Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

Karidia Konate; Quentin Seisel; Eric Vivès; Prisca Boisguérin; Sébastien Deshayes

doi:10.3791/62028

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Articolo metodologico

Saggio di perdita fluorescente per studiare la destabilizzazione della membrana da parte di peptidi a penetrazione cellulare

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DOI:

10.3791/62028

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19 dicembre 2020

Karidia Konate¹ , Quentin Seisel¹ , Eric Vivès¹ , Prisca Boisguérin¹ , Sébastien Deshayes¹

¹PHYMEDEXP, INSERM U1046 - CNRS UMR 9214 - University of Montpellier

In questo articolo

Sommario

Il test di perdita di fluorescenza è un metodo semplice che consente di studio delle interazioni peptidi/membrana al fine di comprendere il loro coinvolgimento in diversi processi biologici e in particolare la capacità dei peptidi penetranti nelle cellule di disturbare i doppio strati dei fosfolipidi durante un processo di traslocazione cellulare diretta.

Abstract

I peptidi penetranti nelle cellule (CPP) sono definiti come vettori in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule. Una delle principali caratteristiche comuni richieste per questa attività deriva dalle interazioni dei CPP con la membrana plasmatica (lipidi) e più in particolare con componenti della matrice extracellulare della membrana stessa (eparano solfato). Infatti, indipendentemente dalla traslocazione diretta o dall'internalizzazione endocitosi-dipendente, i doppi strati lipidici sono coinvolti nel processo di internalizzazione sia a livello della membrana plasmatica che a livello del traffico intracellulare (vescicole endosomiali). In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato che descrive le diverse fasi di una formulazione, purificazione, caratterizzazione e applicazione di vescicole unilamellari di grandi dimensioni (LUV) nel saggio di perdita di fluorescenza al fine di rilevare possibili destabilizzazioni / interazioni CPP-membrana e affrontare il loro ruolo nel meccanismo di internalizzazione. I LUV con una composizione lipidica che riflette il contenuto della membrana plasmatica vengono generati per incapsulare sia un colorante fluorescente che un quencher. L'aggiunta di peptidi nel mezzo extravesicolare e l'induzione di interazioni peptido-membrana sui UV potrebbero quindi indurre in modo dose-dipendente un significativo aumento della fluorescenza rivelando una perdita. Esempi sono forniti qui con i peptidi anfipatici ricchi di triptofano (W) e arginina (R) (WNAP) ricchi di recente, che hanno mostrato una consegna rapida ed efficiente di siRNA in varie linee cellulari. Infine, la natura di queste interazioni e l'affinità per i lipidi sono discusse per comprendere e migliorare la traslocazione della membrana e/o la fuga endosomiale.

Introduzione

Dopo la loro scoperta negli anni novanta, sono stati sviluppati peptidi penetranti nelle cellule (CPP) per promuovere un efficiente trasporto cellulare di carichi attraverso la membrana^{plasmatica 1,}^2. I CPP sono di solito peptidi corti, generalmente da 8 a 30 amminoacidi, con un'ampia varietà di origini. Sono stati inizialmente definiti come portatori "traslocanti diretti", il che significa che erano in grado di attraversare la membrana plasmatica e di trasferire un carico nelle cellule indipendentemente da qualsiasi via endocitotica né dal fabbisogno energetico né dal coinvolgimento del recettore. Tuttavia, u....