Il presente articolo descrive un protocollo passo-passo per elettroantennogrammi di successo e a basso rumore in diversi generi di zanzare, comprese sia femmine che maschi.
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Articolo metodologico
Una guida passo-passo all'elettroantennography delle zanzare
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le zanzare femmine sono gli animali più letali sulla terra, rivendicando la vita di oltre 1 milione di persone ogni anno a causa di agenti patogeni che trasmettono quando acquisiscono un pasto di sangue. Per individuare un ospite di cui nutrirsi, le zanzare si affidano a una vasta gamma di segnali sensoriali, tra cui visivi, meccanici, termici e olfattivi. Lo studio descrive una tecnica, l'elettroantennography (EAG), che consente ai ricercatori di valutare se le zanzare possono rilevare singole sostanze chimiche e miscele di sostanze chimiche in modo dipendente dalla concentrazione. Se accoppiata con la gascromatografia (GC-EAG), questa tecnica consente di esporre le antenne a uno spazio di testa completo / miscela complessa e determina quali sostanze chimiche presenti nel campione di interesse, la zanzara può rilevare. Questo è applicabile agli odori del corpo ospite, nonché ai bouquet floreali delle piante o ad altri odori ecologicamente rilevanti (ad esempio, odori dei siti di ovideposizione). Qui, abbiamo descritto un protocollo che consente lunghe durate di tempo di risposta alla preparazione ed è applicabile sia alle zanzare femmine che ai maschi di più generi, tra cui le zanzare Aedes, Culex, Anopheles e Toxorhynchites . Poiché l'olfatto gioca un ruolo importante nelle interazioni zanzara-ospite e nella biologia delle zanzare in generale, EAG e GC-EAG possono rivelare composti di interesse per lo sviluppo di nuove strategie di controllo dei vettori di malattia (ad esempio, esche). Integrato con saggi comportamentali, è possibile determinare la valenza (ad esempio, attrattivo, repellente) di ciascuna sostanza chimica.
Introduzione
Le zanzare sono gli organismi più letali sulla terra, reclamano la vita di oltre un milione di persone all'anno e mettono più della metà della popolazione mondiale a rischio di esposizione agli agenti patogeni che trasmettono, mentre mordono1. Questi insetti si basano su una vasta gamma di segnali (termici, visivi, meccanici, olfattivi, uditivi) per individuare un ospite di cui nutrirsi (sia vegetale che animale), per l'accoppiamento e l'ovideposizione, nonché per evitare i predatori sia allo stadio larvale che a quello adulto 2,3. Tra questi sensi, l'olfatto gioca un ruolo critico nei ....
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Protocollo
1. Preparazione della soluzione salina
- Preparare la soluzione salina in anticipo e conservare in frigorifero.
- Seguire Beyenbach e Masia26 per preparare la soluzione.
NOTA: Ricetta salina in mM: 150,0 NaCl, 25,0 HEPES, 5,0 glucosio, 3,4 KCl, 1,8 NaHCO3, 1,7 CaCl 2 e 1,0 MgCl2. Il pH è regolato a 7,1 con 1 M NaOH. Non aggiungere glucosio o saccarosio alla preparazione in questo momento per aumentare la conservazione a scaffale. Aggiungere la quantità necessaria alla soluzione salina subito prima di eseguire gli EAG (circa 50 ml per esperimento).
2. Preparazion....
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Risultati
L'elettroantennography è un potente strumento per determinare se una sostanza chimica o una miscela di sostanze chimiche viene rilevata da un'antenna di insetti. Può anche essere utilizzato per determinare la soglia di rilevazione per una data sostanza chimica utilizzando un aumento graduale della concentrazione (cioè la risposta della curva di dose, Figura 4B). Inoltre, è utile testare gli effetti del repellente sulla risposta agli odori legati all'ospite29.
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Discussione
I comportamenti mediati dall'olfatto sono influenzati da molti fattori, tra cui fisiologici (ad esempio, età, ora del giorno) e ambientali (ad esempio, temperatura, umidità relativa)30. Pertanto, quando si eseguono EAG, è essenziale utilizzare insetti che si trovano nello stesso stato fisiologico (ad esempio, monitoraggio dell'età, fame, accoppiamento)31 e mantenere anche un ambiente caldo e umido intorno alla preparazione per evitare l'essiccazione. Una temperatura intorno.......
