Articolo metodologico

Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo

DOI:

10.3791/62077

⸱

3 febbraio 2021

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1Department of Oncology, University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada, 2Department of Cell Biology & Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary

In questo articolo

Sommario

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Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.

Abstract

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I recenti progressi nella ricerca sul cancro hanno illustrato la natura altamente complessa delle metastasi del cancro. È stato scoperto che più geni o reti di geni sono coinvolti nella regolazione differenziale dei geni a cascata metastatica del cancro e dei prodotti genici dipendenti dal tipo di cancro, dal tessuto e dalle caratteristiche individuali del paziente. Questi rappresentano obiettivi potenzialmente importanti per le terapie genetiche e gli approcci di medicina personalizzata. Lo sviluppo di piattaforme di screening rapido è essenziale per l'identificazione di questi bersagli genetici.

La membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è una membrana altamente vascolarizzata e ricca di collagene situata sotto il guscio d'uovo che consente lo scambio di gas nell'embrione in via di sviluppo. A causa della posizione e della vascolarizzazione del CAM, lo abbiamo sviluppato come modello di metastasi del cancro umano intravitale che consente un robusto xenotrapianto delle cellule tumorali umane e l'imaging in tempo reale delle interazioni delle cellule tumorali con la matrice e la vascolarizzazione ricche di collagene.

Utilizzando questo modello, è stata progettata una piattaforma di screening quantitativo per l'identificazione di nuovi driver o soppressori delle metastasi del cancro. Abbiamo trasdotto un pool di cellule tumorali HEp3 della testa e del collo con una libreria completa di geni shRNA del genoma umano, quindi iniettato le cellule, a bassa densità, nella vascolarizzazione CAM. Le cellule proliferarono e formarono colonie di cellule tumorali singole. Le singole colonie che non erano in grado di invadere il tessuto CAM erano visibili come fenotipo di colonia compatta e asportate per l'identificazione dello shRNA trasdotto presente nelle cellule. Le immagini delle singole colonie sono state valutate per la loro invasività. Sono stati eseguiti più cicli di selezioni per ridurre il tasso di falsi positivi. Cloni di cellule tumorali individuali e isolati o cloni di nuova progettazione che esprimono geni di interesse sono stati sottoposti a test di formazione tumorale primaria o analisi di cooptazione vascolare delle cellule tumorali. In sintesi presentiamo una piattaforma di screening rapido che consente l'identificazione del bersaglio anti-metastatico e l'analisi intravitale di una cascata dinamica e complessa di eventi.

Introduzione

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Le metastasi sono la principale causa di morte del pazienteoncologico1,2,3. Le cellule tumorali metastatiche utilizzano percorsi di segnalazione distinti, a seconda del tipo di cancro, attraverso le cinque fasi della cascata metastatica: invasione locale, intravaso, sopravvivenza nella circolazione, stravaso ed espansione della colonia in siti metastatici distanti. L'attuale comprensione di questo processo metastatico suggerisce che ci sono due fasi di collo di bottiglia, una è l'invasione direzionale della cellula tumorale dal tumore primario, e la seconda è la creazione della lesione metastatica del sito distante4,5,6. Entrambi i passaggi richiedono alle cellule tumorali di interagire attivamente con il collagene e la vascolarizzazione nei siti di invasione iniziale o formazione di lesioni metastatiche a distanza. Pertanto, le cellule tumorali metastatiche devono essere in grado di attaccarsi alle cellule, rimodellare le fibre di collagene e invadere direzionalmente lungo le paretivascolari 7. I modelli di screening in grado di identificare rapidamente bersagli terapeutici antimetastatici per impedire alle cellule tumorali di completare questi passaggi sono della massima importanza. I modelli di screening in vitro esistenti non imitano completamente il complesso ambiente dei tessuti vivi. I modelli murini sono costosi e richiedono molto tempo. Pertanto, vi è un urgente bisogno di piattaforme di screening intravitale che forniscano ambienti di tessuti vivi complessi e una rapida identificazione dei bersagli.

Nell'ultimo decennio, l'embrione di pollo è stato stabilito come un modello robusto ed economico di metastasi del cancro umano8,9,10,11,12. Il tessuto della membrana corioallantoica del pulcino (CAM) è sottile e traslucido, il che lo rende ideale per l'imaging microscopico intravitale dei comportamenti cellulari e delle colonie nei siti tumorali primari e / o metastatici12. La crescita del tumore primario da più linee cellulari tumorali umane può essere avviata e metastatizzata in un arco di soli diversi giorni dopo la microiniezione nel tessuto CAM. Le cellule tumorali possono essere somministrate nel tessuto CAM in diversi modi, tra cui per via endovenosa, intra-CAM o come collagene onplants, questa flessibilità consente al ricercatore di concentrarsi su fasi specifiche della progressione del cancro, ad esempio la formazione di lesioni metastatiche, l'invasione dal tumore primario o l'angiogenesi.

