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Articolo metodologico

Un saggio rapido di preferenza alimentare in Drosophila

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DOI:

10.3791/62051

⸱

11 febbraio 2021

 , 
1Monell Chemical Senses Center, 2Department of Physiology, The Diabetes Research Center, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per un saggio di alimentazione a due scelte per le mosche. Questo test di alimentazione è veloce e facile da eseguire ed è adatto non solo per la ricerca di laboratorio su piccola scala, ma anche per schermi comportamentali ad alta produttività nelle mosche.

Abstract

Per selezionare alimenti con valore nutrizionale evitando il consumo di agenti nocivi, gli animali hanno bisogno di un sistema di gusto sofisticato e robusto per valutare il loro ambiente alimentare. La mosca della frutta, Drosophila melanogaster, è un organismo modello geneticamente trattabile che è ampiamente utilizzato per decifrare le basi molecolari, cellulari e neurali della preferenza alimentare. Per analizzare le preferenze del cibo a mosca, è necessario un metodo di alimentazione robusto. Descritto qui è un test di alimentazione a due scelte, rigoroso, economico e veloce. Il saggio è a base di piastra di Petri e prevede l'aggiunta di due diversi alimenti integrati con colorante blu o rosso alle due metà del piatto. Quindi, ~ 70 prestarved, mosche di 2-4 giorni vengono poste nel piatto e autorizzate a scegliere tra cibi blu e rossi al buio per circa 90 minuti. L'esame dell'addome di ogni mosca è seguito dal calcolo dell'indice di preferenza. A differenza delle piastre multiwell, ogni piastra di Petri impiega solo ~ 20 s per riempire e consente di risparmiare tempo e fatica. Questo saggio di alimentazione può essere impiegato per determinare rapidamente se alle mosche piace o non piace un particolare cibo.

Introduzione

Nonostante le drammatiche differenze nella struttura anatomica degli organi del gusto tra mosche e mammiferi, le risposte comportamentali delle mosche a molte sostanze tastant sono sorprendentemente simili a quelle dei mammiferi. Ad esempio, le mosche preferisconolo zucchero 1,2,3,4,5,6,7,8, aminoacidi9,10e sale basso11, che indicano nutrienti, ma rifiutano cibi amari12,13,14,15 che sono sgradevoli o tossici. Negli ultimi due decenni, le mosche si sono dimostrate un organismo modello altamente prezioso per far progredire la comprensione di molte questioni fondamentali relative alla sensazione di gusto e al consumo di cibo, tra cui il rilevamento del tastant, la trasduzione del gusto, la plasticità del gusto e la regolazione dell'alimentazione16,17,18,19,20. Sorprendentemente, una serie di studi hanno dimostrato che i meccanismi di trasduzione del gusto e del circuito neurale alla base della percezione del gusto sono analoghi tra moscerini della frutta e mammiferi. Pertanto, la mosca della frutta funge da organismo sperimentale ideale, consentendo ai ricercatori di scoprire concetti e principi evolutivamente conservati che governano il rilevamento e il consumo di cibo nel regno animale.

Per indagare la sensazione di gusto nelle mosche, è fondamentale stabilire un saggio veloce e rigoroso per misurare oggettivamente la preferenza alimentare. Nel corso degli anni, vari metodi di alimentazione, come i test a base di colorante11,12,13,21,22,23, il saggio di risposta all'estensione della proboscide di mosca24,il test Di alimentazione capillare (CAFE)25, 25,26, il test Fly Liquid-Food Interaction Counter (FLIC)27e altri metodi combinatori sono stati sviluppati per misurare quantitativamente la preferenza alimentare e / o l'assunzione di cibo per imoscerini della frutta 28,29,30,31. Uno dei paradigmi di alimentazione popolari è il saggio di alimentazione a due scelte a base di colorante utilizzando una piastra di microtitoro multiwell12,21,32 o, come descritto qui, una piccola piastra di Petri11,22 come camera di alimentazione. Questo saggio è progettato in base alla trasparenza dell'addome della mosca. Durante questo saggio, le mosche vengono poste nella camera di alimentazione e presentate con due opzioni di cibo mescolate con colorante rosso o colorante blu. Una volta completato il test, gli addome di mosca appaiono rossi o blu a seconda del cibo che hanno consumato.

