezioni di tessuto utilizzando un pennarello in argento a punta in grassetto, quindi posizionare una seconda "x" con un pennarello nero a punta fine sopra la "X" d'argento. La "X" nera con un netto contrasto fuori dallo sfondo argentato (la "X" in grassetto d'argento) servirà in seguito come marcatore fiduciario per la successiva acquisizione di spettri di massa nello strumento MALDI.
3. Caricare la diapositiva nel target metallico della diapositiva MALDI. Usa una copertura di plastica e disegna / delinea dove i campioni si trovano sul coperchio di plastica. Accantonare.
4. Scansiona l'immagine della diapositiva insieme al target MALDI utilizzando lo scanner piano. Le viti sulla superficie del bersaglio fungeranno da distanziatore per prevenire il danneggiamento o la contaminazione della sezione tissutale da parte dello scanner. Visualizza in anteprima ed esegui la scansione dell'area di scorrimento selezionata in scala di grigi a 16 bit e 2400 dpi. Salvare l'immagine per un uso successivo in MALDI MSI.

4. Deposizione della matrice

NOTA: Esistono diversi metodi per applicare uno strato uniforme di matrice in dimensioni di cristallo fine sulla diapositiva MALDI, tra cui sublimazione, stampa a getto d'inchiostro a goccia, spruzzatore automatico a matrice e spray manuale utilizzando artist airbush⁹. Useremo lo spruzzatore a matrice automatica come esempio in questo protocollo per la sua elevata riproducibilità.

1. Avvio: accendere l'unità spruzzatrice a matrice, assicurandosi che la valvola sia posizionata a LOAD e avviare il software dello spruzzatore. Controllare che la ventola di scarico funzioni bene. Non avviare la pompa del solvente se lo sfiato attivo non funziona correttamente.
2. Confermare nella scheda Comunicazione che tutto stia comunicando, quindi avviare la pompa del solvente a .1 mL / min, con una contropressione di ~ 500 psi (o 3,4 MPa).
3. Avviare il flusso di aria compressa allo spruzzatore a matrice impostando il serbatoio dell'azoto a 30 psi. Quindi, regolare il regolatore di pressione sulla parte anteriore dello spruzzatore a 10 psi e impostare la temperatura dell'ugello dello spruzzatore come desiderato.
   NOTA: Se la pressione dell'aria in preghiera è inferiore a 5 psi, l'ugello dello spruzzatore non sarà in grado di riscaldarsi per protezione.
4. Con la valvola ancora in posizione LOAD, utilizzare una siringa per lavare l'anello con 7 ml di metanolo al 70%, quindi riempire il ciclo con 6 mL di matrice.
5. Posizionare i vetrini di tessuto nei supporti dello spruzzatore, nastrando entrambe le estremità per impedire il movimento e per preservare un bordo privo di matrice per evitare la contaminazione del morsetto metallico sul bersaglio MALDI da parte della matrice.
   NOTA: Si consiglia vivamente di testare lo spray a matrice su un vetrino per microscopio bianco prima di procedere a preziosi vetrini campione.
6. Controllare che la portata e la temperatura siano stabili per iniziare la spruzzatura.
7. Selezionare il metodo desiderato pre-testato utilizzando un vetrino vuoto.
8. Premere Start. Questo regolerà la temperatura dell'ugello e regolerà la portata della pompa in modo che corrisponda al metodo selezionato. Commutare la valvola dalla posizione Carico a Quella Spruzzo, quindi confermare facendo clic su Continua.
9. Consentire l'esecuzione del sistema, che richiederà 5-20 minuti per diapositiva a seconda del metodo. Spostare la valvola dalla posizione Spray alla posizione Load, quindi confermare facendo clic su Continua al termine.
10. Rimuovere i vetrini dallo spruzzatore, esaminare il modello di rivestimento della matrice al microscopio per garantire uno strato uniforme di cristallo a matrice fine.
11. Dopo la deposizione della matrice, posizionare le diapositive nel supporto MALDI metallico per un uso immediato. Se è presente un solo vetrino campione, aggiungere un'altra diapositiva vuota per riempire i due spazi del supporto MALDI.
12. Pulire il sistema immediatamente dopo l'uso seguendo le istruzioni del produttore, per evitare l'intasamento dell'ugello dello spruzzatore.
13. Dopo che il vetrino del campione è stato rivestito con matrice, procedere immediatamente allo strumento di imaging MALDI o spedirlo con ghiaccio secco utilizzando la stessa preparazione a doppia cerniera descritta nel passaggio 2.19.
    NOTA: In circostanze di emergenza come lo strumento MALDI non è disponibile per l'uso immediato, conservare il vetrino rivestito sotto vuoto o a -20 °C per un massimo di 24 ore, anche se il deterioramento di alcuni metaboliti potrebbe verificarsi durante lo stoccaggio, che non è stato studiato a fondo.