Qui descriviamo una piattaforma di screening quantitativo che può essere utilizzata per misurare la capacità delle cellule tumorali di stabilire lesioni metastatiche invasive. Le cellule tumorali che sono state trasdotte con una libreria di espressioni vengono iniettate per via endovenosa nella vascolarizzazione CAM a bassa densità. Le colonie metastatiche si formano per 4-5 giorni, quindi viene valutata la capacità di invasione e l'interazione vascolare delle colonie risultanti. Le singole colonie che non riescono a invadere vengono asportate, propagate e il loro fenotipo viene confermato nella CAM mediante reiniezione e quantificazione della compattezza delle colonie e dei contatti cellula tumorale-vaso sanguigno. I costrutti della libreria di espressioni responsabili del fenotipo mutante della singola colonia metastatica sono identificati dal DNA genomico della colonia isolata tramite sequenziamento ad alto rendimento. La stessa piattaforma può essere ulteriormente utilizzata per convalidare il nesso causale tra un gene e il fenotipo osservato o per eseguire studi meccanicistici approfonditi sul fenotipo osservato.

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con i regolamenti e le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso l'Università di Alberta. Gli embrioni aviari non sono considerati animali vivi da molti istituti di ricerca e non sono richiesti protocolli animali. Tuttavia, è opinione accettata che gli embrioni aviari possano provare dolore e, pertanto, debbano essere trattati nel modo più umano possibile. L'autorità locale per la ricerca sugli animali deve essere contattata prima dell'inizio di qualsiasi lavoro di ricerca per garantire che vengano seguite le normative appropriate.

1. Coltura di uova senza guscio

  1. Acquista uova di gallina fecondate dal fornitore locale. Questo esperimento utilizza la razza di pollo Livorno Bianca; tuttavia, possono essere utilizzate anche altre razze.
    NOTA: Si raccomanda di acquisire il 10% in più di uova del necessario nel caso in cui alcuni degli embrioni siano danneggiati durante il cracking e non possano essere utilizzati in questo protocollo.
  2. Trasferire il numero richiesto di uova in un incubatore a dondolo umidificato al 60%. Il resto delle uova può essere conservato fino a due settimane a 12 °C senza perdita di vitalità.
  3. Incubare le uova nell'incubatrice a dondolo umidificata per quattro giorni.
    NOTA: Il giorno 1 è quando le uova vengono trasferite nell'incubatrice a dondolo.
  4. Preparare i piatti di pesatura e i coperchi di plastica per la coltura delle uova senza guscio. Tagliare uno degli angoli di ciascuna delle stoviglie di pesatura per consentire un accesso efficiente dell'aria all'embrione (Figura 1A).
  5. Disporre i piatti di pesatura preparati in file nella cappa di flusso. (Figura 1B).
  6. In un piatto di pesatura separato preparare il 70% di etanolo per il risciacquo delle uova.
  7. Immergere brevemente l'uovo nel 70% di etanolo, quindi utilizzare lo strumento rotante elettrico per effettuare con cura quattro tagli di 2-3 mm paralleli al più grande diametro latitudinale dell'uovo (Figura 1C).
  8. Trasferire l'uovo tagliato in un piatto di pesatura e premere delicatamente l'uovo contro il fondo del piatto fino a formare una crepa nel guscio d'uovo (Figura 1D).
  9. Separare le metà del guscio d'uovo lasciando che l'embrione scivoli nel piatto di pesatura. Scartare il guscio d'uovo e coprire il piatto di pesatura con un coperchio.
  10. Trasferire gli embrioni in incubatrici umidificate non a dondolo (Figura 1E).
    NOTA: Le stoviglie di pesatura contenenti gli embrioni vengono poste in contenitori di plastica separati (12 embrioni/contenitore). Ciò aumenta la vitalità dell'embrione e consente l'organizzazione dell'embrione specifica per l'esperimento.
  11. Incubare gli embrioni per altri 6 giorni (fino a 10 giorni). Controllare quotidianamente la ricerca di embrioni morti o contaminati e rimuoverli dall'incubatrice.
    NOTA: gli embrioni possono essere contaminati da spore di muffa trasportate dall'aria. La contaminazione da muffa si manifesta inizialmente come macchie bianche sulla superficie CAM dell'embrione. Rimuovere immediatamente gli embrioni contaminati e pulire l'incubatrice con il 70% di etanolo su base settimanale per prevenire la contaminazione. Nella nostra esperienza i livelli di contaminazione sono molto bassi ~ 1-3%.
  12. Utilizzare questi embrioni per l'iniezione di cellule tumorali la mattina del giorno 10.

2. Preparazione delle cellule tumorali per l'iniezione

NOTA: La selezione delle colonie metastatiche si basa su un fenotipo stabilito da cellule tumorali fluorescenti, derivato da una libreria di espressioni o da un vettore etichettato con proteine fluorescenti come la proteina fluorescente verde o rossa (vedere l'intero flusso dello schermo nella Figura 2A). Non è raccomandato l'uso di cellule trasfettate transitoriamente con proteine fluorescenti o etichettate con coloranti fluorescenti permeabili alle cellule a causa del rapido sbiadimento del segnale causato dalla proliferazione delle cellule tumorali e dalla colorazione irregolare.

