Isolamento e imaging delle regioni pacemaker intatte e intatte della pelvi renale del topo mediante sezionamento del vibratoma

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare le regioni intatte del pacemaker della pelvi renale del topo utilizzando il sezionamento del vibratoma. Queste sezioni possono quindi essere utilizzate per l'imaging Ca²⁺ in situ per chiarire le proprietà transitorie Di Ca²⁺ delle cellule pacemaker e di altre cellule interstiziali in fette di vibratome.

Abstract

La pelvi renale (RP) è una struttura muscolare liscia a forma di imbuto che facilita il normale trasporto di urina dal rene all'uretere mediante contrazioni regolari e propulsive. Le contrazioni regolari della RP si basano sull'attività del pacemaker, che ha origine dalla regione più prossimale della RP alla giunzione bacino-rene (PKJ). A causa della difficoltà di accedere e preservare i preparati intatti del PKJ, la maggior parte delle indagini sul pacemaking RP si sono concentrate sull'elettrofisiologia a cella singola e sugli esperimenti di imaging Ca^2+. Sebbene da tale lavoro siano emerse importanti rivelazioni sul pacemaking RP, questi esperimenti hanno diversi limiti intrinseci, tra cui l'incapacità di determinare con precisione l'identità cellulare in sospensioni miste e la mancanza di imaging in situ dell'attività del pacemaker RP. Questi fattori hanno portato a una comprensione limitata dei meccanismi che sono alla base delle normali contrazioni ritmiche della RP. In questo articolo, viene descritto un protocollo per preparare segmenti intatti di PKJ del mouse utilizzando una tecnica di sezionamento del vibratoma. Combinando questo approccio con topi che esprimono reporter specifici per cellule e indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati, i ricercatori potrebbero essere in grado di studiare con maggiore precisione i tipi e i meccanismi cellulari specifici responsabili delle contrazioni peristaltiche della RP che sono vitali per il normale trasporto delle urine.

Introduzione

La pelvi renale (RP) è una struttura muscolare liscia a forma di imbuto che trasporta l'urina dal rene all'uretere. La RP trasporta l'urina generando contrazioni ritmiche regolari (peristalsi)^1,2,3,4,5,che spinge un bolo di urina dal rene distalmente all'uretere e infine alla vescica, dove viene conservato fino a quando non si verifica la minzione^6,7. La perdita di questa attività regolare ha conseguenze disastrose, tra cui idronefrosi e insufficienza renale^1,3,8; quindi, c'è un bisogno critico di studiare i meccanismi alla base delle contrazioni RP regolari e ritmiche. Le contrazioni peristaltiche hanno origine dalla regione più prossimale della RP-nella giunzione bacino-rene (PKJ)^{9,10,11,12,13,14,15} ( Figura1A-C) e si propagano distalmente per spingere l'urina dalla papilla nella RP ( Figura1B). L'attività del pacemaker elettrico è registrata nel PKJ come depolarizzazioni transitorie spontanee^{10,11, 12,13,15,16,17,}che si pensa derivino da cellule pacemaker specializzate. Questecellule pacemaker, precedentemente chiamate cellule muscolari lisce atipiche (ASMC), sono pensate per generare o coordinare l'attività del pacemaker e guidare le contrazioni delle cellule muscolari lisce "tipiche" (SMC)^{9,10,11, 18,19,20,21,22,23.}

Gli ASMC sono più abbondanti nella RP prossimale, al PKJ (Figura 1A-C), dove le contrazioni peristaltiche e l'attività del pacemaker elettrico originano^{5,7,8,9,12,13,14,16,17,18,19,20,21 ,22}. Uno studio recentemente pubblicato da questo gruppo ha identificato il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRα), in combinazione con la catena pesante della miosina muscolare liscia (smMHC), come biomarcatore unico per queste cellule interstiziali (IC)²⁴, una scoperta che è stata corroborata da altri gruppi²⁵. Sulla base della loro morfologia e del modello di espressione proteica, queste cellule sono state chiamate PDGFRα⁺ IC tipo 1 (PIC1)^24,26. I PIC1 risiedono nello strato muscolare del PKJ dove mostrano transitori Ca²⁺ ad alta frequenza e breve durata, pensati per essere alla base della generazione di potenziali pacemaker²⁴. Tuttavia, esistono altri tipi di cellule nel PKJ, inclusi i CIRCUITI INTEGRATI PDGFRα⁺ non-smMHC (PIC2) nello strato avventiziale. Rapporti precedenti hanno suggerito che i circuiti integrati non smMHC possono partecipare alla regolamentazione dell'attività del pacemaker¹⁹. Tuttavia, ulteriori studi sui circuiti integrati non smMHC sono ostacolati da una scarsa distinzione durante gli studi di imaging Ca^2+. Tipicamente, i tipi di cellule eterogenee all'interno dei preparati RP sono caricati indiscriminatamente con coloranti sensibili al Ca²⁺(ad esempio, Fluo-4). Per superare queste sfide e studiare una varietà di tipi di cellule nella RP, gli indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (GECI) possono essere utilizzati per esprimere selettivamente fluorofori sensibili al Ca²⁺nei tipi di cellule di interesse.

