Questo protocollo utilizza un test di immunofluorescenza per rilevare danni al DNA indotti da PM2,5nei cuori sezionati degli embrioni di zebrafish.
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Articolo metodologico
Utilizzo dell'immunofluorescenza per rilevare il danno al DNA indotto da PM2,5nei cuori embrionali di zebrafish
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'esposizione al particolato fine ambientale (PM2,5)può portare a tossicità per lo sviluppo cardiaco, ma i meccanismi molecolari sottostanti non sono ancora chiari. L'8-idrossi-2'deossigenasi (8-OHdG) è un marker del danno ossidativo al DNA e γH2AX è un marcatore sensibile per le rotture del doppio filamento del DNA. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare i cambiamenti 8-OHdG eγH2AXindotti da PM 2,5 nel cuore degli embrioni di zebrafish utilizzando un test di immunofluorescenza. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con sostanze organiche estraibili (EOM) da PM2,5 a 5 μg/mL in presenza o assenza di N-acetil-L-cisteina antiossidante (NAC, 0,25 μM) a 2 ore dopo la fecondazione (hpf). DMSO è stato utilizzato come controllo del veicolo. A 72 hpf, i cuori sono stati sezionati dagli embrioni usando un ago a siringa e fissati e permeabilizzati. Dopo essere stati bloccati, i campioni sono stati sondati con anticorpi primari contro 8-OHdG e γH2AX. I campioni sono stati poi lavati e incubati con anticorpi secondari. Le immagini risultanti sono state osservate al microscopio a fluorescenza e quantificate utilizzando ImageJ. I risultati mostrano che EOM da PM2.5 ha migliorato significativamente i segnali 8-OHdG e γH2AX nel cuore degli embrioni di zebrafish. Tuttavia, NAC, agendo come spazzino di specie reattive dell'ossigeno (ROS), ha parzialmente contrastato il danno al DNA indotto dall'EOM. Qui, presentiamo un protocollo di immunofluorescenza per studiare il ruolo del danno al DNA nei difetti cardiaci indotti da PM2,5che possono essere applicati al rilevamento di cambiamenti di espressione proteica indotti da sostanze chimiche ambientali nei cuori degli embrioni di zebrafish.
Introduzione
L'inquinamento atmosferico è ora un grave problema ambientale che il mondo deve affrontare. Il particolato fine ambientale (PM2,5), che è uno degli indicatori più importanti della qualità dell'aria, può trasportare un gran numero di sostanze nocive ed entrare nel sistema circolatorio del sangue, causando gravi danni alla salute umana1. Studi epidemiologici hanno dimostrato che l'esposizione al PM2,5 può portare ad un aumento del rischio di difetti cardiaci congeniti (CHD)2,3. Le prove degli esperimenti sugli animali hanno anche dimostrato che il PM2,5 pu....
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Protocollo
Il pesce zebra selvatico (AB) utilizzato in questo studio è stato ottenuto dal National Zebrafish Resource Center di Wuhan, in Cina. Tutte le procedure per gli animali qui descritte sono state riviste e approvate dall'Animal Care Institution del Comitato Etico della Soochow University.
1. Campionamento PM2.5 ed estrazione di composti organici
NOTA: PM2.5 è stato raccolto in un'area urbana a Suzhou, Cina, 1-7 agosto 2015, come descritto in precedenza5.
- Cuocere filtri a membrana di quarzo da 47 mm in un forno a muffola a 500 °C per 2 ore per rimuovere i compon....
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Risultati
Questo test di immunofluorescenza è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti di espressione proteica nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a sostanze chimiche ambientali.
In questa analisi rappresentativa, gli embrioni esposti a PM2,5 in assenza o presenza del NAC antiossidante sono stati valutati per la presenza di malformazioni cardiache (Figura 1). Come osserv.......
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Discussione
Sebbene il pesce zebra sia un eccellente modello di vertebrato per studiare la tossicità dello sviluppo cardiaco delle sostanze chimiche ambientali, a causa delle piccole dimensioni del cuore dell'embrione, è difficile ottenere abbastanza proteine per l'analisi western blot. Pertanto, presentiamo un metodo di immunofluorescenza sensibile per quantificare i livelli di espressione proteica dei biomarcatori di danno al DNA nei cuori degli embrioni di zebrafish esposti a PM2.5.
Durante .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Nature Sciences Foundation of China (numero di sovvenzione: 81870239, 81741005, 81972999) e the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 8-OHdG Anticorpo | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-66036 | Anticorpo primario |
| Bilancia analitica | Sartorius, Cina | BSA124S | |
| BSA | Solarbio, Pechino, Cina | SW3015 | Per il blocco |
| DAPI | Abcam, USA | ab104139 | Per controcolorazione nucleare. |
| DMSO | Solarbio,Pechino,Cina | D8371 | |
| Microscopio a fluorescenza | Olympus, Giappone | IX73 | Per l'imaging di segnali di fluorescenza/ |
| Capra Anti-coniglio IgG Cy3 | Carlsbad,USA | CW0159 | Anticorpo secondario |
| Capra Anti-coniglio IgG FITC | Carlsbad,USA | RS0003 | Anticorpo secondario |
| N-acetil-L-cisteina (NAC) | Adamas-Beta, Shanghai, Cina | 616-91-1 | |
| Agitatore orbitale | QILINBEIER, Cina | TS-1 | |
| Paraformaldeide | Sigma, Cina | P6148 | Fare il 4% di paraformaldeide per la fissazione. |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | HyClone, USA | SH30256.01 | Preparare 0,1% Tween in PBS per il lavaggio. |
| Campionatore PM2.5 | TianHong, Wuhan, Cina | TH-150C | Per il campionamento ininterrotto di PM2.5 24 ore su 24. |
| Sistema di acquacoltura a ricircolo | HaiSheng, Shanghai, Cina | Il pesce zebra è stato mantenuto in esso. | |
| Estrattore Soxhlet | ZhengQiao, Shanghai, Cina | BSXT-02 | Per l'estrazione di componenti organici. |
| Stereomicroscopio | Nikon, Canada | SMZ645 | Per la dissezione cardiaca da embrioni di zebrafish. |
| Tricaina metanosulfonato (MS222) | Sigma, Cina | E10521 | Per anestetizzare embrioni di pesce zebra |
| Tween 20 | Sigma, Cina | P1379 | |
| & gamma; Anticorpo H2AX | Abcam, USA | ab26350 | Anticorpo primario |
Riferimenti
- WHO. Ambient (outdoor) air quality and health . World Health Organization. , Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs313/en/ (2018).
- Zhang, B., et al. Maternal Exposure to Air Pollution and Risk of Congenital Heart Defects. European Journal of Pediatrics. 175, 1520(2016).
- Huang, C. C., Chen, B. Y., Pan, S. C.,....
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Ristampe e permessi