  1. Coltura di cellule tumorali al 60-70% di confluenza al momento dell'iniezione. L'uso di cellule tumorali a livelli più elevati di confluenza ridurrà la loro vitalità, con conseguente bassa efficienza della formazione di colonie metastatiche. Assicurarsi che le cellule tumorali utilizzate siano prive di micoplasma poiché la contaminazione da micoplasma può portare a una diminuzione della vitalità dell'embrione di pollo.
  2. Risciacquare le cellule due volte con 1x PBS pH 7,4. Rimuovere il PBS rimanente, quindi aggiungere lo 0,5% di tripsina-EDTA e incubare a 37 °C per 2-5 minuti fino a quando tutte le cellule non vengono sollevate dalla superficie del piatto di coltura.
  3. Trasferire la sospensione cellulare in tubo conico da 15 mL e centrifugare a temperatura ambiente a 200 x g per 5 min.
  4. Risospendare le cellule in 10 mL di PBS e centrifugare nuovamente le cellule come nel passaggio 2.3, per rimuovere la tripsina e altri componenti dei mezzi di coltura come gli antibiotici.
    NOTA: La presenza di tripsina o componenti di colture cellulari come antibiotici nella sospensione delle cellule tumorali può comportare una diminuzione della vitalità dell'embrione di pollo.
  5. Aspirare accuratamente le cellule surnatante e riconsoppiate con 1 mL di PBS ghiacciato.
  6. Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro o qualsiasi altra apparecchiatura di conteggio delle cellule disponibile.
    NOTA: Questo protocollo di screening richiede che ogni colonia metastatica sia iniziata da una singola cellula. Quando si contano le cellule assicurarsi che le cellule siano completamente tripsinizzate ed esistano come una sospensione a singola cellula (non sono presenti grumi cellulari).
  7. Per iniezione endovenosa (IV) concentrare le cellule a 0,5 x10 da 6 a 1,0 x 106 cellule/ ml. Utilizzare 1x PBS ghiacciato per diluire e/o risospendare i concentrati cellulari. Aspettatevi che sarà necessario circa 1 mL di sospensione delle cellule per ogni dieci embrioni.
    NOTA: La concentrazione necessaria di sospensione cellulare in sospensione è determinata principalmente dal livello di esperienza dello sperimentatore. Si prega di consultare la sezione successiva per maggiori dettagli.

3. Iniezione endovenosa di cellule tumorali per la formazione di colonie metastatiche

NOTA: Seguendo questo protocollo fino a un centinaio di embrioni possono essere iniettati entro un giorno. Generalmente ci vuole più tempo per isolare le colonie metastatiche (Step 5) quindi per iniettare le cellule tumorali e, pertanto, si consiglia di eseguire un esperimento iniziale per stimare il tempo necessario per completare tutti i passaggi. L'uso di etichette fluorescenti differenziali per cellule tumorali aiuta a ridurre il numero di animali e il tempo necessario per ogni esperimento. Ad esempio, le cellule di controllo possono essere etichettate con RFP (proteina fluorescente rossa) mentre le cellule tumorali mutanti possono essere alternativamente etichettate con GFP (proteina fluorescente verde). In questo caso, ogni esperimento ha un controllo integrato che corregge la variabilità interembriale.