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Dichiarazioni
L'autore non ha nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Sono grato al Dr. Clément Vinauger e al Dr. Jeffrey Riffell per le utili discussioni. I seguenti reagenti sono stati ottenuti tramite BEI Resources, NIAID, NIH: Anopheles stephensi, Ceppo STE2, MRA-128, contributo di Mark Q. Benedict; Aedes aegypti, Strain ROCK, MRA-734, contributo di David W. Severson; Culex quinquefasciatus, Ceppo JHB, Uova, NR-43025. L'autore ringrazia il Dr. Jake Tu, il Dr. Nisha Duggal, il Dr. James Weger e Jeffrey Marano per aver fornito uova di zanzara Culex quinquefasciatus e Anopheles stephensi (ceppo: Liston). Aedes albopictus e Toxorhynchites rutilus septentrionalis derivano da ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Tavolo d'aria Banco pulito | TMC | https://www.techmfg.com/products/labtables/cleanbench63series/accessoriess | Riduttore di rumore |
| Scheda analogico-digitale | National Instruments | BNC-2090A | |
| Flowbuddy da banco completo | Genesee Scientific | 59-122BC | Per anestetizzare le zanzare |
| Capillare in vetro borosillicato | Strumento | SutterB100-78-10 | Per effettuare la registrazione e i riferimenti capillari |
| Prodotti chimici | Sigma Aldrich | Benzaldeide: 418099-100 mL; Acido butirrico: B103500-100 ml; 1-esanolo: 471402-100 ml; Olio minerale: M8410-1L | Sostanze chimiche utilizzate per gli esperimenti qui presentati |
| CO2 | Airgas o Praxair | N/A | Per anestetizzare le zanzare |
| Sorgente di luce fredda | Volpi | NCL-150 | |
| Siringhe monouso | BD | 1 mL (309628) / 3 mL (309657)Cavi | |
| per elettrodi | World Precision Instruments | 5371 | |
| Gel per elettrodi senza sale | Parkerlabs | 12-08-Spectra-360 | |
| Gabbia di Faraday | TMC | https://www.techmfg.com/products/electric-and-magnetic-field-cancellation/faradaycages | Riduttore di rumore |
| Flussimetri | Bel-art | 65 mm (H40406-0010) / 150 mm (H40407-0075) | Uno di ogni |
| fiale e tappi GCMS | Thermo-fisher scientific | 2-SVWKA8-CPK | Per preparare diluizioni odorizzanti |
| Siringhe di vetro (Fortuna) | Sigma Aldrich | Z314307 | Per l'erogazione degli odori alla preparazione EAG |
| Humbug | Quest Scientific | http://www.quest-sci.com/ | Riduttore di rumore |
| 2 mm Jack Holder, stretto, 90 gradi, con filo | A-M Systems | 675748 | Portaelettrodo |
| Basi magnetiche | Kanetec | MB-FX | x 2 |
| MATLAB + Toolboxes | Mathworks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | Per l'erogazione degli impulsi |
| Aria medicale | Airgas o Praxair | N/A | Per la principale compagnia aerea |
| Microscopio | Micromanipolatori Nikkon | SMZ-800N | |
| Micromanipolatore compatto a tre assi grossolano/fine | Narishige | MHW-3 | x 2 |
| Amplificatore per microelettrodi con headstage | A-M Systems | Modello 1800 | |
| Forniture per l'allevamento delle zanzare | Bioquip | ||
| BD | 25G (305127) / 21G (305165) | ||
| Pipette Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-6A | Per l'erogazione degli odori alla preparazione EAG |
| Tubi in PTFE di diversi diametri | Mc Master Carr | N/A | Per collegare l'elettrovalvola, flussometro, linea aerea ecc. |
| Alimentatore 30V/5A DC | Dr. Meter | PS-305DM | |
| R versione 3.5.1 | R progetto | https://www.r-project.org/ | Per analisi dati |
| Relè per elettrovalvola | N/A | Filo | |
| 0.01" | A-M Systems | 782500 | |
| Elettrovalvola (a 3 vie) | The Lee Company | LHDA0533115H | |
| Software WinEDR | Software di elettrofisiologia Strathclyde | WinEDR V3.9.1 | Per la registrazione EAG |
| Carta Whatman | Cole Parmer | UX-06648-03 | Per caricare la sostanza chimica in una siringa di vetro / pipetta Pasteur |
Riferimenti
- World Health Organization. World health statistics 2019: monitoring health for the SDGs, sustainable development goals. World Health Organization. , Geneva. (2019).
- Takken, W. The role of olfaction in host-seeking of mosquitoes....
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Ristampe e permessi
