Forniamo un protocollo passo-passo per la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero del nodo senoatriale (SAN) e del nodo atrioventricolare (AVN) nei cuori murini.
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Articolo metodologico
Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Il segnale elettrico fisiologicamente generato dalle cellule pacemaker nel nodo senoatriale (SAN) viene condotto attraverso il sistema di conduzione, che include il nodo atrioventricolare (AVN), per consentire l'eccitazione e la contrazione di tutto il cuore. Qualsiasi disfunzione di SAN o AVN provoca aritmie, indicando il loro ruolo fondamentale nell'elettrofisiologia e nell'aritmogenesi. I modelli murini sono ampiamente utilizzati nella ricerca sull'aritmia, ma l'indagine specifica su SAN e AVN rimane impegnativa.
Il SAN si trova alla giunzione della crista terminalis con la vena cava superiore e l'AVN si trova all'apice del triangolo di Koch, formato dall'orifizio del seno coronarico, dall'anulus tricuspide e dal tendine di Todaro. Tuttavia, a causa delle dimensioni ridotte, la visualizzazione mediante istologia convenzionale rimane impegnativa e non consente lo studio di SAN e AVN all'interno del loro ambiente 3D.
Qui descriviamo un approccio di immunofluorescenza a montaggio intero che consente la visualizzazione locale di SAN e AVN di topo marcati. La colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero è destinata a sezioni più piccole di tessuto senza la necessità di sezionamento manuale. A tale scopo, il cuore del topo viene sezionato, con tessuto indesiderato rimosso, seguito da fissazione, permeabilizzazione e blocco. Le cellule del sistema di conduzione all'interno di SAN e AVN vengono quindi colorate con un anticorpo anti-HCN4. La microscopia a scansione laser confocale e l'elaborazione delle immagini consentono la differenziazione tra cellule linfonodali e cardiomiociti funzionanti e di localizzare chiaramente SAN e AVN. Inoltre, ulteriori anticorpi possono essere combinati per marcare anche altri tipi di cellule, come le fibre nervose.
Rispetto all'immunoistologia convenzionale, la colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero preserva l'integrità anatomica del sistema di conduzione cardiaca, consentendo così l'indagine dell'AVN; soprattutto nella loro anatomia e nelle interazioni con le cellule del miocardio e non miociti circostanti.
Introduzione
Le aritmie sono malattie comuni che colpiscono milioni di persone e sono la causa di una significativa morbilità e mortalità in tutto il mondo. Nonostante gli enormi progressi nel trattamento e nella prevenzione, come lo sviluppo di pacemaker cardiaci, il trattamento delle aritmie rimane impegnativo, principalmente a causa delle conoscenze molto limitate sui meccanismi della malattia sottostante 1,2,3. Una migliore comprensione sia dell'elettrofisiologia normale che della fisiopatologia delle aritmie può aiutare a sviluppare strategie di trattamento nuove, innovative e causal....
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Protocollo
La cura degli animali e tutte le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del comitato per la cura e l'etica degli animali dell'Università di Monaco e tutte le procedure intraprese sui topi sono state approvate dal governo della Baviera, Monaco, Germania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). I topi C57BL6/J sono stati acquistati dal Jackson Laboratory.
NOTA: la Figura 1 mostra gli strumenti necessari per l'esperimento. La figura 2 mostra un'illustrazione dell'anatomia cardiaca ....
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Risultati
Utilizzando il protocollo sopra descritto, è possibile eseguire in modo affidabile l'imaging al microscopio confocale di SAN e AVN. La colorazione specifica del sistema di conduzione utilizzando anticorpi fluorescenti mirati a HCN4 e la colorazione del miocardio funzionante utilizzando anticorpi fluorescenti mirati a Cx43 consente la chiara identificazione di SAN (Figura 5, Video 1) e AVN (Figura 6, Video 2) all'.......
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Discussione
L'anatomia cardiaca è stata tradizionalmente studiata utilizzando sezioni istologiche sottili11. Tuttavia, questi metodi non preservano la struttura tridimensionale del sistema di conduzione e, quindi, forniscono solo informazioni 2D. Il protocollo di colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero qui descritto consente di superare queste limitazioni e può essere utilizzato di routine per l'imaging SAN e AVN.
