Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.
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Articolo metodologico
Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo
In questo articolo
Sommario
Abstract
I recenti progressi nella ricerca sul cancro hanno illustrato la natura altamente complessa delle metastasi del cancro. È stato scoperto che più geni o reti di geni sono coinvolti nella regolazione differenziale dei geni a cascata metastatica del cancro e dei prodotti genici dipendenti dal tipo di cancro, dal tessuto e dalle caratteristiche individuali del paziente. Questi rappresentano obiettivi potenzialmente importanti per le terapie genetiche e gli approcci di medicina personalizzata. Lo sviluppo di piattaforme di screening rapido è essenziale per l'identificazione di questi bersagli genetici.
La membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è una membrana altamente vascolarizzata e ricca di collagene situata sotto il guscio d'uovo che consente lo scambio di gas nell'embrione in via di sviluppo. A causa della posizione e della vascolarizzazione del CAM, lo abbiamo sviluppato come modello di metastasi del cancro umano intravitale che consente un robusto xenotrapianto delle cellule tumorali umane e l'imaging in tempo reale delle interazioni delle cellule tumorali con la matrice e la vascolarizzazione ricche di collagene.
Utilizzando questo modello, è stata progettata una piattaforma di screening quantitativo per l'identificazione di nuovi driver o soppressori delle metastasi del cancro. Abbiamo trasdotto un pool di cellule tumorali HEp3 della testa e del collo con una libreria completa di geni shRNA del genoma umano, quindi iniettato le cellule, a bassa densità, nella vascolarizzazione CAM. Le cellule proliferarono e formarono colonie di cellule tumorali singole. Le singole colonie che non erano in grado di invadere il tessuto CAM erano visibili come fenotipo di colonia compatta e asportate per l'identificazione dello shRNA trasdotto presente nelle cellule. Le immagini delle singole colonie sono state valutate per la loro invasività. Sono stati eseguiti più cicli di selezioni per ridurre il tasso di falsi positivi. Cloni di cellule tumorali individuali e isolati o cloni di nuova progettazione che esprimono geni di interesse sono stati sottoposti a test di formazione tumorale primaria o analisi di cooptazione vascolare delle cellule tumorali. In sintesi presentiamo una piattaforma di screening rapido che consente l'identificazione del bersaglio anti-metastatico e l'analisi intravitale di una cascata dinamica e complessa di eventi.
Introduzione
Le metastasi sono la principale causa di morte del pazienteoncologico1,2,3. Le cellule tumorali metastatiche utilizzano percorsi di segnalazione distinti, a seconda del tipo di cancro, attraverso le cinque fasi della cascata metastatica: invasione locale, intravaso, sopravvivenza nella circolazione, stravaso ed espansione della colonia in siti metastatici distanti. L'attuale comprensione di questo processo metastatico suggerisce che ci sono due fasi di collo di bottiglia, una è l'invasione direzionale della cellula tumorale dal tumore primario, e la seconda è la creazione del....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i regolamenti e le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Alberta. Gli embrioni aviari non sono considerati animali vivi da molti istituti di ricerca e non sono richiesti protocolli animali. Tuttavia, è opinione accettata che gli embrioni aviari possano provare dolore e, pertanto, debbano essere trattati nel modo più umano possibile. L'autorità locale per la ricerca sugli animali deve essere contattata prima dell'inizio di qualsiasi lavoro di ricerca per garantire che vengano seguite le normative appropriate.
1. Coltura di uova....
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Risultati
L'iniezione di cellule tumorali è considerata di successo se la maggior parte delle cellule che si depositano nei capillari sono singole e situate a una differenza significativa l'una dall'altra (~ 0,05-0,1 cm) in modo che le colonie non si sovrappongano dopo 5-6 giorni di periodo di incubazione (Figura 3A). L'iniezione non ha avuto successo se si può vedere un accumulo di cellule tumorali nella maggior parte dei capillari, gli embrioni che lo mostrano devono.......
