Etichettatura e visualizzazione dei prodotti di espressione del genoma mitocondriale nel lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae

Summary

Il genoma mitocondriale del lievito di Baker codifica otto polipeptidi. L'obiettivo del protocollo corrente è etichettarli tutti e successivamente visualizzarli come bande separate.

Abstract

I mitocondri sono organelli essenziali di cellule eucariotiche in grado di respirazione aerobica. Contengono un genoma circolare e un apparato di espressione genica. Un genoma mitocondriale del lievito del fornaio codifica per otto proteine: tre subunità della citocromo c ossidasi (Cox1p, Cox2p, e Cox3p), tre subunità dell'ATP sintasi (Atp6p, Atp8p e Atp9p), una subunità dell'enzima ubichinolo-citocromo c ossidoreduttasi, citocromo b (Cytb) e proteina ribosomiale mitocondriale Var1p. Lo scopo del metodo qui descritto è quello di etichettare specificamente queste proteine con metinina ³⁵S, separarle per elettroforesi e visualizzare i segnali come bande discrete sullo schermo. La procedura prevede diversi passaggi. In primo luogo, le cellule di lievito vengono coltivate in un mezzo contenente galattosio fino a raggiungere la fase di crescita logaritmica tardiva. Successivamente, il trattamento cicloeximide blocca la traduzione citoplasmatica e consente ^{l'incorporazione}di metoionina 35 S solo nei prodotti di traduzione mitocondriale. Quindi, tutte le proteine vengono estratte dalle cellule di lievito e separate dall'elettroforesi del gel di poliacrilammide. Infine, il gel viene asciugato e incubato con lo schermo di fosforo di stoccaggio. Lo schermo viene scansionato su un fosforimager che rivela le bande. Il metodo può essere applicato per confrontare il tasso di biosintesi di un singolo polipeptide nei mitocondri di un ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico, che è utile per studiare i difetti dell'espressione genica mitocondriale. Questo protocollo fornisce preziose informazioni sul tasso di traduzione di tutti gli mRNA mitocondriali del lievito. Tuttavia, richiede diversi controlli ed esperimenti aggiuntivi per trarre conclusioni adeguate.

Introduction

I mitocondri sono gli organelli profondamente coinvolti nel metabolismo di una cellula eucariotica. La loro catena di trasferimento di elettroni fornisce alla cellula ATP, la principale valuta energetica utilizzata in più vie biochimiche. Inoltre, sono coinvolti in apoptosi, sintesi di acidi grassi ed eme e altri processi. La disfunzione dei mitocondri è una fonte ben nota di malattia umana¹. Può derivare da mutazioni nei geni nucleari o mitocondriali che codificano componenti strutturali o regolatori degli organelli². Il lievito di Baker Saccharomyces cerevisiae è un eccellente organismo modello per lo studio d....

Protocol

1. Preparazione della coltura del lievito

1. Striature di lievito dalle colture di stock congelate su piatti freschi con il mezzo appropriato. Mettere le piastre in un incubatore di coltura a 30 °C per 24-48 ore.
   NOTA: Lascia che i mutanti sensibili alla temperatura crescano alla temperatura permissiva.
2. Inoculare le colture di lievito in 2 ml di mezzo YPGal (2% peptone, 1% estratto di lievito, 2% di galattosio) dalla striscia fresca in tubi da 15 ml e incubarle durante la notte agitando a 200 giri/min a 30 °C.
3. Misurare la densità ottica della coltura ad una lunghezza d'onda di 600 nm (OD₆₀₀).
4. Prendere il volume corris....

Results

Seguendo il protocollo sopra descritto, abbiamo assegnato prodotti di traduzione mitocondriale da due ceppi di S. cerevisiae: il tipo selvatico (WT) e una cancellazione mutante del gene AIM23 (AIM23Δ), codificando il fattore di iniziazione alla traduzione mitocondriale 3 (Tabella 1)⁸. I prodotti di traduzione mitocondriale sono stati etichettati e separati radioattivamente in SDS-PAAG9. I campioni sono stati raccolti ogni 2,5 minuti prima della .......

Discussion

Le indagini sull'espressione genica occupano una parte centrale nelle moderne scienze della vita. Sono stati sviluppati numerosi metodi che forniscono informazioni su questo complesso processo. Qui, abbiamo descritto il metodo che consente di accedere alla biosintesi proteica nel lievito di fornaio S. cerevisiae mitochondria. Di solito viene applicato per confrontare le efficienze di traduzione degli mRNA nei mitocondri del ceppo di lievito mutante rispetto al tipo selvatico per accedere alle conseguenze della m.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanolo	Sigma-Aldrich	M3148
Acrilammide	Sigma-Aldrich	A9099
Persolfato di ammonio	Sigma-Aldrich	A3678
Agar batteriologico	Sigma-Aldrich	A5306
Densimetro per celle Biowave CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
Cuvette monouso standard MARCA	Sigma-Aldrich	Z330361
cloroformio	Sigma-Aldrich	288306
cicloesimide	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galattosio	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-glucosio	Sigma-Aldrich	G7021
riscaldatore a blocco digitale	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L-[35S]-Metionina, 500µ Ci (18,5 MBq), soluzione acquosa stabilizzata	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Centrifuge 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Storage Phosphor Screens	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-metionina	Sigma-Aldrich	M9625
metanolo	Sigma-Aldrich	34860
N,N,N′,N′-Tetrametiletilendiammina	Sigma-Aldrich	T9281
N,N′-Metilenebisacrilammide	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44/44R Shaker Incubatore	New Brunswick Scientific
Peptone da carne, batteriologico	Millipore	91249
Fenilmetanosulfonilfluoruro	Sigma-Aldrich	P7626
Kit di analisi delle proteine Pierce 660nm	Thermo Scientific	22662
PowerPac Alimentatore di base	Bio-Rad	1645050
Protean II xi cell	Bio-Rad	1651802
Puromicina dicloridrato da Streptomyces alboniger	Sigma-Aldrich	P8833
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	221465
Storm 865 imager al fosforo	GE Healthcare
Trizma base	Sigma-Aldrich	93352
Essiccatore di gel riscaldato sottovuoto	Mannaia Scientific	CSL-GDVH
Estratto di lievito	Sigma-Aldrich	Y1625