La maggior parte degli studi che chiariscono le proprietà transitorie di Ca²⁺ in PIC1s/ASMC sono stati ottenuti mediante l'imaging di preparati di tessuto RP a foglio piatto^19,21,27. Poiché i PIC1 sono l'unico tipo di cellula nel PKJ ad esprimere smMHC, l'espressione condizionale del GECI, GCaMP, nelle cellule smMHC⁺ è appropriata per studiare PIC1 in questa configurazione. Tuttavia, poiché PIC1 e PIC2 esprimono entrambi PDGFRα, l'espressione condizionale delle varianti GCaMP nelle cellule PDGFRα⁺ proibisce la distinzione cellulare nei preparati a foglio piatto. Per aggirare questo problema, è stato utilizzato un approccio di sezionamento del vibratomo per distinguere PIC1 e PIC2 attraverso la parete del tessuto PKJ²⁴. Per rivelare queste popolazioni cellulari discrete, la RP è stata sezionata coronalmente, rendendo possibile identificare PIC2 nell'avventizia e PIC1 nella parete muscolare sulla base di noti modelli di etichettatura immunoistochimica e di espressione GECI. Come risultato di questo nuovo approccio di imaging PKJ, PIC1 e PIC2 sono stati trovati per mostrare distinte proprietà di segnalazione Ca^{2+ 24}. Inoltre, isolando le sezioni più prossimali della regione PKJ (Figura 2), la regione pacemaker della RP è stata preservata in un modo che non era stato realizzato in precedenza. Qui, viene descritto un protocollo per mostrare come isolare i preparati PKJ dal rene del topo usando il sezionamento del vibratoma, come impostare questi preparati per gli esperimenti di imaging Ca²⁺ e come distinguere i diversi tipi di cellule attraverso la parete PKJ.

Protocollo

Tutti i topi utilizzati e i protocolli descritti in questo studio erano in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e l'Institutional Animal Use and Care Committee presso l'Università del Nevada, Reno, NV. Anche gli esperimenti e l'uso degli animali sono conformi ai principi e ai regolamenti descritti da Grundy²⁸.

1. Genera mouse PDGFRα-GCaMP6f e SMCGCaMP3

1. Incrociare i mouse GCaMP6f^lox/+ (B6; 129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm95.1(CAG-GCaMP6f)Hze}/J) con mouse PDGFRα^Cre (C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J) per generare topi PDGFRα-GCaMP6f.
2. Incrociare mouse GCaMP3^lox/+ (B6.129S-Gt(ROSA)26Sor^{tm38(CAG-GCaMP3)Hze}/J) con topi maschi smMHC^CreERT2 (B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ER^T2)1Soff/J) per generare mouse SMC-GCaMP3.
   NOTA: Solo i topi maschi della croce (topiGCaMP3^lox/+ e mouse smMHC^CreERT2) possono essere utilizzati poiché l'espressione di Cre è guidata dal cromosoma Y. I mouse smMHC^CreERT2 possono anche essere incrociati con i mouse GCaMP6f^lox/+ per migliorare il rapporto segnale-rumore Ca²⁺ e proprietà temporali del segnale Ca²⁺ più veloci.

2. Preparare e iniettare topi transgenici con tamoxifene per indurre l'espressione condizionale di GCaMP

1. Attivare la cre ricombinatasi inducibile per l'espressione GCaMP specifica della cellula in specifici tipi di cellule, come descritto in precedenza²⁹.

3.   Preparare soluzioni

1. Preparare 1 L di soluzione di bicarbonato Krebs-Ringer (KRB) contenente 120,35 mM NaCl, 5,9 mM KCl, 15,5 mM NaHCO₃, 1,2 mM Na₂HPO_4,1,2 mM MgCl_2,11,5 mM glucosio e 2,5 mM CaCl_2. Il giorno dell'uso, mantenere la soluzione KRB sul ghiaccio.
   NOTA: KRB può essere conservato a 4 °C per un massimo di una settimana e deve essere pre-bollato con una miscela di 97% O₂ e 3% CO₂ per almeno 10 minuti prima dell'uso.

4. Preparare la dissezione rivestita in elastomero di silicio e le stoviglie per l'imaging al microscopio

1. Mescolare i componenti in elastomero di silicio secondo le istruzioni del produttore. Riempire una capsula di Petri da 35 mm x 10 mm e una capsula di Petri da 60 mm x 15 mm circa un quarto pieno di elastomero di silicio liquido per esperimenti di imaging e dissezione, rispettivamente. Polimerizzare l'elastomero di silicio a 37 °C per 1 giorno prima dell'uso.
   NOTA: per migliorare il contrasto delle sezioni sottili del rene, applicare un piccolo cerchio nero di carta alla base della capsula di Petri prima di riempire con elastomero di silicio.

