Approcci di visualizzazione e analisi tridimensionali e quadridimensionali per studiare l'allungamento e la segmentazione assiale dei vertebrati

André Dias; Gabriel G. Martins; Alexandre Lopes; Moisés Mallo

doi:10.3791/62086

Method Article

Approcci di visualizzazione e analisi tridimensionali e quadridimensionali per studiare l'allungamento e la segmentazione assiale dei vertebrati

DOI:

10.3791/62086

⸱

February 28th, 2021

André Dias¹ , Gabriel G. Martins¹^,² , Alexandre Lopes¹^,³ , Moisés Mallo¹

¹Instituto Gulbenkian de Ciência, ²Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, ³NOVA School of Science and Technology

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descriviamo strumenti e metodi computazionali che consentono la visualizzazione e l'analisi di dati di immagini tridimensionali e quadridimensionali di embrioni di topo nel contesto dell'allungamento e della segmentazione assiale, ottenuti mediante tomografia a proiezione ottica in toto e mediante imaging dal vivo e colorazione a immunofluorescenza a montaggio intero utilizzando la microscopia multifotonica.

Abstract

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La somitogenesi è un segno distintivo dello sviluppo embrionale dei vertebrati. Per anni, i ricercatori hanno studiato questo processo in una varietà di organismi utilizzando una vasta gamma di tecniche che comprendono approcci ex vivo e in vitro. Tuttavia, la maggior parte degli studi si basa ancora sull'analisi dei dati di imaging bidimensionali (2D), che limita la corretta valutazione di un processo di sviluppo come l'estensione assiale e la somitogenesi che coinvolgono interazioni altamente dinamiche in uno spazio 3D complesso. Qui descriviamo le tecniche che consentono l'acquisizione di immagini dal vivo del topo, l'elaborazione di set di dati, la visualizzazione e l'analisi in 3D e 4D per studiare le cellule (ad esempio, progenitori neuromesodermici) coinvolte in questi processi di sviluppo. Forniamo anche un protocollo passo-passo per la tomografia a proiezione ottica e la microscopia a immunofluorescenza a montaggio intero in embrioni di topo (dalla preparazione del campione all'acquisizione di immagini) e mostriamo una pipeline che abbiamo sviluppato per elaborare e visualizzare i dati delle immagini 3D. Estendiamo l'uso di alcune di queste tecniche ed evidenziamo caratteristiche specifiche di diversi software disponibili (ad esempio, Fiji / ImageJ, Drishti, Amira e Imaris) che possono essere utilizzate per migliorare la nostra attuale comprensione dell'estensione assiale e della formazione di somiti (ad esempio, ricostruzioni 3D). Complessivamente, le tecniche qui descritte sottolineano l'importanza della visualizzazione e dell'analisi dei dati 3D nella biologia dello sviluppo e potrebbero aiutare altri ricercatori ad affrontare meglio i dati delle immagini 3D e 4D nel contesto dell'estensione e della segmentazione assiale dei vertebrati. Infine, il lavoro impiega anche nuovi strumenti per facilitare l'insegnamento dello sviluppo embrionale dei vertebrati.

Introduction

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La formazione dell'asse del corpo dei vertebrati è un processo altamente complesso e dinamico che si verifica durante lo sviluppo embrionale. Alla fine della gastrulazione [nel topo, intorno al giorno embrionale (E) 8.0], un gruppo di cellule progenitrici epiblastiche note come progenitori neuromesodermici (NMP) diventa un fattore chiave dell'estensione assiale in una sequenza testa a coda, generando il tubo neurale e i tessuti mesodermici paraassiali durante la formazione del collo, del tronco e della coda 1,2,3,4 . È interessante notare c....

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Protocol

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Gli esperimenti che coinvolgono animali hanno seguito le legislazioni portoghese (Portaria 1005/92) ed europea (direttiva 2010/63/UE) in materia di alloggio, allevamento e benessere. Il progetto è stato esaminato e approvato dal Comitato Etico dell'Instituto Gulbenkian de Ciência e dall'Ente Nazionale Portoghese ,Direcção Geral de Alimentação e Veterinária' (riferimento di licenza: 014308).

1. Preparazione del campione per l'imaging 3D e 4D

NOTA: Qui forniamo una descrizione dettagliata su come sezionare e preparare embrioni di topo da E8,25 a E10,5 per l'imaging dal vivo (1,1), embrioni da E7,5 a E11,5 per microsc....

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Results

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I risultati rappresentativi mostrati in questo documento sia per l'imaging vivo che per l'imaging a immunofluorescenza, sono stati ottenuti utilizzando un sistema a due fotoni, con un obiettivo acquatico da 20 × 1,0 NA, il laser di eccitazione sintonizzato su 960 nm e fotorivelatori GaAsP (come descritto in Dias et al. (2020) ⁴³. La tomografia a proiezione ottica è stata eseguita utilizzando uno scanner OPenT costruito su misura (come descritto in Gualda et al. (2013)²⁸.

