I peptidi penetranti nelle cellule (CPP) sono definiti come vettori in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule. Una delle principali caratteristiche comuni richieste per questa attività deriva dalle interazioni dei CPP con la membrana plasmatica (lipidi) e più in particolare con componenti della matrice extracellulare della membrana stessa (eparano solfato). Infatti, indipendentemente dalla traslocazione diretta o dall'internalizzazione endocitosi-dipendente, i doppi strati lipidici sono coinvolti nel processo di internalizzazione sia a livello della membrana plasmatica che a livello del traffico intracellulare (vescicole endosomiali). In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive le diverse fasi di una formulazione, purificazione, caratterizzazione e applicazione di vescicole unilamellari di grandi dimensioni (LUV) nel saggio di perdita di fluorescenza al fine di rilevare possibili destabilizzazioni / interazioni CPP-membrana e affrontare il loro ruolo nel meccanismo di internalizzazione. I LUV con una composizione lipidica che riflette il contenuto della membrana plasmatica vengono generati per incapsulare sia un colorante fluorescente che un quencher. L'aggiunta di peptidi nel mezzo extravesicolare e l'induzione di interazioni peptido-membrana sui UV potrebbero quindi indurre in modo dose-dipendente un significativo aumento della fluorescenza rivelando una perdita. Esempi sono forniti qui con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WNAP) ricchi di recente, che hanno mostrato una consegna rapida ed efficiente di siRNA in varie linee cellulari. Infine, la natura di queste interazioni e l'affinità per i lipidi sono discusse per comprendere e migliorare la traslocazione della membrana e/o la fuga endosomiale.