5. Dissezione renale

1. Anestetizzare i topi per inalazione di isoflurano al 3-4% in un cappuccio ventilato. Confermare l'induzione dell'anestesia profonda per perdita del riflesso del pizzico del dito del piede e / o della coda, quindi eutanasizzare i topi per lussazione cervicale.
2. Applicare il 70% di etanolo sul petto per smorzare la pelliccia. Usando le forbici di dissezione esterne, aprire la cavità addominale tramite un'incisione longitudinale, con lame a forbice inclinate lontano dall'animale per evitare danni agli organi interni.
3. Usando pinze per tessuti interni e forbici per dissezione interna, pizzicare l'intestino e sollevarli lontano dalla parete addominale. Mentre si solleva l'intestino, tagliare la parte inferiore dell'intestino libero dal corpo al duodeno prossimale e al colon distale per ottenere l'accesso allo spazio retroperitoneale contenente i reni.
4. Una volta che i reni sono esposti, estrarli individualmente. Pizzicare delicatamente e sollevare l'estremità distale dell'uretere (~ 4 mm di distanza dal rene) con una pinza tissutale. Usando le forbici di dissezione, tagliare sotto l'uretere pizzicato verso il rene. Continuare a tagliare sotto il rene fino a quando non è stato liberato dal tessuto connettivo circostante.
   NOTA: Per massimizzare l'integrità del tessuto e la consistenza del taglio durante il sezionamento del vibratoma, il rene deve essere il più integro possibile. Per garantire questo, evitare di pizzicare o tagliare il rene con pinza e forbici di dissezione.
5. Posizionare il rene con l'uretere attaccato in una soluzione di KRB ghiacciata. Ripetere i passaggi 5.4 e 5.5 con il rene controlaterale. Mantenere i reni in soluzione di KRB sul ghiaccio.
   NOTA: Procedere immediatamente alla sezione successiva del protocollo per preservare la vitalità tissutale PKJ. A causa della sua posizione anatomica in profondità nel parenchima renale, il PKJ è privato del contatto con la soluzione di KRB.

6. Preparare il rene per il sezionamento del vibratoma

1. Trasferire il rene in una parabola di dissezione rivestita in elastomero di silicio (60 mm x 15 mm) e riempirlo con una soluzione di KRB ghiacciata fino a quando il rene non è completamente sommerso.
2. Sotto un microscopio sezionante, ancorare il rene alla base del piatto inserendo perni minuziali nell'uretere prossimale e attraverso la sottile capsula renale anteriore o il tessuto adiposo circostante.
   NOTA: Fare attenzione a non perforare il tessuto del parenchima renale.
3. Utilizzare forbici a molla fine e pinza interna per rimuovere il tessuto adiposo dalla base del rene per esporre la RP distale e l'uretere prossimale.
4. Rimuovere l'uretere prossimale e una parte della RP distale dalla base di RP usando forbici a molla fine.
   NOTA: Fare attenzione a non tagliare il parenchima renale circostante. La linea tratteggiata nera nella Figura 1A indica la posizione approssimativa di questo taglio. Questo taglio crea una base piatta sul rene per un sezionamento del tessuto più uniforme. Quando si seziona il rene, si deve essere consapevoli della posizione anatomica della regione PKJ. La Figura 1B mostra che il rene intatto può essere tagliato lungo un piano sagittale per esporre il midollo, la papilla (midollo distale in cui convergono i dotti di raccolta) e la RP prossimale e distale. Se la papilla dovesse essere esposta completamente, come nella Figura 1C, è possibile visualizzare il PKJ e il RP prossimale (prox RP). Tuttavia, questo non dovrebbe essere fatto per la tecnica del vibratoma; questa descrizione è per orientare il lettore alla posizione PKJ in generale, enfatizzata nella differenza anatomica mostrata nelle immagini di luce trasmessa della regione PKJ e della regione mid-RP in Figura 1D,E.
5. Forare la capsula renale esterna con una pinna a punta fine, allontanando le punte dal corpo renale. Usando una pinza con ogni mano, pizzicare le estremità sciolte della capsula e sbucciarle. Continuare a staccare la membrana della capsula renale rimanente fino a quando non viene rimossa completamente.
   NOTA: La capsula renale è uno strato duro e fibroso che circonda il rene. Deve essere rimosso prima del sezionamento del vibratome per un taglio ottimale.

7. Preparare e calibrare lo strumento vibratome

1. Inserire una lama di rasoio nel supporto della lama dello strumento vibratome e regolare l'angolo di gioco della lama a ~ 18 °.
   NOTA: come passaggio opzionale per il sezionamento di qualità superiore, è necessario utilizzare un blocco di calibrazione (fornito con alcuni strumenti a vibrame) per regolare la posizione della lama per ogni nuova lama utilizzata in base alle istruzioni del produttore. Ciò garantirà un posizionamento ottimale della lama e ridurrà al minimo le vibrazioni verticali.
2. Regolare la velocità di avanzamento della lama a 0,2 mm/s, la vibrazione orizzontale/sheering della lama ad un'ampiezza di 2,00 mm e la dimensione Z-step della lama a ~100-150 μm. Assicurarsi che lo spessore della sezione renale non superi i 150 μm in quanto ciò avrà un impatto negativo sugli esperimenti di imaging Ca²⁺ (perché la parete PKJ spesso rotola e si piega su se stessa se è troppo spessa).
   NOTA: l'utente deve mettere a punto questi parametri di taglio perché le impostazioni variano tra i singoli preparati renali e gli strumenti a vibratomo. La messa a punto deve avvenire durante il sezionamento quando l'utente può ispezionare visivamente le sezioni al microscopio, come descritto nel passaggio 7.2.
3. Installare un bagno di ghiaccio e un vassoio tampone sullo strumento vibratome. Riempire il bagno di ghiaccio con ghiaccio tritato e riempire l'area dello stadio interno con una soluzione di KRB ghiacciata (riempire a circa mezzo pieno). Durante il sezionamento del vibratoma, monitorare e sostituire il ghiaccio frantumato che si è sciolto.