Sia la piastra di Petri che i test di alimentazione a base di colorante multiwell-plate sono altamente robusti e producono approssimativamente gli stessi risultati. Utilizzando questi due saggi, sono state fatte numerose importanti scoperte e scoperte verso la decifrazione dei recettori e delle cellule altamente diversificati responsabili del rilevamento dei gusti alimentari e della consistenza delcibo 11,12,21,22,32,33. Nel saggio a base di colorante, una fase sperimentale che richiede molto tempo e sforzi è la preparazione e il caricamento del cibo nella camera di alimentazione. Per ridurre il tempo di preparazione e caricamento degli alimenti, questo saggio è stato modificato sostituendo la piastra del microtitolo multiwell con una piccola piastra di Petri, che è divisa in due compartimenti uguali. Nel saggio a base di piastra di Petri, due diversi alimenti integrati con colorante blu o rosso vengono aggiunti alle due metà del piatto. Quindi, ~ 70 prestarved, mosche di 2-4 giorni vengono poste nel piatto e autorizzate a scegliere tra cibi blu e rossi al buio per circa 90 minuti. Viene quindi esaminato l'addome di ogni mosca e viene calcolato l'indice di preferenza (PI).

Questo test di alimentazione a due scelte basato su piastre di Petri è conveniente, semplice e veloce. Un piatto multiwell richiede circa 110 s per riempire, mentre ogni piastra di Petri richiede solo ~ 20 s. Inoltre, la piastra multiwell richiede la pipettazione di piccoli volumi di cibo in un gran numero di piccoli pozzi (ad esempio, 60 o più pozzi per piastra), il che richiede notevole precisione e attenzione. Al contrario, il saggio a base di piastra di Petri richiede solo due azioni per piatto. Poiché il saggio di alimentazione può coinvolgere un gran numero di repliche, il saggio a base di piastra di Petri consente di risparmiare una quantità non contributiva di tempo e fatica. Questo saggio dà risultati equivalenti a quelli del saggio multiwell-based e si è dimostrato efficace nell'affrontare molte domande fondamentali nella sensazione di gusto, tra cui la codifica del gusto delsale 11,la plasticità del gustomodificata dall'esperienza alimentare 22e la base molecolare della sensazione di consistenza delcibo 33. In sintesi, questo saggio a due scelte basato su piastra di Petri è un potente strumento per indagare come le mosche percepiscono l'ambiente nutritivo esterno e interno per suscitare un comportamento di alimentazione appropriato.

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Protocollo

1. Assemblaggio delle camere di dosaggio

NOTA: Mentre questo protocollo descrive l'uso di una piastra di Petri da 35 mm (Figura 1A), l'effetto desiderato può essere ottenuto utilizzando qualsiasi vaso a tenuta stagna e a fondo liscio che può essere diviso in due e coperto.

  1. In primo luogo, bisect una piastra di Petri lidded 35 mm fissando una lunghezza di plastica (5 mm di larghezza e 3 mm di altezza) lungo la linea mediana con adesivo impermeabile, formando due compartimenti stagnati. Verificare che il sigillo sia completo per evitare perdite che possono portare alla miscelazione dei due substrati alimentari.
    NOTA: Dopo il montaggio, riutilizzare questo apparecchio finché la guarnizione regge.

2. Preparare fiale di fame

  1. Preparare un numero sufficiente di flaconcini di plastica vuoti; quindi, compattare liberamente un pezzo di carta velina nella parte inferiore. Comprimere la carta velina abbastanza da riempire lo spazio, ma non tanto da mentere una massa densa.
    NOTA: Assicurarsi che non ci siano fessure profonde o pieghe nel tessuto, in quanto ciò può portare le mosche a rimanere intrappolate.
  2. Aggiungere ~3 mL di acqua pura al flaconcino in modo che il tessuto sia completamente saturo, ma non c'è acqua stagnante. Assicurarsi che non ci siano grandi goccioline di acqua in eccesso sulla parete del flaconcino. In alternativa, sostituire l'agarrose con la carta imbevuta preparando una soluzione di agar 1% w/v (senza saccarosio) aggiungendo 5 mL di agarrose all'1% ad ogni flaconcino vuoto e consentendo all'agarosio di solidificarsi a temperatura ambiente.

3. Fame umida delle mosche prima dell'esperimento

  1. Inizia la fame 24 ore prima del momento dell'esperimento. Sotto l'anestesia di CO2, gruppi di ~ 70, 2-4 giorni volano nelle fiale di fame preparate, etichettando ogni fiala con il genotipo e il tempo di fame.