  1. Assemblare l'apparecchio di iniezione come mostrato nella Figura 2B. Montare prima un ago sulla siringa e poi estendere l'ago della siringa con un tubo lungo 3-5 cm.
  2. Rompere la punta dell'ago borosilicato usando la pinna fine (~ 20-60 μL di larghezza).
  3. Caricare la siringa con la sospensione delle cellule tumorali (50-200 μL) e inserire l'ago borosilicato nel tubo (Figura 2B).
  4. Ispezionare l'ago borosilicato per l'intasamento delle cellule e le bolle d'aria. È fondamentale iniettare le cellule come una sospensione a singola cellula per garantire che ogni colonia metastatica sia avviata da una singola cellula.
    NOTA: Le cellule tumorali tendono ad aggregarsi in PBS entro 1-2 ore dopo la tripsinizzazione e, pertanto, devono essere preparate immediatamente prima dell'iniezione. Se necessario, le cellule possono essere riconsosciate periodicamente utilizzando la siringa da 1 mL utilizzata per iniezioni (senza l'ago borosilicato).
  5. Se si osserva un intasamento cellulare all'interno del capillare, rimuovere il capillare, sospendere nuovamente le cellule e sostituirlo con un nuovo capillare. Usa lo stantuffo per spingere fuori eventuali bolle. Se non si osservano intasamenti o bolle cellulari, procedere al passaggio successivo.
  6. Rimuovere il coperchio di copertura e trasferire l'embrione sotto lo stereoscopio. Identificare la vena appropriata da iniettare sulla superficie CAM. Vene e arterie formano l'intricata rete all'interno del tessuto CAM (Figura 2C). Le vene si distinguono per il colore rosso più brillante perché trasportano sangue ricco di ossigeno all'embrione.
    NOTA: per la manipolazione generale degli embrioni, l'iniezione di cellule tumorali e l'escissione di colonie metastatiche, utilizzare uno stereomicroscopio fluorescente dotato di obiettivi 0,8x e 1,5x e oculari 10x per la visualizzazione. Il microscopio meno avanzato può anche essere utilizzato con successo per queste procedure, a seconda del livello di esperienza degli utenti. I lettori possono contattare gli autori per consigli più dettagliati.
  7. Trova la vena ideale per iniettare le cellule che normalmente è solo leggermente più larga (10-20%) rispetto al diametro della punta dell'ago di borosilicato e situata a metà strada tra l'embrione e la parete del piatto di pesatura. È generalmente più facile iniettare nel punto immediatamente adiacente alla biforcazione venosa.
    NOTA: L'iniezione in una vena più grande può sembrare più facile, ma porterà a sanguinamento eccessivo e diminuzione della sopravvivenza dell'embrione.
  8. Premere la punta dell'ago contro la parete dei vasi sanguigni e applicare una leggera pressione nella stessa direzione del flusso sanguigno. Se necessario, utilizzare un batuffolo di cotone (tenuto in un'altra mano) per aiutare ad ancorare o stabilizzare la nave che viene iniettata.
  9. Premere delicatamente lo stantuffo della siringa. Si può visualizzare un'iniezione di successo osservando una "pulizia" del vaso sanguigno quando la sospensione delle cellule tumorali entra nel flusso sanguigno.
  10. Continuare a premere lo stantuffo della siringa per 2-10 s fino a quando il volume di sospensione desiderato viene iniettato nel flusso sanguigno della vena. Tutti insieme l'iniezione di un singolo embrione può richiedere 1-10 minuti a seconda del livello di esperienza dell'utente. Se nel sito di iniezione appare un sanguinamento eccessivo o un chiaro accumulo di liquidi, scartare l'embrione.
    NOTA: È facile "iniettare troppo" un embrione. La considerazione generale che dovrebbe essere tenuta a mente è che le colonie metastatiche non dovrebbero toccarsi dopo un periodo di crescita di 4-5 giorni. Idealmente ~ 5-10% dei capillari venosi CAM terminali dovrebbe avere cellule immobilizzate in essi dopo un'iniezione di successo (Figura 2D, E). Come accennato nel passaggio 2, è possibile utilizzare un intervallo di concentrazione cellulare (0,5 x10 6 - 1,0 x 106 celle / mL). Concentrazioni più basse richiederanno tempi di iniezione più lunghi, ma ridurranno l'intasamento dell'ago. Concentrazioni più elevate richiederanno tempi di iniezione più brevi, ma aumenteranno l'intasamento dell'ago. Si consiglia di provare diverse concentrazioni per trovare quella più comoda per un operatore. Generalmente, si preferisce una concentrazione più elevata (1,0 x10 6 cellule/ml) per ridurre il tempo di iniezione.
  11. Rimuovere l'ago dal CAM e tamponare delicatamente il sito di iniezione con un batuffolo di cotone per rimuovere il sangue o le cellule tumorali in eccesso.
  12. Coprire l'embrione nella pesata con un coperchio e riportare l'embrione di pollo iniettato nell'incubatrice.
  13. Ripetere la procedura con l'embrione successivo fino a quando tutti gli embrioni vengono iniettati.

4. Mantenimento dell'embrione durante la crescita della colonia metastatica

  1. Ispezionare visivamente gli embrioni. Se ce ne sono alcuni morti e / o contaminati da batteri o muffe rimuoverli dall'incubatore, quindi autoclave e scartarli secondo le procedure di smaltimento di laboratorio.
    NOTA: Si raccomanda di ispezionare gli embrioni a giorni alterni (giorni 1, 3, 5 dopo l'iniezione di cellule tumorali) per la crescita delle colonie metastatiche. Evitare di spostare gli embrioni iniettati inutilmente poiché potrebbe causare danni all'embrione e/o morte.
  2. Se le cellule mostrano una crescita eccessiva (le colonie metastatiche si sovrappongono tra loro) o una distribuzione irregolare all'interno del tessuto CAM (colonie metastatiche situate in una piccola sottoarea della superficie CAM) rimuovere quell'embrione dall'esperimento. Eutanasia degli embrioni scartati mediante congelamento a -20 °C (o altro metodo approvato) immediatamente dopo la rimozione dall'esperimento. Il numero di cellule metastatiche vitali all'interno del tessuto CAM diminuirà inizialmente (giorni 1-2) e poi aumenterà (giorni 2-5).
    NOTA: Alcuni embrioni possono "rifiutare" le cellule tumorali, cioè tutte le cellule tumorali scompariranno dal tessuto CAM. Questi embrioni dovrebbero essere rimossi dall'esperimento. Normalmente, le colonie di cellule tumorali possono essere viste attraverso il coperchio trasparente sotto lo stereomicroscopio fluorescente senza aprire la parabola di pesatura.
  3. Assicurarsi che le colonie metastatiche appaiano di forma uniforme (primi 1-3 giorni dopo l'iniezione). Identificare colonie metastatiche invasive o non invasive ai giorni 4-5 dopo l'iniezione (vedere paragrafo 5 per maggiori dettagli).