8. Vibratome che seziona il rene

1. Utilizzare piniche smussate per afferrare e rimuovere delicatamente il rene preparato dalla soluzione di KRB ghiacciata. Posizionare immediatamente il rene su carta assorbente per ~ 2-4 s per rimuovere l'umidità esterna in eccesso. Arrotolare delicatamente il rene sulla carta assorbente per assicurarsi che tutti i lati del parenchima si siano asciugati in modo che vi sia un'adesione ottimale del rene allo stadio del vibratoma.
   NOTA: Poiché l'RP si trova all'interno del rene e quindi protetto dal parenchima esterno, questo breve periodo di essiccazione non sarebbe dannoso per l'integrità dei tessuti.
2. Applicare immediatamente un sottile strato di colla cianoacrilata (~ 1 cm²) alla base della piastra del campione di vibratome e utilizzare una pinza smussata per posizionare il rene, l'uretere lato verso il basso, sull'area coperta di colla. Applicare delicatamente una pressione verso il basso sulla parte superiore del rene con il bordo piatto della pincipe per circa 10-20 s per asciugare la colla.
   NOTA: Per stabilizzare il rene durante questa procedura, utilizzare un paio di pinze aggiuntive per mantenere il rene in posizione verticale mentre la colla si asciuga. È fondamentale che il rene aderisca alla piastra del campione in posizione verticale in modo che le sezioni vengano tagliate dritte. Per assicurarsi che il rene abbia aderito con successo alla piastra del campione, spingere delicatamente il lato del rene. Se il rene ha aderito con successo alla piastra, la base del rene deve rimanere fissata alla piastra.
3. Fissare saldamente la piastra del campione sul fondo del vassoio tampone. Regolare il livello della soluzione di KRB in modo che la parte superiore del rene sia completamente immersa. Durante le fasi di sezionamento, quando la lama del vibratome si sposta più in profondità nel vassoio tampone, rimuovere la soluzione KRB in modo che il supporto della lama non si immerga nella soluzione.
   NOTA: Se la colla non si è completamente asciugata prima di procedere con questo passaggio, la colla si sposterà spesso dalla base al parenchima renale. Questa colla in eccesso renderà il sezionamento più variabile. Se ciò accade, rimuovere il rene dalla piastra e procedere con una preparazione renale fresca.
4. Per il sezionamento automatico del vibratome, selezionare le posizioni iniziale e finale del ciclo di taglio della lama del vibratome. Verificare che queste posizioni siano a ~ 0,5-1 cm di disae dal rene per garantire che con ogni avanzamento della lama, l'intero piano renale sia sezionato.
5. Preparare una piastra a più pozzetti (24 o 48 pozzetti) riempiendo i pozzetti con soluzione KRB e posizionando la piastra sul ghiaccio.
   NOTA: una volta generate, le singole sezioni devono essere posizionate in pozzi separati per tenere traccia della profondità della sezione.
6. Avviare il processo di taglio automatico. Durante il passaggio iniziale della lama, assicurarsi che la lama sia in contatto con la parte superiore del rene. Se il contatto non viene effettuato, regolare la posizione Z iniziale della lama.
7. Usando la pinacova, raccogli le sezioni che vengono liberate dal rene. Trasferire immediatamente le sezioni nei singoli pozzi e annotare la profondità Z delle sezioni per misurare la posizione approssimativa di PKJ all'interno delle sezioni renali.
   NOTA: a seconda dei parametri di taglio, alcune sezioni potrebbero non essere tagliate libere dal blocco renale. Se ciò si verifica, utilizzare con attenzione le forbici a molla fine per tagliare sezioni dal blocco renale. Gli utenti sono inoltre incoraggiati a visualizzare attivamente le sezioni al microscopio ottico mentre fluttuano liberamente nei singoli pozzeggi per garantire impostazioni di taglio ottimali e posizione dei tessuti. Le sezioni contenenti il PKJ saranno tipicamente derivate ~ 1000-1500 μm dalla parte superiore del rene.
8. Continuare il protocollo di sezionamento fino a quando le regioni PKJ diventano più evidenti. Fare riferimento alla sezione dei risultati rappresentativi per la descrizione delle regioni PKJ come procedono di sezionamento.
9. A questo punto, ottimizzare i parametri di sezionamento per garantire che le sezioni siano liberate dal blocco renale in modo uniforme e siano intatte. Inoltre, assicurarsi che le regioni PKJ siano continue e ininterrotte perché le pareti PKJ rotte non consentiranno un'immagine adeguata delle cellule all'interno della parete a causa del collasso. Se le pareti si rompono, diminuire la velocità di sezionamento e aumentare lo spessore della sezione e continuare a osservare le sezioni al microscopio ottico per mettere a punto i parametri di taglio.
10. Conservare le sezioni a 4°C in soluzione KRB fino all'inizio della sperimentazione.

