Descriviamo l'ingegneria di una nuova T7 RNA polimerasi legata al DNA per regolare le reazioni di trascrizione in vitro. Discutiamo i passaggi per la sintesi e la caratterizzazione proteica, convalidiamo la regolazione trascrizionale proof-of-concept e discutiamo le sue applicazioni nel calcolo molecolare, nella diagnostica e nell'elaborazione delle informazioni molecolari.
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Articolo metodologico
RNA polimerasi legata al DNA per la trascrizione in vitro programmabile e il calcolo molecolare
In questo articolo
Sommario
Abstract
La nanotecnologia del DNA consente l'autoassemblaggio programmabile degli acidi nucleici in forme e dinamiche prescritte dall'utente per diverse applicazioni. Questo lavoro dimostra che i concetti della nanotecnologia del DNA possono essere utilizzati per programmare l'attività enzimatica della T7 RNA polimerasi derivata dai fagi (RNAP) e costruire reti di regolazione genica sintetica scalabili. In primo luogo, un RNAP T7 legato all'oligonucleotide viene ingegnerizzato tramite l'espressione di un RNAP con tag SNAP N-terminale e il successivo accoppiamento chimico del tag SNAP con un oligonucleotide modificato con benzilguanina (BG). Successivamente, lo spostamento del filamento di acido nucleico viene utilizzato per programmare la trascrizione della polimerasi su richiesta. Inoltre, gli assemblaggi di acidi nucleici ausiliari possono essere utilizzati come "fattori di trascrizione artificiale" per regolare le interazioni tra l'RNAP T7 programmato dal DNA con i suoi modelli di DNA. Questo meccanismo di regolazione della trascrizione in vitro può implementare una varietà di comportamenti circuitali come la logica digitale, il feedback, la cascata e il multiplexing. La componibilità di questa architettura di regolazione genica facilita l'astrazione, la standardizzazione e il ridimensionamento del design. Queste caratteristiche consentiranno la prototipazione rapida di dispositivi genetici in vitro per applicazioni quali il biorilevamento, il rilevamento di malattie e l'archiviazione dei dati.
Introduzione
Il calcolo del DNA utilizza un insieme di oligonucleotidi progettati come mezzo per il calcolo. Questi oligonucleotidi sono programmati con sequenze per assemblarsi dinamicamente secondo la logica specificata dall'utente e rispondere a specifici input di acido nucleico. Negli studi proof-of-concept, l'output del calcolo consiste tipicamente in un insieme di oligonucleotidi marcati fluorescentemente che possono essere rilevati tramite elettroforesi su gel o lettori di piastre di fluorescenza. Negli ultimi 30 anni sono stati dimostrati circuiti computazionali del DNA sempre più complessi, come varie cascate di logica digitale, reti di reazioni chimiche e reti neurali
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Protocollo
1. Preparazione del buffer
NOTA: la preparazione del tampone di purificazione delle proteine può avvenire in qualsiasi giorno; qui, è stato fatto prima di iniziare gli esperimenti.
- Preparare un tampone di lisi/equilibrazione contenente 50 mM di tris (idrossimetil)amminometano (Tris), 300 mM di cloruro di sodio (NaCl), 5% di glicerolo e 5 mM di β-mercaptoetanolo (BME), pH 8. Aggiungere 1,5 mL di 1M Tris, 1,8 mL di 5M NaCl, 1,5 mL di glicerolo, 25,2 mL di acqua deionizzata (ddH2O) in un tubo centrifugo da 50 mL e aggiungere 10,5 μL di 14,2 M BME appena prima dell'uso.
NOTA: Tris può causare tossicità acuta; quindi, evi....
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Risultati
Figura 5: Analisi SDS-PAGE dell'espressione di SNAP T7 RNAP e test di trascrizione in vitro. (A) Analisi di purificazione della proteina SNAP T7 RNAP, peso molecolare SNAP T7 RNAP: 119.4kDa. FT = flusso dalla colonna, W1 = frazioni di eluizione del tampone di lavaggio contenente impurità, E1-3 = frazioni di eluizione contenenti prodotto purif.......
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Discussione
Questo studio dimostra un approccio ispirato alla nanotecnologia del DNA per controllare l'attività della T7 RNA polimerasi accoppiando covalentemente un RNAP T7 ricombinante N-terminale con tag SNAP con un oligonucleotide funzionalizzato BG, che è stato successivamente utilizzato per programmare reazioni TMDSD. In base alla progettazione, lo SNAP-tag è stato posizionato al N-terminus della polimerasi, poiché il C-terminus del wild-type T7 RNAP è sepolto all'interno del nucleo della struttura proteica e stabilisce import.......
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Dichiarazioni
Non ci sono interessi finanziari concorrenti da dichiarare da parte di nessuno degli autori.