5. Isolamento delle colonie metastatiche

  1. Al giorno 5 dopo l'iniezione rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e ispezionare i CAR embrionali per la distribuzione delle colonie metastatiche. Identificare gli embrioni con distribuzione uniforme delle colonie in cui sono presenti colonie compatte (o eccessivamente invasive).
    NOTA: Il processo di coltura degli embrioni di pollo non è sterile, pertanto tutte le fasi di screening devono essere eseguite in condizioni altamente pulite per evitare future contaminazioni da coltura tissutale. La contaminazione è piuttosto rara e può essere facilmente evitata indossando guanti e una maschera e utilizzando solo strumenti sterili durante le procedure di iniezione cellulare e isolamento delle colonie. Si raccomanda di ispezionare gli embrioni uno per uno per ridurne l'esposizione alla temperatura ambiente di laboratorio e per prevenire la contaminazione.
  2. Individua la colonia metastatica di interesse. Una colonia compatta può essere descritta come una con la maggior parte delle cellule tumorali situate all'interno di un'area limitata nel tessuto CAM (le cellule appaiono "raggruppate insieme"). Una colonia invasiva può essere descritta come colonia in cui le cellule tumorali "si disperdono" nel tessuto CAM (Figura 3A,B).
    NOTA: La "compattezza" della colonia metastatica può essere spiegata sia dall'inibizione dell'invasione delle cellule tumorali, dall'inibizione della proliferazione delle cellule tumorali, sia da entrambe. Si dovrebbe prestare attenzione a tutti gli scenari e le colonie di contatto dovrebbero essere isolate (Figura 3A,B). Un semplice stereomicroscopio fluorescente può essere utilizzato per discriminare tra fenotipi di colonie metastatiche compatte e invasive.
  3. Sotto il microscopio di dissezione tirare delicatamente verso l'alto il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica di interesse usando una pinza fine (Figura 3C).
  4. Tagliare il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica usando forbici chirurgiche.
  5. Trasferire il tessuto CAM che contiene la colonia metastatica in un tubo vuoto e sterile da 1,5 ml (su ghiaccio) e chiudere il coperchio del tubo.
    NOTA: Le colonie isolate possono essere mantenute sul ghiaccio per un massimo di 3 ore senza perdita di vitalità.
  6. Ripetere la procedura di escissione fino a quando tutte le colonie di interesse sono raccolte in tubi separati. Per evitare sofferenze animali, non asportare più di 2-3 colonie da un embrione. Eutanasia degli embrioni mediante congelamento a -20 °C (o altro metodo approvato) immediatamente dopo l'escissione della colonia.
  7. Tritare delicatamente il tessuto CAM in un tubo microcentrifuga utilizzando un ago sterile calibro 18. Utilizzare un ago separato per ogni colonia.
  8. Aggiungere 100 μL di 1x soluzione di collagenasi e incubare per 30 minuti a 37 °C.
  9. Ruotare le cellule e il tessuto CAM a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  10. Aspirare la soluzione di collagenasi e risospendare le cellule in mezzi completi utilizzati per la linea cellulare di interesse.
    NOTA: Normalmente il tessuto CAM non è completamente dissociato dopo il trattamento con collagenasi e le cellule tumorali proliferano prima all'interno dei pezzi di tessuto CAM e solo successivamente migrano sul piatto di coltura tissutale.
  11. Ruotare nuovamente le cellule e il tessuto CAM a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
  12. Risuspendare le cellule e i pezzi di tessuto CAM in 1 mL di supporto completo più fattore di selezione (se presente), quindi trasferire in un singolo piatto di coltura tissutale a 12 pozzi.
    NOTA: I fibroblasti CAM di pollo possono persistere nella coltura tissutale per passaggi multipli inibendo l'espansione clonale. La capacità di espandere le colonie metastatiche in presenza di fattore di selezione (cioè, se un vettore che è stato usato per rendere fluorescenti le cellule tumorali codifica anche un gene di resistenza agli antibiotici dei mammiferi) può accelerare notevolmente l'espansione clonale. Un esperimento di curva di uccisione deve essere eseguito prima dello screening per garantire che venga utilizzata una corretta concentrazione di antibiotico.
  13. Per le prossime 1-3 settimane monitorare le cellule tumorali ogni giorno per la crescita e la contaminazione.
  14. Quando le cellule raggiungono il 70-80% della confluenza trasferiscono le cellule in un piatto di coltura di volume più grande.
    NOTA: Si raccomanda di espandere le cellule fino a quando almeno due flaconcini criogenici di ciascun clone possano essere congelati. Mantenere grandi quantità di coltura tissutale può essere laborioso e non necessario.
  15. Procedere al sequenziamento o al prossimo ciclo di selezione non appena viene raggiunto un numero sufficiente di cellule tumorali. Generalmente, 1 x 106 di cellule tumorali sono sufficienti per le moderne tecniche di sequenziamento ad alto rendimento.
  16. Procedere alla reiniezione del clone e all'imaging e alla quantificazione della compattezza della colonia o del contatto cellula tumorale-vaso sanguigno (Figura 2A). In alternativa, procedere al sequenziamento ad alto rendimento o ripetere la selezione della colonia.
    NOTA: per ridurre il numero di falsi positivi si consigliano almeno due cicli di selezione. Due approcci sono stati impiegati con successo. 1) Espandere ogni clone e reiniettare individualmente per confermare il fenotipo della colonia. 2) Mescolare tutti i cloni espansi in un rapporto 1:1 ciascuno, reiniettare come miscela e ripetere il ciclo di selezione.