9. Acquisizione di immagini della fetta di rene Ca²⁺

1. Trasferire una singola fetta di rene su una parabola di imaging rivestita in elastomero di silicio (35 mm x 10 mm) e riempire immediatamente il piatto con una soluzione KRB fresca e ghiacciata.
2. Inserire perni minuziosi intorno alla periferia di una fetta di rene per fissare la sezione alla base del piatto di imaging.
   NOTA: questo passaggio è fondamentale per evitare che la sezione si muova quando le soluzioni fisiologiche vengono perfuse sulla fetta durante l'imaging.
3. Posizionare la parabola di imaging sul palco di un microscopio confocale a disco rotante verticale e iniziare immediatamente a perfusare con la soluzione KRB.
   NOTA: In questo protocollo è stato utilizzato un microscopio verticale dotato di un'unità scanner confocale a disco rotante Nipkow ad alta velocità.
4. Mantenere la velocità di perfusione a 3 mL/min e la temperatura della soluzione KRB a 36 ± 1 °C. Prima dell'imaging, lasciare che la fetta si equilibra per 1 ora.
5. Selezionare il cubo di imaging dicroico e i laser appropriati. Acquisisci immagini con un dispositivo ad accoppiamento di carica a moltiplicazione di elettroni (EMCCD) o una telecamera scientifica complementare metallo-ossido-semiconduttore.
   NOTA: Il sistema confocale in questo protocollo è dotato di un laser a 488 nm per eccitare GCaMP6f o GCaMP3. Le immagini sono state acquisite utilizzando una fotocamera EMCCD da 512 pixel x 512 pixel.
6. Utilizzare un obiettivo a basso ingrandimento e immersione in acqua (4x o 10x) per individuare la fetta di rene. Centrare il campo di imaging sulle aree della fetta in cui è presente il PKJ. Identificare i punti di riferimento, come illustrato nella Figura 2D, per individuare il PKJ (cioè semicerchi di tessuti muscolari sospesi tra tessuto parenchimale).
7. Una volta individuato il PKJ, utilizzare un obiettivo ad immersione in acqua a ingrandimento più elevato (20x, 40x o 60x) per ingrandire l'area di interesse.
   NOTA: in questo protocollo, l'apertura numerica obiettivo 20x (NA) era 1.0, l'obiettivo 40x NA era 0.8 e l'obiettivo 60x NA era 1.0.
8. Distinguere diverse cellule di interesse nella parete PKJ utilizzando topi transgenici che esprimono GCaMP6f o GCaMP3 in cellule PDGFRα⁺ o SMC, rispettivamente. Osservare i diversi tipi di durate transitorie di Ca²⁺ nelle cellule PDGFRα⁺ nella parete PKJ in PDGFRα⁺ GCaMP6f⁺ fette di rene (Figura 3C, vedere risultati rappresentativi per la descrizione) e in GCaMP3⁺ SMC in SMC GCaMP3⁺ fette di rene (Figura 3D, vedere risultati rappresentativi per la descrizione).
9. Una volta identificate le celle di interesse nella parete PKJ, regolare l'intensità del laser per ottenere un buon rapporto segnale-rumore. Registra immagini a una frequenza di campionamento temporale compresa tra 16 Hz e 32 Hz utilizzando un software di acquisizione appropriato.
   NOTA: a seconda dell'intensità del laser utilizzata durante l'imaging, si consiglia di limitare il numero di registrazioni a causa degli effetti di sbiancamento sui fluorofori Ca^2+. L'utente deve scegliere la durata della registrazione in base agli obiettivi sperimentali specifici.

10. Analisi di imaging Ca²⁺

1. Eseguire^l'analisi di imaging Ca 2+ di diversi tipi di cellule nelle regioni del pacemaker PKJ mediante mappatura spaziotemporale come precedentemente descritto per altri preparati pacemaker intatti nel tratto gastrointestinale^29,30.

Risultati

L'imaging Ca²⁺ in situ del PKJ può rivelare un'importante attività cellulare delle cellule pacemaker RP. Utilizzando topi che esprimono indicatori Ca²⁺ geneticamente codificati (come GCaMP), guidati da promotori specifici delle cellule, è possibile ottenere informazioni sul pacemaking RP con precisione e dettagli che non sono possibili da esperimenti di imaging Ca²⁺ da preparazioni RP a foglio piatto. L'inizio del PKJ si distingue per l'improvvisa comparsa di semicerchi di muscoli sospesi tra il tessuto parenchimale renale (Figura 2C; PKJ prossimale racchiuso in una scatola tratteggiata). Durante i successivi cicli di sezionamento, il midollo interno diventa distinguibile dal tessuto corticale circostante. Al microscopio ottico, il midollo interno appare striato in regioni, di colore più chiaro rispetto al tessuto corticale e discontinuo sul suo asse lungo con il resto del rene (Figura 2B,D). A questo punto, inizieranno ad apparire più regioni PKJ. Esempi di questo sono mostrati nella Figura 2D (rettangoli tratteggiati, H e G) dove 3 semicerchi di muscoli sono sospesi dal tessuto parenchimale. Queste bande muscolari saranno strettamente apposte alla papilla interna e in genere si avvicinano a un'arteriola renale (Figura 2D, rettangoli tratteggiati; Figura 2F-H, punte di freccia nere). Man mano che vengono derivate più sezioni distali, queste bande di muscoli si integreranno per formare una struttura più completa e unificata, indicando la fine della regione PKJ (Figura 2E).
La Figura 3A,B mostra una sezione PKJ a bassa potenza (4-10x) da un mouse che esprime GCaMP in celle PDGFRα⁺ (GCaMP6f espressa da Cre-ricombinasi inducibile guidata da Pdgfra). Utilizzando punti di riferimento come l'arteriola renale (Figura 3A; asterisco ), gli sperimentatori dovrebbero essere in grado di distinguere facilmente la sottile parete PKJ sospesa tra il tessuto parenchimale (Figura 3B; asterischi). L'espressione di GCaMP6f in questo specifico tessuto transgenico è diffusa su tutta la larghezza del PKJ, attraverso entrambi gli strati muscolari e avventiziali (Figura 3C).