4. Configurazione dei reagenti

  1. Preparazione di coloranti
    NOTA: Prima di eseguire qualsiasi esperimento, è importante eseguire un test di controllo preliminare per determinare le corrette concentrazioni di coloranti rossi e blu da utilizzare.
    1. Per il test di controllo, preparare una gamma di diluizioni per ogni colorante ed eseguire il test di alimentazione con lo stesso cibo con un colore di colorante diverso. Utilizzare i risultati per identificare concentrazioni a due coloranti (una rossa, una blu) che producono un PI di ~0 quando non viene aggiunto alcun composto sperimentale (vedere sezione 7).
      NOTA: Ad esempio, la concentrazione finale di colorante blu è stata fissata a 50 μM e testata contro una serie di concentrazioni di coloranti rossi. Sulla base della curva di dosaggio del colorante rosso, la concentrazione ottimale di colorante rosso è stata di 210 μM, che ha dato una distorsione minima del colorante (Figura 1B). Una maggiore concentrazione di coloranti rossi spinge le mosche a preferire il cibo rosso, mentre una concentrazione inferiore spinge le mosche a preferire il cibo blu. Affinare con cura le concentrazioni di coloranti blu o rossi in incrementi di 1 μM, poiché differenze di questa grandezza e maggiore possono influenzare i risultati sperimentali.
  2. Preparazione dell'1% di agarosio
    1. Unire 0,5 g di agarosio e 50 mL di acqua pura (o alcuni multipli di essi) in un recipiente sicuro per le microonde. Microonde la soluzione di agarosio fino allo scioglimento, mescolandolo secondo necessità.
  3. Preparazione di altri componenti alimentari
    1. Sciogliere ogni componente alimentare, compreso il saccarosio e gli eventuali composti sperimentali, in acqua a una concentrazione di 100 volte o superiore della concentrazione finale testata.
      NOTA: Il volume totale di ogni ingrediente alimentare aggiunto all'1% di agar non deve superare 1 mL per agar fuso da 10 mL. Altrimenti, l'agarosio potrebbe essere troppo diluito e non si solidificherà in modo appropriato.
  4. Preparazione di mezzi alimentari
    1. Mescolare l'agar, il colorante e il composto sperimentale desiderato in tubi conici di centrifuga in polipropilene (15 o 50 mL); utilizzare acqua al posto del tastante sperimentale nel cibo di controllo. Fallo mentre l'agar è ancora completamente liquido e mescola accuratamente utilizzando un miscelatore a vortice. Conservare i tubi in un bagno d'acqua a 60 °C mentre non sono in uso per evitare che l'agarosio si indurisca prima di essere distribuito nei piatti.
  5. Preparare i piatti per l'esperimento
    NOTA: Assicurarsi che tutti i piatti siano completamente asciutti prima di iniziare.
    1. Pipetta 1 mL di mezzo alimentare sperimentale rosso in un lato del piatto di dosaggio (Figura 1A); ripetere per il numero desiderato di piatti. Lasciare raffreddare l'agarosio fino a quando non è sodo (3-5 minuti), quindi pipettare 1 mL di cibo di controllo blu nell'altro lato deipiatti (Figura 1A). Ripetere questo processo con la coppia controllo rosso/blu sperimentale.
      NOTA: Assicurarsi che tutti i piatti siano completamente impostati prima di iniziare l'esperimento. Utilizzare i piatti entro 30 minuti.

5. Avvio del saggio di alimentazione a due

  1. Paralizzare temporaneamente le linee di volo sperimentali sul ghiaccio fino a quando non si osservano ovvie attività motorie come il volo e l'arrampicata. Una volta immobilizzate le mosche, invertire delicatamente il flaconcino e toccare per trasferire tutte le mosche nella camera di dosaggio.
    NOTA: Lo shock freddo richiede ~ 3-5 minuti. L'esposizione prolungata al freddo può influire sulla fisiologia e sulla salute della mosca e deve quindi essere evitata.
  2. Posizionare rapidamente il coperchio sulla camera e rlo da parte. Una volta trasferite tutte le mosche, spostare tutte le camere in uno spazio buio e chiuso. Lasciare correre il saggio per 90 minuti.
    NOTA: Un ambiente buio riduce al minimo l'influenza del percorso visivo della mosca sul comportamento di alimentazione e rimuove eventuali segnali ambientali dall'esterno del piatto.

6. Terminare il saggio di alimentazione a doppio senso

  1. Trascorso 90 minuti, trasferire le camere in un congelatore a -20 °C per sacrificare le mosche. Dopo ~1 h, conta le mosche.
    NOTA: Invertire ogni piastra di Petri prima di mettere la piastra nel congelatore per assicurarsi che nessuna mosca venga congelata sul cibo.