6. Iniezione di lectine marcate fluorescentemente nella vascolarizzazione CAM.

  1. Identificare la vena da iniettare. È più facile utilizzare lo stesso sito di iniezione per la lectina che è stato utilizzato per l'iniezione di cellule tumorali.
  2. Diluire la soluzione stock di lectina fluorescente (5 mg/ml) 50-100x con 1x PBS e caricarla nello stesso apparato di iniezione utilizzato per l'iniezione di cellule tumorali.
    NOTA: La quantità di lectina che deve essere iniettata (normalmente 20-100 μL) per la visualizzazione dei vasi sanguigni dipende dalla sensibilità del microscopio e deve essere determinata sperimentalmente prima dello screening.
  3. Iniettare lectina usando la stessa tecnica dell'iniezione di cellule tumorali (vedere i passaggi 3.6.-3.10.).
  4. Dopo l'iniezione di lectina, mettere l'embrione nell'incubatrice per recuperare per 5 minuti. Iniettare solo un embrione alla volta e immediatamente prima di immaginare l'embrione.
    NOTA. Gli embrioni di età pari o superiore a 12 giorni generalmente guariscono bene dalle iniezioni di lectina e possono essere reiniettati di nuovo con lectina il giorno successivo per l'imaging sequenziale. Gli embrioni più giovani sono più sensibili e possono mostrare coagulazione del sangue.

7. Visualizzazione dei contatti cellula tumorale-vasi sanguigni

  1. Impostare l'involucro del microscopio a temperatura regolata a 37 °C circa 6 ore prima dell'imaging. Ciò stabilizzerà la temperatura del microscopio e contribuirà a ridurre al minimo la deriva XYZ durante l'imaging.
    NOTA. Per questo esperimento è stata utilizzata una camera di imaging specializzata per embrioni di pollo9,10,11, 12,13. Un semplice microscopio a dissezione fluorescente può essere utilizzato per tutte le fasi a partire dall'iniezione di cellule tumorali alla selezione del clone e alla reiniezione del clone e alla valutazione della compattezza della colonia. Un microscopio confocale dotato di una camera di imaging è necessario per l'imaging e la quantificazione dei contatti cellula tumorale-vaso sanguigno. Non è necessario alcun riscaldamento per un massimo di 1 ora e generalmente gli embrioni sopravvivono ad almeno due sessioni di imaging sequenziale senza alcun impatto sulla loro vitalità.
  2. Assicurarsi che sia stata installata la lente dell'obiettivo necessaria (si consiglia una lente ad immersione in acqua 20x o 25x).
  3. Applicare un sottile strato di grasso sottovuoto sul lato inferiore del coperchio della camera di imaging per creare una tenuta sicura con il coperchio.
  4. Posizionare delicatamente una coverlip nel coperchio e asciugare il grasso sottovuoto in eccesso.
  5. Togliere l'embrione iniettato di lectina dall'incubatrice e tagliare i bordi della pesata, se necessario.
  6. Posizionare l'embrione nella camera di imaging con il coverslip abbassato direttamente sull'area del CAM in cui si trovano le colonie metastatiche di interesse. Abbassare lentamente il coperchio sull'embrione fino a quando il coverslip non contatta il CAM. Stringere le viti per fissare il coperchio in posizione, assicurarsi che il coperchio sia livellato e che il coperchio non eserciti alcuna pressione verso il basso sul CAM.
  7. Acquisire immagini di colonie multiple e casuali da gruppi di controllo e sperimentali (10-20) da diversi (5-10) embrioni.
    NOTA. Si consiglia di acquisire stack 3D casuali (1-5um Z-steps; 50-100um range; 25x) da ciascun campo.
  8. Utilizzare l'opzione di cucitura sul campo nel software di acquisizione del microscopio, se disponibile. Poiché le immagini utilizzate per la quantificazione non saranno di qualità di pubblicazione, utilizzare modalità di acquisizione rapida come la scansione risonante, se disponibile. Utilizzare 25x obiettivo e 3 x 3 cuciture con 5-10 μm Z-step, 100 μm gamma totale. Immagine di almeno 100 cellule (~ 20 colonie) per condizione.