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Discussione
Qui descriviamo un protocollo di screening intravitale basato sulla microscopia a fluorescenza rapida che può essere utilizzato per applicazioni importanti come gli screening genetici o dei farmaci candidati. Le cellule tumorali che sono state trasdotte con una libreria genetica di interesse o trasfettate con costrutti di espressione individuale possono essere rapidamente vasate e quantificate in base al fenotipo di interesse utilizzando questo modello CAM di pulcino. Poiché i protocolli di trasduzione o trasfezione vari.......
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Dichiarazioni
Niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione del Canadian Cancer Society Research Institute #702849 a JDL e KS. Il Dr. Lewis detiene la cattedra Frank e Carla Sojonky nella ricerca sul cancro alla prostata supportata dalla Alberta Cancer Foundation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Siringhe monouso da 1 mL | BD | BD309659 | |
| provette da centrifuga coniche da 15 mL. | Corning | CLS430791-500EA | |
| 18 calibro x 1 1/2 Ago di precisione BD | BD BD305196 | utilizziamo 1,2 mm x 40 mm, è possibile utilizzare aghi più corti se si preferisce | |
| Soluzione di tripsina al 2,5% | molte fonti sono disponibili | ||
| 4T1 cancro al seno di topo | ATCC | CRL-2539 | |
| B16F10 linea cellulare di melanoma di topo | ATCC | CRL-6475 | |
| Centrifuga da banco. | sono disponibili | Qualsiasi centrifuga compatibile con TC che può essere utilizzata per centrifugare le celle è adatta | |
| Vetrini coprioggetti circolari, 22 mm. | Fisher Scientific | 12-545-101 | |
| Collagenase | Sigma | C0130-100MG | |
| Microscopio | Nikon A1r | ||
| disponibili | devono essere sterilizzate prima dell'uso | ||
| Terreni di coltura appropriati per le linee cellulari utilizzate | sono disponibili | Coltiviamo linee cellulari HT1080, HEp3 e b16 in DMEM, 10% FBS media | |
| Incubatrice per uova | sono disponibili | Un modello esatto necessario dipende dalla scala dello schermo. Le fonti disponibili sono MGF Company Inc., Savannah, GA, o Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA | |
| eppendor tubi, 1,5 ml | Sigma | T4816-250EA | |
| Uova di livorno bianco fecondato | qualsiasi fornitore | ||
| pinze fini | molte fonti sono disponibili | devono essere sterilizzate prima dell'uso | |
| Emocitometro... | Millipore-Sigma | MDH-4N1-50PK | |
| HT1080 | ATCC | CCL-121 | |
| Software | Utilizziamo Nikon Elements | ||
| Lectina Lens Culinary Agglutinina (LCA) coniugata con fluoresceina o rodamina... | Vector Laboratories | RL-1042, FL-1041 | Diluire il brodo (5 mg/ml) 50-100x a seconda della sensibilità del microscopio. Deve essere di un colore diverso dal colore della linea cellulare utilizzata per lo screening |
| MDA-MB-468 del carcinoma mammario umano | ATCC | HTB-132 | |
| PBS (1x) | sono disponibili molte fonti Piatti | ||
| di pesatura in plastica | Le dimensioni di Simport | CA11006-614 | sono 78x78x25mm; sono disponibili molte altre fonti |
| di forbici chirurgiche piccole | sono disponibili | devono essere sterilizzate prima dell'uso | |
| Tubi capillari in vetro borosilicato di sodio, diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,58 mm, lunghezza 10 cm | Sutter Instrument | BF100-58-10 | |
| Piastre di Petri quadrate (utilizzate come coperchi per le piastre di pesatura). | VWR | CA25378-115 | Le dimensioni sono 100x100x15mm; sono disponibili molte altre fonti |
| Microscopio stereofluorescente | Usiamo tubi da laboratorio Zeiss Lumar v12 | ||
| Tygon R-3603 | Cole-Parmer | AAC00001 | 1/32 di diametro interno, 3/32 di pollice di diametro esterno, 1/32 di pollice di spessore della parete |
| U-118 MG glioblastoma umano | ATCC | HTB-15 | |
| U-87 MG glioblastoma umano | ATCC | HTB-14 | |
| Estrattore verticale per pipette... | molte fonti sono disponibili | , usiamo David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Modello 720 |
Riferimenti
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
- Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
- Eccles, S. A., Welch, D. R.
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Ristampe e permessi