Nelle fette di rene PDGFRα⁺ GCaMP6f^+, una rete di cellule che si estende tipicamente sulla larghezza della parete PKJ sarà fluorescente (Figura 3C) e mostrerà transitori Oscillanti Ca^{2 +} di varie durate e frequenze. Le celle PDGFRα⁺ nella parete PKJ mostrano due diversi tipi di durate transitorie di Ca^2+. Nello strato avventiziale (orientato più vicino alla corteccia), le cellule PDGFRα⁺ presenti come una rete di cellule e i loro processi sono definiti. Le cellule AVVENTIZIALI PDGFRα⁺ presentano transitori Ca²⁺ a bassa frequenza (4 ± 2,7 Hz) e di lunga durata (1 ± 0,67 s). Il secondo strato di cellule PDGFRα^+, presente nello strato muscolare (orientato più vicino al midollo), presenta frequenze e durate transitorie Ca²⁺ simili a cellule SMC GCaMP3⁺ (descritte di seguito) in quanto sono dello stesso tipo di cellula.

Nelle fette di rene SMC GCaMP3^+, uno strato di cellule GCaMP3⁺ è presente nello strato muscolare (Figura 3D). Non ci sarà alcun segnale fluorescente nello strato avventiziale (Figura 3D; asterisco). GCaMP3⁺ SMC nello strato muscolare presenta tipicamente transienti Ca²⁺ ad alta frequenza (10 ± 4 Hz) e di breve durata (632 ± 74 s). Le cellule PDGFRα⁺ situate nell'avventizia PKJ suscitano transitori Ca²⁺ a lunga durata e bassa frequenza (Figura 3E, Video 1). Tuttavia, gli esperimenti di imaging Ca²⁺ da GCaMP3 che esprimono tessuto guidati dal promotore Myh11 sono limitati all'aspetto muscolare del PKJ (Figura 3D). Rispetto alle cellule PDGFRα⁺ nell'avventizia, le SMC hanno sparato transienti Ca²⁺ di durata più breve più frequentemente (Figura 3F, Video 2).

Oltre a comprendere le proprietà di segnalazione nei circuiti integrati PKJ PDGFRα^+, l'applicazione di questa tecnica per studiare altri tipi di cellule nel rene sezionato dal vibratome è stata dimostrata in questo articolo. Dopo un attento esame del midollo renale (nei topi che esprimono GCaMP6f nelle cellule PDGFRα^+), è stata osservata una serie di segnali fluorescenti Ca²⁺ all'interno e intorno ai dotti di raccolta (Video 3). Cellule midollari PDGFRα⁺ hanno sparato transitori spontanei di Ca²⁺ di frequenza e durata variabili. Questi studi di imaging Ca²⁺ di sezioni di vibratome renale potrebbero anche essere estesi allo studio delle arteriole renali (~ 50-80 mm di diametro) che spesso si trovano vicino ai segmenti muscolari PKJ(Figura 2F,G; frecce bianche). L'imaging Ca²⁺ delle arteriole renali (dal tessuto che esprime GCaMP nelle cellule muscolari lisce) dimostra transitori oscillanti di Ca²⁺ nelle SMC (Video 4).