7. Assegnazione di un indice di preferenza (PI) per determinare le preferenze alimentari

  1. Al microscopio a dissezione standard, esaminare il colore addominale delle mosche in ogni singolo piatto. Contare le mosche come rosse, blu o viola in base al colore dell'addome (Figura 2A). Contare la mosca se il suo addome è più del 50% colorato, indicando un'alimentazione robusta (Figura 2B). Escludere la mosca se il suo addome contiene solo un piccolo punto di cibo, indicando un cattivo consumo (Figura 2C).
  2. Dopo aver contato il numero di mosche che mangiano cibi blu, rossi o sia blu che rossi, usa la seguente equazione per assegnare a ogni piatto di Petri un indice di preferenza (PI):

PI = (Numero di mosche che mangiano cibo sperimentale) - (Numero di mosche che mangiano cibo di controllo) / (Numero di mosche che mangiano cibo sperimentale) + (Numero di mosche che mangiano cibo di controllo) + (Numero di mosche che mangiano entrambe)

PI > 0 indica una preferenza per il composto sperimentale, PI < 0 indica un'avversione al composto sperimentale e PI = 0 non indica alcun effetto del composto sul comportamento di alimentazione.

8. Pulizia delle camere di dosaggio

  1. Pulire prontamente le piastre di Petri raschiando il substrato alimentare e risciacquandole con acqua e sapone inescensati. Immergere i piatti di Petri durante la notte in acqua distillata. Controllare che il sigillo divisore in ogni piatto sia ancora a tenuta stagna, quindi lasciare asciugare l'aria del piatto.
    NOTA: Dopo aver fatto in modo che non vi siano agarose o coloranti residui, le piastre di Petri sono pronte per l'uso di nuovo.

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Risultati

In questo saggio, un piatto da 35 mm è stato diviso in due compartimenti di alimentazione uguali, con ciascuna metà del piatto contenente cibo di agarosio accoppiato con colorante blu orosso (figura 1A). Per escludere la distorsione del colorante, le concentrazioni di coloranti blu e rossi sono state accuratamente perfezionate per produrre un PI approssimativo "0" quando sono stati aggiunti solo questi due coloranti(figura 1B). Una volta che la piastra di Petri ...

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Discussione

Questo metodo prevede diversi passaggi cruciali in cui possono verificarsi problemi. In primo luogo, assicurarsi che le mosche ingeriscono una quantità sufficiente di cibo per fornire dati stabili. Se le mosche mangiano male, assicurarsi che le mosche siano state bagnate per almeno 24 ore e che il supporto sperimentale contenga almeno una concentrazione minima di saccarosio (2 mM). Per stimolare ulteriormente il consumo di cibo, prolungare il periodo di fame umida oltre le 24 ore, a seconda delle condizioni fisiologiche ...

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Dichiarazioni

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse o interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Tingwei Mi per averli aiutati a ottimizzare il test di alimentazione a due scelte. Vorrebbero anche ringraziare Samuel Chan e Wyatt Koolmees per i loro commenti sul manoscritto. Questo progetto è stato finanziato dai National Institutes of Health grants R03 DC014787 (Y.V.Z.) e R01 DC018592 (Y.V.Z.) e dalla Ambrose Monell Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra di Petri da 35 mmFisher Scientific08-772E
AgarosioThomas ScientificC756P56
Adesivo trasparenteFisher ScientificNC9884114
Provette da centrifuga conicheFisher Scientific05-527-90
Microscopio da dissezioneAmscopeSM-2T-6WB-V331
FCF Brilliant BlueWako Chemical3844-45-9
Fly CO2 configurazione per anestesiaGenesee Scientfic59-114/54-104M
Incubatrice per mosche con ciclo giorno/notte programmabilePowers Scientific Inc.IS33SD
Fly lines
Piatto in vetro (adatto al microonde)
KimwipesFisher Scientific06-666A
Flacone per supportiFisherScientific 50-192-9998
Divisorio in plastica tagliato per adattarsi al piatto da un foglio di spessore non superiore a 5 mm
Fialeper mosche in plasticaGenesee Scientific32-116
SaccarosioMillipore SigmaS9378
Sulforhodamine BMillipore SigmaS9012
Composto di interesse
vorticeBenchmark ScientificBV1000
BagnomariaFisher ScientificFSGPD05
Tastant Miscelatore a

Riferimenti

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