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Discussion

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L'allungamento assiale e la segmentazione sono due dei processi più complessi e dinamici che si verificano durante lo sviluppo embrionale dei vertebrati. L'uso dell'imaging 3D e 4D con tracciamento monocellulare è stato applicato, da tempo, per studiare questi processi sia negli embrioni di zebrafish che di pollo, per i quali l'accessibilità e le condizioni di coltura facilitano l'imaging complesso ^{19,44,45,46,47,48,49}

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Disclosures

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgements

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Vorremmo ringraziare Olivier Pourquié e Alexander Aulehla per il ceppo reporter LuVeLu, il laboratorio SunJin per il campione di test RapiClear, Hugo Pereira per l'aiuto con BigStitcher, Nuno Granjeiro per aver contribuito a configurare l'apparato di imaging dal vivo, la struttura per animali IGC e i membri passati e presenti del laboratorio Mallo per commenti utili e supporto nel corso di questo lavoro.

Ringraziamo il supporto tecnico dell'Advanced Imaging Facility di IGC, che è supportato dal finanziamento portoghese ref# PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122 e ref# PTDC/BII-BTI/32375/2017, cofinanziato dal Programma operativo regionale di Lisbo....

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Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarosio a bassa temperatura di gelificazione	Sigma	A9414	Utilizzato per il montaggio di embrioni (ad es. per OPT)
Software Amira	Strumento software Thermofisher-Commerial
Anti-Brachyury (policlonale di capra)	Sistemi di ricerca e sviluppo	AF2085 RRID:AB_2200235	Per immunofluorescenza
Anti-Sox2 (Coniglio monoclonale)	Abcam	ab92494 RRID:AB_10585428	Per immunofluorescenza
Anti-Tbx6 (policlonale di capra)	Sistemi di ricerca e sviluppo	AF4744 RRID:AB_2200834	Per immunofluorescenza
Anti-Laminina111 (Policlonale di coniglio)	Sigma	L9393 RRID:AB_477163	Per immunofluorescenza
Anti-capra 488 (policlonale d'asino)	Sonde molecolari	A11055 RRID:AB_2534102	Per immunofluorescenza
Anti-coniglio 568 (policlonale d'asino)	ThermoFisher Scientific	A10042 RRID:AB_2534017	Per immunofluorescenza
Alcool benzilico (99+%)	(qualsiasi)	-	Utilizzato per eliminare gli embrioni (componente di BABB)
Benzoato di benzile (99+%)	(qualsiasi)	-	Utilizzato per eliminare gli embrioni (componente di BABB)
Albumina sierica bovina	Biowest	P6154	Per immunofluorescenza
Coverglass 20x20 mm #0	any)	-	Vetro di copertura spesso 100um
20x20 mm #1	(qualsiasi)	-	spesso 170um
20x60 mm #1.5	(qualsiasi)	-	Da utilizzare come " diapositive"
DAPI (4',6-Diamidino-2- Fenilindolo Dicloridrato)	Life Technologies	D3571	Per immunofluorescenza
Software Drishti	(open source)	-	Strumento software gratuito
EDTA	Sigma	ED2SS	Per la demineralizzazione
Software Fiji/ImageJ	(open source)	-	Strumento software gratuito
Glycine	NZYtech	MB01401	Per l'immunofluorescenza
Software Huygens	Scientific Volume Imaging-Strumento		software commerciale
HyClone ha definito il siero fetale bovino	GE Healthcare	#HYCLSH30070.03	Per l'imaging dal vivo
Soluzione di perossido di idrogeno 30 %	Milipore	1085971000	Per la pulizia
del software Imaris	Strumenti Bitplane / Oxford		Strumento software commerciale
iSpacers	SunJin Lab	(varia)	Utilizzare come distanziatori per preparati
L-glutammina	Gibco	#25030– 024	Per il mezzo di imaging dal vivo
DMEM a basso contenuto di glucosio	Gibco	11054020	Per il mezzo di imaging dal vivo
M2 medio	Sigma	M7167	Per sezionare embrioni
Metanolo	VWR	VWRC20847.307	Per fasi di disidratazione e reidratazione
Salicilato di metile	Sigma	M6752	Utilizzato per eliminare gli embrioni
Paraformaldeide	Sigma	P6148	Utilizzato in soluzione per fissare gli embrioni
Penicillina-streptomicina	Sigma	#P0781	Per terreno di imaging dal vivo
PBS (soluzione salina tamponata con fosfato)	Biowest	L0615-500-RapiClear
	SunJin Laboratory	RapiClear 1.52	Utilizzato per eliminare gli embrioni
Camere di ibridazione Secure-Sea	Sigma	C5474	Utilizzare come distanziatori per preparazioni
software simLab	SimLab	soft-Strumento	software commerciale
Vetrino, vetro concavo a depressione - 75x25 mm	(qualsiasi)	-	Per montare embrioni spessi.
Triton X-100	Sigma	T8787	Per immunofluorescenza

(Vetro di copertura

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wilson, V., Olivera-Martinez, I., Storey, K. G. Stem cells, signals and vertebrate body axis extension. Development. 136 (12), 2133(2009).
Dias, A., Aires, R. Axial Stem Cells and the Formation of the Vertebrate Body. Concepts and Applications of Stem Cell Biolog....

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