Qui presentiamo un metodo semplice per separare le cellule follicolari e gli ovociti nei follicoli ovarici di zebrafish, che faciliterà le indagini sullo sviluppo ovarico nel pesce zebra.
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Articolo metodologico
Separazione delle cellule follicolari e degli ovociti nei follicoli ovarici di Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zebrafish è diventato un modello ideale per studiare lo sviluppo ovarico dei vertebrati. Il follicolo è l'unità di base dell'ovaio, che consiste di ovociti e cellule follicolari circostanti. È fondamentale separare sia le cellule follicolari che gli ovociti per vari scopi di ricerca come per la coltura primaria di cellule follicolari, l'analisi dell'espressione genica, la maturazione degli ovociti e la fecondazione in vitro, ecc. Il metodo convenzionale utilizza le forcep per separare entrambi i compartimenti, il che è laborioso, richiede molto tempo e ha alti danni all'ovocita. Qui, abbiamo stabilito un metodo semplice per separare entrambi i compartimenti utilizzando un capillare in vetro tirato. Sotto uno stereomicroscopio, gli ovociti e le cellule follicolari possono essere facilmente separati mediante pipettazione in un capillare di vetro fine tirato (il diametro dipende dal diametro del follicolo). Rispetto al metodo convenzionale, questo nuovo metodo ha un'alta efficienza nella separazione sia degli ovociti che delle cellule follicolari e ha bassi danni agli ovociti. Ancora più importante, questo metodo può essere applicato ai follicoli in fase iniziale anche nella fase pre-vitellogenesi. Pertanto, questo semplice metodo può essere utilizzato per separare le cellule follicolari e gli ovociti del pesce zebra.
Introduzione
Zebrafish è un importante organismo modello per lo studio dello sviluppo e della fisiologia dei vertebrati. Il pesce zebra può servire come un buon modello per lo studio dei meccanismi molecolari dello sviluppoovarico 1,2,3. Molte caratteristiche dello sviluppo ovarico sono molto conservate durante l'evoluzione dai pesci ai mammiferi1,2. Simile agli altri vertebrati, gli adulti zebrafish hanno ovaie asincrone, contenenti follicoli ovarico di tutte le fasi di sviluppo4. Il follicolo è l'elemento....
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Protocollo
Tutte le procedure eseguite negli esperimenti sui pesci sono conformi alle normative del Comitato Etico per la Sperimentazione Animale della Northwest Normal University.
1. Preparativi
- animali
- Usa il pesce zebra femmina adulto con una lunghezza del corpo di 4-6 cm.
NOTA: Abbiamo usato il pesce zebra di un mercato locale. - Mantenere il pesce zebra in un sistema idrico circolato con una luce di 14 ore e un ciclo buio di 10 ore a circa 28 °C.
- Nutrire il pesce due volte al giorno con gamberetti salamoia appena nati.
- Usa il pesce zebra femmina adulto con una lunghezza del corpo di 4-6 cm.
- Capillare in vetro tirato
- Utilizzare un capillare di vetr....
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Risultati
Questo metodo può essere utilizzato per separare cellule follicolari e ovociti in diverse fasi dello sviluppo del follicolo ovarico nel pesce zebra. La figura 1 mostra la separazione degli ovociti zebrafish e delle cellule follicolari dai follicoli ovarici utilizzando un tubo di vetro capillare (Figura 1). Per verificare se le cellule follicolari fossero separate da follicoli intatti, i follicoli intatti e gli ovociti separati da diversi stadi dei follicoli dall.......
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Discussione
Descriviamo qui un nuovo metodo per la semplice e rapida separazione delle cellule follicolari e degli ovociti dai follicoli ovarici di zebrafish. Questo metodo ha diversi vantaggi rispetto al metodo convenzionale. Il principale di questi è la facilità di separazione notevolmente aumentata con alta efficienza ed efficacia, in quanto è necessaria una sola manipolazione esterna. Questo punto aumenta l'applicabilità ai ricercatori che non sono bravi nell'anatomia microscopica. Secondo la nostra esperienza, si possono separa.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro di ricerca è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [32060170, 31601205 e 31560334], progetto di visiting scholar sostenuto dal China Scholarship Council e dal fondo del Laboratorio chiave statale di ecologia e biotecnologia d'acqua dolce [2020FB05].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 17&alfa;,20β-DHP | Cayman | 16146-5 (5 mg) | |
| Piastra a 24 pozzetti | Corning | 3524 | |
| Taglierina per fiale | AS ONE | 5-124-22 1 busta (100 pezzi) | |
| Anidro Na2HPO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Gamberetti in salamoia | Hongjie | 250 g | |
| CaCl2 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Piatto di coltura | Biosharp | BS-90-D (10PCS/PK) | |
| DAPI | Solarbio | S2110 (25mL) | |
| Microscopio da dissezione | ZEISS | Stemi 305 | |
| Pinza da dissezione | VETUS | HRC30 | |
| Forbice da dissezione | Kefu | 160 mm | |
| Stereomicroscopio a fluorescenza | Leica | M205C | |
| Capillare in vetro | IWAKI | IK-PAS-5P (200 pz/CONF.) | |
| Hoechst 33342 | Solarbio | C0031 (1 mg) | |
| KCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| KH2PO4 | Kaixin Chemical | 500 g | |
| Leibovitz' s L-15 medio | Gibco | 41300-039 (10&volte; 1L) | |
| MgSO4• 7H2O | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Puntali per micropipette | Axygen | MCT-150-C | |
| NaCl | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| NaHCO3 | Beichen Fangzheng | 500 g | |
| Penicilia-streptomycia | Gibco | #15140122 (100 mL) | |
| Stereomicroscopio | ZEISS | Scopri.v20 |
Riferimenti
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish development. Molecular and Cellular Endocrinology. 312, 42-52 (2009).
- Ge, W. Intrafollicular paracr....
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Ristampe e permessi