8. Quantificazione dei contatti dei vasi sanguigni delle cellule tumorali

  1. Aprire il file 3D come Z-stack utilizzando il software necessario.
    NOTA. Un software specializzato deve essere utilizzato per acquisire e analizzare immagini ad alta risoluzione al fine di quantificare il contatto cellula tumorale-vaso sanguigno. Sono disponibili diversi pacchetti software in grado di analisi di immagini 3D. Si prega di consultare la Tabella dei materiali per maggiori dettagli.
  2. Se durante l'acquisizione dell'immagine si è verificato un movimento XY significativo, allineare lo Z-stack utilizzando il plug-in ImageJ StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg).
  3. Individuare la cella o le celle di interesse.
  4. Scorrere l'immagine XYZ nella direzione Z e identificare la sezione ottica che contiene la lunghezza massima del contatto del vaso sanguigno della cellula tumorale per la cellula di interesse (Figura 2E).
  5. Misurare il contatto cellula-vaso sanguigno del cancro utilizzando la "funzione di misurazione manuale della lunghezza".
  6. Immettere le misurazioni nel pacchetto software di dati utilizzato per l'analisi statistica.
    NOTA: La capacità delle cellule tumorali di attaccarsi ai vasi sanguigni può essere misurata come la lunghezza dei contatti cellula tumorale-vaso sanguigno o la percentuale della cellula in contatto con la vascolarizzazione per particolari cloni di cellule tumorali (o entrambi).
  7. Passare alla cella di interesse successiva.
  8. Analizza i dati per la significatività statistica confrontando i cloni mutanti e i set di dati di controllo.

9. Quantificazione della compattezza delle colonie

  1. Reiniettare le celle del clone espanso utilizzando la stessa tecnica del passaggio 2.
  2. Cinque giorni dopo l'iniezione acquisire immagini di 10-50 colonie metastatiche casuali per ogni clone.
    NOTA: non sono necessarie immagini di alta qualità per la quantificazione della compattezza delle colonie metastatiche. Sono sufficienti immagini monocromatiche al microscopio stereo (ingrandimento 10x). Si dovrebbe prestare attenzione alla luminosità dell'immagine (la maggior parte delle cellule all'interno della colonia dovrebbe essere vista) e al contrasto (differenza tra una o due cellule).
  3. Isolare digitalmente l'immagine della colonia (vedere Figura 2C,D)e procedere alla quantificazione della compattezza della colonia utilizzando il modulo di quantificazione della compattezza della colonia stand-alone o il punteggiocieco 13.
  4. Procedi verso la prossima colonia di interesse.
  5. Analizza i dati per la significatività statistica confrontando i set di dati di clone mutanti e di controllo (ad esempio scramble shRNA).

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Risultati

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L'iniezione di cellule tumorali è considerata di successo se la maggior parte delle cellule che si depositano nei capillari sono singole e situate a una differenza significativa l'una dall'altra (~ 0,05-0,1 cm) in modo che le colonie non si sovrappongano dopo 5-6 giorni di periodo di incubazione (Figura 3A). L'iniezione non ha avuto successo se si può vedere un accumulo di cellule tumorali nella maggior parte dei capillari, gli embrioni che lo mostrano devono...

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Discussione

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Qui descriviamo un protocollo di screening intravitale basato sulla microscopia a fluorescenza rapida che può essere utilizzato per applicazioni importanti come gli screening genetici o dei farmaci candidati. Le cellule tumorali che sono state trasdotte con una libreria genetica di interesse o trasfettate con costrutti di espressione individuale possono essere rapidamente vasate e quantificate in base al fenotipo di interesse utilizzando questo modello CAM di pulcino. Poiché i protocolli di trasduzione o trasfezione vari...

