Presentiamo un metodo per l'acquisizione di corsi di tempo reporter a fluorescenza da singole cellule utilizzando array micropatterned. Il protocollo descrive la preparazione di array a cella singola, la configurazione e il funzionamento della microscopia time-lapse di scansione a celle vive e uno strumento di analisi delle immagini open source per la preselezione automatizzata, il controllo visivo e il tracciamento dei corsi di tempo di fluorescenza integrati nelle celle per sito di adesione.
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Articolo metodologico
Imaging a cellule vive di array a cella singola (LISCA) - una tecnica versatile per quantificare la cinetica cellulare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) è un metodo versatile per raccogliere corsi di tempo di segnali di fluorescenza da singole cellule ad alta produttività. In generale, l'acquisizione di corsi di tempo a cella singola da cellule coltivate è ostacolata dalla motilità cellulare e dalla diversità delle forme cellulari. I micro array adesivi standardizzano le condizioni a cella singola e facilitano l'analisi delle immagini. LISCA combina microarray a cella singola con microscopia time-lapse di scansione e elaborazione automatizzata delle immagini. Qui descriviamo le fasi sperimentali di prendere corsi di tempo di fluorescenza a singola cella in formato LISCA. Trasfetteiamo le cellule aderenti a un array di micropattern utilizzando la codifica mRNA per proteine fluorescenti verdi avanzate (eGFP) e monitoriamo la cinetica di espressione eGFP di centinaia di cellule in parallelo tramite microscopia time-lapse di scansione. Gli stack di dati delle immagini vengono elaborati automaticamente da un software di nuova sviluppo che integra l'intensità della fluorescenza sui contorni delle celle selezionati per generare corsi di tempo a fluorescenza a singola cella. Dimostriamo che i corsi di tempo di espressione eGFP dopo la trasfezione dell'mRNA sono ben descritti da un semplice modello di traduzione cinetica che rivela i tassi di espressione e degradazione dell'mRNA. Vengono discusse ulteriori applicazioni di LISCA per le correlazioni del tempo degli eventi di più marcatori nel contesto dell'apoptosi di segnalazione.
Introduzione
Negli ultimi anni, l'importanza degli esperimenti a una cellula è diventata evidente. I dati provenienti da singole celle consentono l'analisi della variabilità da cella a cella, la risoluzione delle correlazioni dei parametri intracellulari e il rilevamento della cinetica cellulare che rimangono nascoste nelle misurazionidell'insieme 1,2,3. Al fine di studiare la cinetica cellulare di migliaia di singole cellule in parallelo, sono necessari nuovi approcci che consentano di monitorare le cellule in condizioni standardizzate per un periodo di tempo di diverse ore fino a divers....
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Protocollo
Figura 2: Acquisizione di dati che combina microarray a cella singola (A) con microscopia time-lapse a scansione (B). Durante la preparazione dell'esperimento time-lapse, viene preparato un array a cella singola con un micropattern 2D di quadrati di adesione (1), seguito dalla semina cellulare e dall'allineamento delle cellule sul micropattern (2), nonché dalla connessione di un sistema di perfusione allo scivolo a sei canali, che consente la movimentazione del liquido durante la misurazione time-lapse (....
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Risultati
L'approccio LISCA consente di raccogliere in modo efficiente corsi di tempo di fluorescenza da singole cellule. Come esempio rappresentativo viene illustrato come viene applicato il metodo LISCA per misurare l'espressione eGFP a cella singola dopo la trasfezione. I dati dell'esperimento LISCA vengono utilizzati per valutare la cinetica di somministrazione dell'mRNA, che è importante per lo sviluppo di farmaci mRNA efficienti.
In particolare dimostriamo il diverso impatto di due sistemi di erog.......
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Discussione
Qui abbiamo descritto LISCA come una tecnica versatile per seguire la cinetica cellulare delle etichette fluorescenti intracellulari a livello a singola cellula. Per eseguire un esperimento LISCA riuscito, ciascuno dei passaggi descritti della sezione del protocollo deve essere stabilito singolarmente e quindi tutti i passaggi devono essere combinati. Ognuno dei tre aspetti principali di LISCA presenta passaggi cruciali.
Fabbricazione di microarray a cella singola
La qualità del mi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fondazione tedesca della scienza (DFG) al Collaborative Research Center (SFB) 1032. Il sostegno del Ministero federale tedesco dell'istruzione, della ricerca e della tecnologia (BMBF) nell'ambito del progetto cooperativo 05K2018-2017-06716 Medisoft e una sovvenzione della Bayerische Forschungsstiftung sono riconosciuti con gratitudine. Anita Reiser è stata sostenuta da una Borsa di Studio DFG attraverso la Graduate School of Quantitative Biosciences Munich (QBM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microtubi in PTFE Adtech Polymer Engineering | Fisher Scientific | 10178071 | |
| forno di cottura | Legante | 9010-0190 | |
| CFI Plan Fluor DL 10x | Nikon | MRH20100 | |
| essiccatore | Roth | NX07.1 | |
| Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| eGFP mRNA | Trilink | L-7601 | |
| Femmina Luer to Tube Connector | MEDNET | FTL210-6005 | |
| Siero fetale bovino | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Fibronectina | Yo Proteine | 663 | |
| Set di filtri eGFP | AHF | F46-002 | |
| Fisherbrand Tubo in silicone polimerizzato al platino traslucido | Fisher Scientific | 11768088 | |
| HEPES (1 M) | Thermo Fisher | 15630080 | |
| Scatola di incubazione | Okolab | OKO-H201 | |
| Binder | 9040-0012 | ||
| L-15 senza rosso fenolo | Thermo Fisher | 21083027 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | ||
| Luer | fabbricato internamente composto da teflon | ||
| Luer maschio a connettore | tubo MEDNET | MTLS210-6005 | alternativa ai luer maschio fabbricati internamente |
| NaCl (5 M) | Thermo Fisher | AM9760G | |
| valvola senza ago a connettore Luer maschio | MEDNET | NVFMLLPC | |
| NIS Elements | Nikon | Software di imaging Versione 5.02.00 | |
| NOA81 | Thorlabs | NOA81 | Adesivo ottico a polimerizzazione rapida per l'assemblaggio di sistemi di tubi |
| Opti-MEM | Thermo Fisher | 31985062 | |
| bordo PCO 4.2 M-USB-HQ-PCO | pco | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | preparata internamente | ||
| Detergente al plasma | Diener Femto | Pico-BRS | |
| PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa) | SuSoS AG | ||
| wafer di silicio con microstrutture | fabbricato internamente | ||
| Sola Light Engine | Lumencor | ||
| sticky slide VI 0.4 | ibidi | 80608 | |
| Sylgard 184 Kit Elastomero Siliconico | Dow Corning | 1673921 | |
| Tango 2 | Mä rzhä utente | 00-24-626-0000 | |
| Acqua | preparata | ||
| internamente vetrini coprioggetti non rivestiti | ibidi | 10813 | |
| Injekt-F Solo, 1 mL | Omilab | 9166017V | con sporn di ricambio |
Riferimenti
- Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
- Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).....
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Ristampe e permessi