Figura 1: Anatomia renale di base e posizione della regione del pacemaker PKJ. (A) Diagramma del rene intatto che mostra l'orientamento della RP e dell'uretere. L'arteria renale e la vena renale sono visualizzate rispettivamente in rosso e blu. (B)Il rene intatto può essere tagliato lungo un piano sagittale per esporre l'aspetto interno del rene, compreso il midollo, la papilla (midollo distale in cui convergono i dotti di raccolta) e la RP prossimale e distale. (C) Il midollo e la papilla possono essere asportati per esporre completamente il PKJ e il prox RP. (D ed E) rappresentano le immagini luminose trasmesse dalla regione del pacemaker PKJ e dalla RP distale, rispettivamente. Il sezionamento sequenziale verso l'estremità distale del bacino provoca i semicerchi del muscolo nella regione PKJ (Di) che si combinano in un unico anello muscolare più spesso (Ei) che incapsula l'intera papilla. I rettangoli neri tratteggiati in Di e Ei mostrano aree approssimative nelle sezioni renali coronali in cui sono state acquisite immagini luminose trasmesse. L'orientamento delle immagini D ed E è di 90° in senso antiorario rispetto ai rispettivi inserti (Di ed Ei). Barre di scala in D ed E = 20 μm. Abbreviazioni: RP = bacino renale; prox RP = bacino renale prossimale; PKJ = giunzione pelvico-renale; PIC = cellule interstiziali alfa-positive del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine; SMC = cellula muscolare liscia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Sezionamento del vibratome di interi reni per generare sezioni sottili. (A) I reni sono montati sull'uretere lateralmente verso la base dello strumento vibratome e una lama standard (attaccata alla testa del vibratoma) viene utilizzata per tagliare sezioni sequenziali dall'estremità prossimale a quella distale del rene. (B) Rappresentazione diagrammatica di una sezione sottile tagliata dall'intero rene con punti di riferimento annotati. I segmenti muscolari PKJ (rettangolo tratteggiato nero) si trovano spesso sospesi tra il tessuto parenchimale. (C) Immagine microscopica leggera di una sezione renale prossimale. La comparsa di bande muscolari sospese tra il tessuto parenchimale indica l'inizio delle proiezioni PKJ prossimali (indicate all'interno del rettangolo tratteggiato bianco). (D) Immagine microscopica leggera che rappresenta la regione ottimale in cui si possono trovare più segmenti (2-3) PKJ (aree all'interno di rettangoli tratteggiati bianchi). Sottili strisce muscolari PKJ sono sospese tra il parenchima renale e si allineano strettamente con le arteriole renali e il midollo. (E) Immagine microscopica leggera di una sezione renale distale. I singoli segmenti muscolari si sono fusi per formare un'unica fascia muscolare continua (rettangolo tratteggiato bianco) che circonda la papilla interna (non presente in questa immagine). Le barre della scala C-E = 500 μm. F-H Le regioni ingrandite (20x) del pannello D indicano la posizione delle PKJ (punte di freccia nere), delle arteriole renali (punte di freccia bianche) e dei siti di taglio per isolare il PKJ (linee bianche tratteggiate). Barre di scala F-H = 100 μm. Abbreviazione: PKJ = giunzione pelvico-renale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Imaging Ca²⁺ di sezioni di vibratomo. (A) Immagine rappresentativa a bassa potenza (4x) di una sezione di vibratoma che denota la posizione dell'arteriola renale (asterisco). Barra della scala = 200 μm. (B) Immagine rappresentativa ingrandita (20x) del PKJ (etichettato) sospeso tra tessuto parenchimale renale che denota posizioni del muscolo PKJ (punta di freccia bianca), arteriola renale (asterisco). Barra di scala = 50 μm. (C) Immagine ad alta potenza (40x) del PKJ che esprime GCaMP in celle PDGFRα^+. Barra di scala = 20 μm. (D) Immagine ad alta potenza (20x) del PKJ che esprime GCaMP nelle cellule muscolari lisce. Barra di scala = 20 μm. (E) Mappa spaziotemporale di Transitori di Ca²⁺ campionati da una cella GCaMP⁺ PDGFRα⁺ indicata nel pannello C. Cerca la tabella codificata per F/F₀. (F) Mappa spaziotemporale dei transienti di Ca²⁺ campionati da una cella GCaMP⁺ PDGFRα⁺ indicata nel pannello D. Cerca la tabella codificata per F/F₀. (G) Dati rappresentativi per la frequenza transitoria Ca²⁺ (Hz) per le cellule GCaMP⁺ PDGFRα⁺ e le celle GCaMP⁺ smMHC. (H) Dati rappresentativi per Ca²⁺ durata transitoria (s) per cellule GCaMP⁺ PDGFRα⁺ e cellule GCaMP⁺ smMHC. Abbreviazioni: PKJ = giunzione pelvico-renale; PDGFRα⁺ = recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine-alfa-positivo; smMHC = catena pesante della miosina muscolare liscia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: Transitori spontanei di Ca²⁺ in GCaMP⁺ PDGFRα⁺ cellule in sezioni di vibratoma PKJ. Abbreviazioni: PKJ = giunzione pelvico-renale; PDGFRα⁺ = recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine-alfa-positivo. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video 2: Transitori spontanei di Ca²⁺ in GCaMP⁺ cellule muscolari lisce in sezioni di vibrame della giunzione pelvico-renale. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video 3: Transitori spontanei di Ca²⁺ in cellule GCaMP⁺ PDGFRα⁺ in sezioni di vibratoma midollare renale. Abbreviazione: PDGFRα⁺ = recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine-alfa-positivo. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Video 4: Attività transitoria Ca²⁺ a bassa ampiezza nelle sezioni vibrame dell'arteriola renale. Clicca qui per vedere questo video. (Fare clic con il pulsante destro del mouse per scaricare.)

Discussione

La RP è costituita da una popolazione eterogenea di cellule con densità cellulari differenziali osservate in varie regioni RP. I PIC1 (precedentemente denominati ASMC) sono più abbondanti nel PKJ, dove l'attività del pacemaker ha origine²⁴. Il protocollo, qui descritto, consente agli investigatori di isolare la regione del pacemaker dal resto del rene del topo. Tagliando sezioni di PKJ usando un vibratoma, le regioni pacemaker della RP (identificate come bande muscolari attaccate al parenchima) vengono mantenute intatte, consentendo così l'uso dell'imaging in situ per studiare con precisione le cellule del pacemaker RP quando combinate con i reporter di fluorescenza specifici della cellula.

Mentre questo approccio può fornire nuove informazioni sul pacemaking RP, ci sono alcune considerazioni con cui gli sperimentatori dovrebbero avere familiarità per migliorare i risultati di imaging e l'efficienza del sezionamento. Per un utente non addestrato, questo metodo di isolamento e imaging PKJ è più facile da imparare rispetto alla tipica dissezione acuta dei preparati RP a foglio piatto. La dissezione acuta di RP da interi reni richiede settimane di pratica costante per isolare con successo i tessuti vitali per gli esperimenti di fisiologia. Poiché questo protocollo di sezionamento del vibratoma richiede poche conoscenze di dissezione acuta, è accessibile agli utenti che non hanno esperienza nella dissezione di altre strutture muscolari lisce.