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Dichiarazioni

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Niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione del Canadian Cancer Society Research Institute #702849 a JDL e KS. Il Dr. Lewis detiene la cattedra Frank e Carla Sojonky nella ricerca sul cancro alla prostata supportata dalla Alberta Cancer Foundation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Siringhe monouso da 1 mLBDBD309659
provette da centrifuga coniche da 15 mL.CorningCLS430791-500EA
18 calibro x 1 1/2  Ago di precisione BDBD BD305196utilizziamo 1,2 mm x 40 mm, è possibile utilizzare aghi più corti se si preferisce
Soluzione di tripsina al 2,5%molte fonti sono disponibili
4T1 cancro al seno di topoATCCCRL-2539
B16F10 linea cellulare di melanoma di topoATCCCRL-6475
Centrifuga da banco.sono disponibiliQualsiasi centrifuga compatibile con TC che può essere utilizzata per centrifugare le celle è adatta
Vetrini coprioggetti circolari, 22 mm.Fisher Scientific12-545-101
CollagenaseSigmaC0130-100MG
MicroscopioNikon A1r
disponibilidevono essere sterilizzate prima dell'uso
Terreni di coltura appropriati per le linee cellulari utilizzatesono disponibiliColtiviamo linee cellulari HT1080, HEp3 e b16 in DMEM, 10% FBS media
Incubatrice per uovasono disponibiliUn modello esatto necessario dipende dalla scala dello schermo. Le fonti disponibili sono MGF Company Inc., Savannah, GA, o Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA
eppendor tubi, 1,5 mlSigmaT4816-250EA
Uova di livorno bianco fecondatoqualsiasi fornitore
pinze finimolte fonti sono disponibilidevono essere sterilizzate prima dell'uso
Emocitometro...Millipore-SigmaMDH-4N1-50PK
HT1080ATCCCCL-121
SoftwareUtilizziamo Nikon Elements
Lectina Lens Culinary Agglutinina (LCA) coniugata con fluoresceina o rodamina...Vector LaboratoriesRL-1042, FL-1041Diluire il brodo (5 mg/ml) 50-100x a seconda della sensibilità del microscopio. Deve essere di un colore diverso dal colore della linea cellulare utilizzata per lo screening
MDA-MB-468 del carcinoma mammario umanoATCCHTB-132
PBS (1x)sono disponibili molte fonti Piatti
di pesatura in plastica Le dimensioni di SimportCA11006-614sono 78x78x25mm; sono disponibili molte altre fonti
di forbici chirurgiche piccole sono disponibilidevono essere sterilizzate prima dell'uso
Tubi capillari in vetro borosilicato di sodio, diametro esterno 1,0 mm, diametro interno 0,58 mm, lunghezza 10 cm Sutter InstrumentBF100-58-10
Piastre di Petri quadrate (utilizzate come coperchi per le piastre di pesatura).  VWRCA25378-115 Le dimensioni sono 100x100x15mm; sono disponibili molte altre fonti
Microscopio stereofluorescente Usiamo tubi da laboratorio Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603Cole-ParmerAAC000011/32 di diametro interno, 3/32 di pollice di diametro esterno, 1/32 di pollice di spessore della parete
U-118 MG glioblastoma umanoATCCHTB-15
U-87 MG glioblastoma umanoATCCHTB-14
Estrattore verticale per pipette...molte fonti sono disponibili, usiamo David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Modello 720
molte fonti confocale Usiamo tamponi di cotone sono molte fonti molte fonti molte fonti localeLinea cellulare di fibrosarcoma umano di analisi delle immagini molte fonti

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144 (5), 646-674 (2011).
  2. Van't Veer, L. J., et al. Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer. Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).
  3. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369 (9574), London, England. 1742-1757 (2007).
  4. Weber, G. F. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Letters. 270 (2), 181-190 (2008).
  5. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  6. Pantel, K., Brakenhoff, R. H. Dissecting the metastatic cascade. Nature Reviews Cancer. 4 (6), 448-456 (2004).
  7. Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Reviews Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
  8. Oudin, M. J., et al. Tumor cell-driven extracellular matrix remodeling drives haptotaxis during metastatic progression. Cancer Discovery. 6 (5), 516-531 (2016).
  9. Leong, H. S., et al. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nature Protocols. 5 (8), 1406-1417 (2010).
  10. Kain, K. H., et al. The chick embryo as an expanding experimental model for cancer and cardiovascular research. Developmental Dynamics : An official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (2), 216-228 (2014).
  11. Zijlstra, A., Lewis, J., Degryse, B., Stuhlmann, H., Quigley, J. P. The inhibition of tumor cell intravasation and subsequent metastasis via regulation of in vivo tumor cell motility by the tetraspanin CD151. Cancer Cell. 13 (3), 221-234 (2008).
  12. Palmer, T. D., Lewis, J., Zijlstra, A. Quantitative analysis of cancer metastasis using an avian embryo model. Journal of visualized experiments : JoVE. (51), e2815(2011).
  13. Stoletov, K., et al. Quantitative in vivo whole genome motility screen reveals novel therapeutic targets to block cancer metastasis. Nature Communications. 9 (1), 2343(2018).
  14. Leong, H. S., et al. Invadopodia are required for cancer cell extravasation and are a therapeutic target for metastasis. Cell Reports. 8 (5), 1558-1570 (2014).
  15. Willetts, L., Bond, D., Stoletov, K., Lewis, J. D. The Tumor Microenvironment: Methods and Protocols. Ursini-Siegel, J., Beauchemin, N. , Springer. New York. 27-37 (2016).

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