Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Sommario

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Abstract

Il muscolo scheletrico ha una notevole capacità di rigenerarsi dopo una lesione, che è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato. A seguito di lesioni, la cellula staminale muscolare viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. In molte condizioni di deperimento muscolare, tra cui la distrofia muscolare e l'invecchiamento, questo processo è compromesso con conseguente incapacità del muscolo di rigenerarsi. Il processo di rigenerazione muscolare nel pesce zebra è altamente conservato con sistemi di mammiferi che forniscono un eccellente sistema per studiare la funzione e la rigenerazione delle cellule staminali muscolari, in condizioni di deperimento muscolare come la distrofia muscolare. Qui, presentiamo un metodo per esaminare la rigenerazione muscolare nei modelli di zebrafish di malattia muscolare. Il primo passo prevede l'utilizzo di una piattaforma di genotipizzazione che permette la determinazione del genotipo delle larve prima di suscitare una lesione. Dopo aver determinato il genotipo, il muscolo viene ferito usando una pugnalata con ago, a seguito della quale viene utilizzata la microscopia a luce polarizzante per determinare l'entità della rigenerazione muscolare. Forniamo quindi una pipeline ad alta produttività che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli zebrafish di malattia muscolare.

Introduzione

Il muscolo scheletrico rappresenta il 30-50% della massa corporea umana e non è solo indispensabile per la locomozione, ma funge anche da organo metabolico e di stoccaggio critico¹. Nonostante sia postmitotico, il muscolo scheletrico è altamente dinamico e mantiene un'enorme capacità rigenerativa dopo l'infortunio. Ciò è attribuito alla presenza di cellule staminali residenti nei tessuti (chiamate anche cellule satelliti), situate sotto la lamina basale delle miofibre e contrassegnate dai fattori di trascrizione accoppiati box protein 7 (pax7) e / o paired box protein 3 (pax3), tra gli altri^....

Protocollo

La manutenzione del pesce zebra è stata effettuata secondo le procedure operative standard approvate dal Comitato etico degli animali dell'Università di Monash con licenza di colonia riproduttiva ERM14481.

1. Determinazione del genotipo degli embrioni vivi utilizzando una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni.

1. Anestetizzare 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) embrioni di zebrafish aggiungendo tricaina metanosolfonato ad una concentrazione finale dello 0,016% (v/v) in terreno embrionale (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl_2,0,33 mM MgSO₄ in acqua). Attendere 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano....

Risultati

La capacità di quantificare la birifrangenza del muscolo scheletrico fornisce un metodo non invasivo ma altamente riproducibile per esaminare e confrontare i livelli di danno muscolare ed esaminare la rigenerazione muscolare in vivo. La birifrangenza deriva dalla diffrazione della luce polarizzata attraverso l'array pseudo-cristallino dei sarcomeri muscolari¹⁵e, a seguito di lesioni o danni al muscolo, è evidente una riduzione della birifrangenza. Allo ste.......

Discussione

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato, la cui funzione è alterata in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, ostacolando successivamente il processo di rigenerazione muscolare. Qui, descriviamo un protocollo ad alto rendimento per esaminare la rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish vivi di malattia muscolare. Il primo passo della pipeline utilizza una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni¹⁴,.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre a 24 pozzetti	Thermo Fischer	142475
aghi calibro 30	Terumo	NN-3013R
Piastre di Petri da 90 mm	Prodotti di laboratorio Pacific Chip PT	S9014S20
per l'estrazione del DNA	chip		ZEG
Fluidx Piattaforma di genotipizzazione degli embrioni	con	unità base Fluidx ZEG	Genotyper di embrioni di pesce zebra
Pipetta in vetro	Hirschmann	9260101
Piatto in vetro	WPI	FD35-100	Comunemente indicato come FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Pipetta in plastica	Livingstone	PTP03-01
Microscopio polarizzatore	Abrio	N/A

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