L'esperimento rappresentativo è stato eseguito in base al flusso di lavoro illustrato nella Figura 1. I cervelli di topo wildtype C57BL in via di sviluppo dei giorni postnatali 1, 21, 60 (adulti) sono stati raccolti come descritto sopra seguendo le linee guida CUNY IACUC e sono stati congelati a scatto per 2, 5 e 7 minuti, rispettivamente, su una barca di alluminio che galleggia su azoto liquido. I tessuti congelati sono stati criosezionati a sezioni di spessore di 10 μm a -15 °C impostate sia per la testa del campione che per la camera. Le criosezioni tissutali sono state quindi trasferite delicatamente sul lato conduttivo pre-raffreddato dei vetrini rivestiti itO per l'imaging MALDI. Le criosezioni montate su vetrini ITO sono state essiccate sotto vuoto per 45 minuti a temperatura ambiente, seguite dalla deposizione della matrice utilizzando lo spruzzatore automatico a matrice. La matrice NEDC è stata utilizzata per rilevare i metaboliti e una soluzione di matrice di 10 mg/mL in metanolo/acqua (70/30, v/v) è stata depositata a una portata di 0,1 ml/min e una temperatura dell'ugello di 75 °C per 12 cicli con 5 s di essiccazione tra ogni ciclo. È stata utilizzata una velocità di spruzzatura di 1300 mm/min, una spaziatura del binario di 2 mm,una pressione del gas N 2 di 10 psi e una portata di 3 L/min e un'altezza dell'ugello di 40 mm.

Gli spettri di massa MALDI sono stati acquisiti in modalità ioni negativi dallo strumento MALDI time of flight (TOF) MSI. 0,5-1 μL di emulsione di fosforo rosso (gruppi Pn con n = 1 - 90) in metanolo sono stati depositati sui vetrini ITO, accanto ai tessuti montati, e utilizzati per calibrare lo strumento nell'intervallo di massa 100 - 1000 m/z applicando la curva di calibrazione quadratica13. I diametri dello spot laser sono stati focalizzati su un profilo del fascio modulato "Medio" per una larghezza raster di 50 μm. Spettri all'interno della gamma di massa da m/ z 50 a 1000 sono stati acquisiti a 1000 Hz per 500 colpi. Sono stati registrati i dati degli spettri di massa e l'imaging è stato ulteriormente analizzato utilizzando il software avanzato di analisi dei dati MALDI MSI. Le immagini ioniche sono state generate con normalizzazione RMS (root-mean square) a una larghezza del bin di ±0,25 Da.

I risultati nella Figura 2 mostrano le immagini di output del software di analisi dei dati MALDI MSI di spettri m/z selezionati ogni intervallo di 100 Dalton, che descrivono chiaramente l'utilità per l'identificazione degli spettri dai metaboliti di piccole molecole ai lipidi ad alto peso molecolare. Ogni riga raffigura le rispettive mappe di calore ioiche contenenti informazioni spaziali e spettrali di una determinata specie di metaboliti attraverso tre tessuti raccolti ai giorni postnatali 1, 21 e 60. Per ogni m/z rappresentativo, l'analisi della distribuzione regionale e delle abbondanze di ioni può essere utilizzata per confrontare le quantità relative delle specie corrispondenti tra le diverse età. Un punto di forza della metodologia MALDI MSI è la capacità di discernere la specificità di alcune specie identificate da m/z a tappe dello sviluppo o a specifiche strutture anatomiche. Si osserva che alcuni metaboliti sono arricchiti nei neonati P1 (m/z 320,1), arricchiti negli adulti P60 (m/z 846,5) o distribuiti uniformemente tra le età (m/z 480,3); altre specie molecolari sono specificamente arricchite in materia grigia (m/z 117.1; 524.3; 765.1), sostanza bianca (m/z 673.4; 846.5) o CSF/ventricoli (m/z 239.0) (Figura 2A). Viene inoltre mostrata la distribuzione spaziale di metaboliti rappresentativi tra cui ipoxantina (m/z 135.0), acido N-acetil-L-aspartico (m/z 174.0), acido arachidonico (m/z 303.2) e diversi lipidi come lisofosfatidilethanolamine LPE (18:1) (m/z 478.3), LPE(20:4) (m/z 500.3), LPE (22:6) (m/z 524.3), fosfatidiletanolammina PE (44:10) (m/z 838.5), Fosfatidilinositolo PI(38:4) (m/z 885.6) (Figura 2B).

Figura 1. Flusso di lavoro dell'imaging della spettrometria di massa MALDI- time of flight (TOF). Il tessuto congelato a scatto viene criosciotto in criostato e montato su vetrino ITO. → Il vetrino con sezioni di tessuto è rivestito con un sottile strato di matrice utilizzando uno spruzzatore automatico a matrice. → spettri di massa sono raccolti dallo strumento MALDI-TOF MSI ad un raster di 20-200um. → I dati vengono analizzati e le immagini vengono generate utilizzando il software avanzato di analisi dei dati MALDI MSI. Barra della scala: 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Uscita rappresentativa con spettri m/z selezionati dalla spettrometria di massa acquisita a risoluzione laterale di 50 μm. (A) Una mappa termica raffigura la distribuzione spaziale di specifiche specie di metaboliti selezionati da ogni intervallo di 100 Dalton m/z attraverso le tre tappe dello sviluppo identificate a P1, P21 e P60. (B) La distribuzione spaziale di metaboliti rappresentativi a P1, P21 e P60, tra cui: ipoxantina, acido N-acetil-L-aspartico, acido arachidonico e diverse specie lipidiche come lisofosfatidilethanolamine (LPE), fosfatidilfetanolammina (PE), fosfatidilinositolo (PI). Barra della scala, 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non dichiarano interessi finanziari concorrenti.