Rispetto ai metodi standard come l'immunoistochimica c.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal China Scholarship Council (CSC, a R. Xia), dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), dalla Fondazione Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), dall'SFB 914 (progetto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold e S. Massberg e progetto A10 a C. Schulz), dall'ERA-NET sulle malattie cardiovascolari (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) e dalla Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella preparazione dei manoscritti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anesthesia | |||
| Sistema di vaporizzazione dell'isoflurano | Hugo Sachs Elektronik | 34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910 | Include una camera di induzione, un'unità di evacuazione del gas e filtri al carbone |
| Circuito Bain modificato | Hugo Sachs Elektronik | 73-4860 | Include una maschera per anestesia per topi |
| Piattaforma chirurgica | Kent Scientific | SURGI-M | |
| In vivo strumentazione | |||
| Pinze fini | Strumenti per le scienze fini | 11295-51 | |
| Forbici per iride Strumenti per | scienze fini | 14084-08 | |
| Forbici a molla Strumenti per | le scienze fini 91500-09 | ||
| Pinze per tessuti Strumenti per | le scienze fini | 11051-10 | |
| Perni per tessuti | Strumenti per le scienze fini | 26007-01 | Potrebbe usare aghi da 27G come sostituto |
| Strumenti generali da laboratorio | |||
| Agitatore orbitale | Sunlab | D-8040 | |
| Agitatore magnetico | IKA | Pipetta di base | |
| , volume 10 & micro; L, 100 & micro; L, 1000 & micro; L | Eppendorf | Z683884-1EA | |
| Microscopi Microscopio | |||
| stereo-zoom per dissezione | VWR | 10836-004 | |
| Microscopio confocale a scansione laser | Zeiss | LSM 800 | |
| Software | |||
| Imaris 8.4.2 | Strumenti | ||
| ZEN 2.3 SP1 nero | Zeiss | ||
| General Lab Material | |||
| 0,2 µ m siringa filtro | Sartorius | 17597 | |
| 100 mm piastra di Petri | Falcon | 351029 | |
| 27G ago | BD Microlancia 3 | 300635 | |
| 50 ml Polipropilene conico Tubo | Falcon | 352070 | |
| Siringa 5ml | Braun | 4606108V | |
| Vetrini coprioggetti | Thermo Scientific | 7632160 | |
| Eppendorf Tubi | Eppendorf | 30121872 | |
| Chemicals | |||
| 0.5 M EDTA | Sigma | 20-158 | Componenti della |
| soluzione di formaldeide TEA 16% | Thermo Scientific | 28908 | utilizzare come soluzione al 4% |
| Acido acetico | Merck | 100063 | Componenti di TEA |
| Agarosio | Biozym | 850070 | |
| Siero bovino Albumina Sigma | A2153-100G | ||
| DPBS (1X) Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Gibco | 14190-094 | |
| Siero di capra normale | Sigma | NS02L | |
| Saccarosio | Sigma | S1888-1kg | |
| Tris-base | Roche | TRIS-RO | Componenti di TEA |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-250ml | Diluito all'1% in PBS |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ml | |
| Drugs | |||
| Fentanyl 0.5 mg/10 mL | Braun Melsungen | ||
| Isoflurano 1 mL/mL | Cp-pharma | 31303 | |
| Ossigeno 5 L | Linde | 2020175 | Include un regolatore di pressione |
| Anticorpi | |||
| Capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling Technology | #4412 | diluito a 1:200 |
| IgG anti-ratto di capra Alexa Fluor 647 | Invitrogen | #A-21247 | diluito a 1:200 |
| Hoechst 33342, tricloridrato, triidrato (DAPI) | Invitrogen | H3570 | diluito a 1:1000 |
| Rabbit Anti-Connexin-43 | Sigma | C6219 | diluito a 1:200 |
| Rat anti-HCN4 (SHG 1E5) | Invitrogen | MA3-903 | diluito a 1:200 |
| Other | |||
| Plexiglass Anello | |||
| Cernit | plastilina | 49655005 | |
| Silikonpasten, Baysilone | VWR | 291-1220 | |
| Animals | |||
| Mouse, C57BL/6 | Il laboratorio |
Riferimenti
- Clauss, S., et al. Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals. Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).
- Clauss, S., et al. Characte....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse
Posted by JoVE Editors on 2/21/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3
Julia Vlcek1,2
Julia Bauer1,2,3
Stefan Kääb1,3
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2
Dominic Adam van den Heuvel1,2
Christian Schulz1,2,3
Steffen Massberg1,2,3
Sebastian Clauss1,2,3
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