Tuttavia, ci sono alcuni punti critici da notare per questo protocollo. Aderire con successo i reni alla piastra del campione di vibratoma richiede destrezza e pazienza. Se il rene è orientato in modo errato e si inclina su un lato, verranno tagliate sezioni oblique piuttosto che diritte. A causa della natura delicata del PKJ, l'angolo obliquo può spesso distruggere le bande muscolari della regione del pacemaker. Inoltre, l'imaging di sezioni oblique si traduce in una scarsa acquisizione di immagini poiché le reti cellulari non sono tipicamente sullo stesso piano focale. La procedura richiede anche molto tempo, con il sezionamento di un singolo rene che spesso richiede fino a un'ora per essere completato, durante il quale l'installazione richiede il monitoraggio.

Mentre il movimento del vibratoma può essere accelerato, se la velocità viene aumentata troppo (>20% rispetto a quanto raccomandato nel protocollo), la lama si sminuzzerà piuttosto che tagliare in modo pulito il rene, con conseguente perdita di delicate strutture PKJ. Allo stesso modo, una velocità di taglio troppo bassa può causare la frastagliata della sezione. L'ottimizzazione della velocità di taglio e dell'ampiezza della lama è essenziale. Bisogna fare attenzione anche nella manipolazione delle sezioni di vibratome. A causa della loro natura delicata, i muscoli PKJ sono facilmente interrotti durante la manipolazione e possono lacerarsi. Un utente ben addestrato sarà in grado di raccogliere circa 1-2 regioni PKJ per 4 fette di rene che sono adatte per esperimenti di imaging Ca^2+. In genere, le sezioni PKJ che non soddisfano i criteri di imaging Ca²⁺ hanno: 1) scarsa espressione GCaMP, 2) una parete PKJ contorta o 3) una parete PKJ rotta. Per l'analisi dei dati, è stato possibile campionare circa 3-4 celle per campo visivo (FOV).

Mentre ci sono molte cellule nel FOV delle sezioni PDGFRα-GCaMP6f e SMC-GCaMP3 PKJ, i piccoli movimenti tissutali spesso escludono le cellule dall'analisi. Questo di solito può essere risolto applicando un protocollo di stabilizzazione alle immagini. In condizioni in cui i preparati non si muovono, almeno 3-5 cellule possono essere campionate da sezioni PDGFRα-GCaMP6f e 5-6 celle da sezioni SMC-GCaMP3. In genere, il tempo impiegato dal sacrificio animale (l'età ottimale per i topi è di 8-16 settimane) all'esecuzione di esperimenti di imaging Ca²⁺ è di 2-3 ore, che è adeguato per garantire l'integrità dei tessuti, se i tessuti vengono incubati in soluzioni ghiacciate durante la procedura quando necessario. In sintesi, qui è stato descritto un protocollo di taglio del vibratomo per generare preparati intatti di regioni RP PKJ dal rene del topo. Questa tecnica consente la conservazione delle regioni del pacemaker RP per studi di imaging Ca²⁺ in situ per studiare i meccanismi del pacemaker RP.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di coltura a 24 pozzetti	ThermoFisher Scientific	142485	Per conservare fette di rene in
piastre di Petri da 35 mm x 10 mm	Sigma Aldrich	CLS430165	Piastra per imaging del calcio con fette di rene
coltura a 48 pozzetti	ThermoFisher Scientific	152640	Per conservare fette di rene in
una piastra di Petri da 60 mm x 15 mm	Sigma Aldrich	P5481	Piastra per dissezione affilata del rene
Carta assorbente	Fisher Scientific	06-666A	Per asciugare il rene prima di applicare la colla
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Il laboratorio Jackson	13148	GCaMP3 Topi
B6; 129S-GT(ROSA)26Sor/J	Il laboratorio Jackson	24105	GCaMP6f Topi
B6. FVB-Tg(Myh11-cre/ERT2)1Soff/J	The Jackson Laboratory	19079	smMHC-CRE Topi
C57BL/6-Tg(Pdgfra-cre)1Clc/J	The Jackson Laboratory	13148	PDGFRa-CRE Topi Colla
cianoacrilica	Amazon	B001PILFVY	Per far aderire il rene alla piastra del campione
Etanolo	Phamco-Aaper	SDA 2B-6	Per la dissezione
Forbici Bonn extra-fini	Fine Science Tools	14083-08	Utilizzato per forbici da dissezione interna
Forbici fini Fine	Science Tools	14060-09	Utilizzato per forbici da dissezione esterne
Pinze a punta fine	Fine Science Tools	11254-20	Utilizzato per la dissezione fine del rene
Gillette Lame a doppio taglio blu argento	Amazon	B009XHQGYO	Per l'inserimento nel portalama del vibratomo
ImageJ	NIH		Per l'analisi dell'imaging del calcio
Isoflurano	Baxter	NDC 1001936060	Per anestesia
Perni minuziosi	Fisher Scientific	NC9677548	I perni sono stati tagliati a metà per ridurne la lunghezza
Elastomero siliconico	Fisher Scientific	NC9285739	Sylgard 184
Student Adson Forcipe	Strumenti	per la scienza fine91106-12	Per tenere e muovere delicatamente il rene
Studente Dumont Pinze	Strumenti per le scienze fini	91150-20	Utilizzato per le pinze da dissezione interna
Forbici a molla Vannas	Strumenti per le scienze fini	15000-03	Per la dissezione nitida e la pulizia del rene isolato
Vibrocheck	Leica	14048142075	Componente opzionale per la calibrazione del movimento della lama durante il taglio
VT1200 S Microtomo a lama vibrante	Leica	14912000001	Configurazione 1 viene utilizzato nel nostro protocollo