Ringraziamenti
L.Y.T.C riconosce il generoso sostegno del New Frontiers in Research Fund-Exploration (NFRF-E), del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grant e della Medicine by Design Initiative dell'Università di Toronto, che riceve finanziamenti dal Canada First Research Excellence Fund (CFREF).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5% polisorbato 20 (TWEEN 20) | BioShop | TWN510.5 | |
| 0,5M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Bio Basic | SD8135 | |
| 10 mM tampone fosfato di sodio (pH 7) | Bio Basic | PD0435 | Compresse utilizzate per fare 10 mM tampone |
| 10% persolfato di ammonio (APS) | Sigma Aldrich | A3678-100G | |
| 100 kDa Amicon Ultra-15 centrifugo Unità filtrante | Fisher Scientific | UFC910008 | |
| 100% acetone | Fisher Chemical | A18P4 | |
| 100% etanolo (EtOH) | House Brand | 39752-P016-EAAN | |
| 10x tampone per trascrizione in vitro (IVT) | New England Biolabs | B9012 | |
| 10x tampone Tris-Borato-EDTA (TBE) | Bio Basic | A0026 | |
| 1M Isopropil β- d-1-tiogalattopiranoside (IPTG) | Sigma Aldrich | I5502-1G | |
| 1M tampone bicarbonato di sodio | Sigma Aldrich | S6014-500G | |
| 1M Tris(idrossimetil)amminometano (Tris) | Sigma Aldrich | 648311-1KG | |
| 1X tampone Tris-EDTA (TE) | ThermoFisher | 12090015 | |
| 2M imidazolo | Sigma Aldrich | 56750-100G | |
| 2-mercaptoetanolo (BME) | Sigma Aldrich | M3148 | |
| 3M acetato di sodio | Bio Basic | SRB1611 | |
| 40% acrilammide (19:1) | Bio Basic | A00062 | |
| 4x tampone di caricamento del campione di proteine LDS | Fisher Scientific | NP0007 | |
| 5M cloruro di sodio (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
| 5mM ditiotreitolo (DTT) | Sigma Aldrich | 43815-1G | |
| 6x colorante di caricamento gel | New England Biolabs | B7024S | |
| agarosio B polvere | Bio Basic | AB0014 | |
| BG-GLA-NHS | New England Biolabs | S9151S | |
| BL21 competente E. coli | Addgene | C2530H | |
| BLUeye scala proteica prestained | FroggaBio | PM007-0500 | |
| blu bromofenolo | Bio Basic | BDB0001 | |
| blu coomassie (SimplyBlue SafeStain) | Colorante | LC6060 | |
| (colorante gel acido nucleico SYBR Gold) | Colorante | Scientific S11494 | |
| (colorante gel acido nucleico SYBR Safe) | Fisher Scientific | S33102 | |
| solfossido di dimetile secco (DMSO) | Fisher Scientific | D12345 | |
| formammide | Sigma Aldrich | F9037-100ML | |
| glicerolo | Bio Basic | GB0232 | |
| kanamicina solfato | BioShop | KAN201.5 | |
| brodo di lisogenesi | Sigma Aldrich | L2542-500ML | |
| ossalato verde di malachite | Sigma Aldrich | 2437-29-8 | |
| N,N,N'N'-Tetrametiletano-1,2-diammina (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281-25ML | |
| NuPAGE MES SDS tampone di corsa (20x) | Fisher Scientific | LSNP0002 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1,0 mm 12 pozzetti | Life Technologies | NP0322BOX | |
| oligonucleotide (gabbia antisenso) | IDT | N/A | TATAGTGAGTCGTATTAATTTG |
| oligonucleotide ( cage sense) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA |
| oligonucleotide (malachite verde aptamero antisenso) | IDT | N/A | GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT |
| oligonucleotide (malachite verde aptamero senso) | IDT | N/A | TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC |
| oligonucleotide (fattore di trascrizione A) | IDT | N/A | AGTACACCAACTACGAGTGAG |
| oligonucleotide (fattore di trascrizione B) | IDT | N/A | TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG |
| oligonucleotide con 3' Modifica delle ammine (tether) | IDT | N/A | GTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/ |
| Pierce Colonne di spin a forte scambio ionico | Fisher Scientific | 90008 | |
| che codifica per i geni SNAP T7 RNAP e resistenza alla kanamicina | Genscript | N/A | inserto genico personalizzato |
| (colonna di spin HisPur Ni-NTA) | Fisher Scientific | 88226 | |
| rNTP mix | New England Biolabs | N0466S | |
| Roche mini colonna di centrifuga rapida del DNA | Sigma Aldrich | 11814419001 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787-100ML | |
| Scala DNA a gamma ultra bassa | Fisher Scientific | 10597012 | |
| urea | BioShop | URE001.1 |
Riferimenti
- Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
- Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network computation with DNA strand displacement cascades. Nature. 4....
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Ristampe e permessi
