Method Article

Analisi della traduzione nel cervello del mouse in via di sviluppo utilizzando la profilazione polisome

DOI:

10.3791/62088

⸱

May 22nd, 2021

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology; Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Medical Genetics, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 3Alberta Children's Hospital Research Institute, University of Calgary

In This Article

Summary

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Lo sviluppo del cervello dei mammiferi richiede un adeguato controllo dell'espressione genica a livello di traduzione. Qui descriviamo un sistema di profilazione polisome con una piattaforma di gradiente di saccarosio e frazionamento facile da assemblare per valutare lo stato traslazionale degli mRNA nel cervello in via di sviluppo.

Abstract

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Il corretto sviluppo del cervello dei mammiferi si basa su un buon equilibrio tra proliferazione e differenziazione delle cellule staminali neurali in diversi tipi di cellule neurali. Questo equilibrio è strettamente controllato dall'espressione genica che viene messa a punto a più livelli, tra cui trascrizione, post-trascrizione e traduzione. A questo proposito, un crescente corpus di prove evidenzia un ruolo critico della regolamentazione traslizionale nel coordinamento delle decisioni sul destino delle cellule staminali neurali. Il frazionamento polisoma è un potente strumento per la valutazione dello stato traslazione dell'mRNA a livello genico globale e individuale. Qui presentiamo una pipeline di profilazione polisomaria internamente per valutare l'efficienza traslibrazionale nelle cellule dalla corteccia cerebrale del topo in via di sviluppo. Descriviamo i protocolli per la preparazione del gradiente di saccarosio, la lisi tissutale, l'ultracentrifugazione e l'analisi basata sul frazionamento dello stato traslazione dell'mRNA.

Introduction

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Durante lo sviluppo del cervello dei mammiferi, le cellule staminali neurali proliferano e si differenziano per generare neuroni e glia1,2 . La perturbazione di questo processo può portare ad alterazioni della struttura e della funzione cerebrale, come si vede in molti disturbi del neurosviluppo3,4. Il corretto comportamento delle cellule staminali neurali richiede l'espressione orchestrata di genispecifici 5. Mentre il controllo epigenetico e trascrizionale di questi geni è stato intensamente studiato, recenti scoperte suggeris....

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Protocol

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Tutto l'uso degli animali è stato supervisionato dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Calgary. I mouse CD1 utilizzati per l'esperimento sono stati acquistati da un fornitore commerciale.

1. Preparazione di soluzioni

NOTA Per prevenire la degradazione dell'RNA, spruzzare il workbench e tutte le apparecchiature con soluzione di decontaminazione RNasi. Per l'esperimento vengono utilizzate punte senza RNasi. Tutte le soluzioni sono preparate in acqua priva di RNasi.

  1. Preparare la soluzione di stock di cicloesiloide (100 mg/mL) in DMSO e conservare a -20 °C.
  2. Preparare 2,2 M di s....

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Results

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Come dimostrazione, il lisato corticale contenente 75 μg di RNA (raggruppato da 8 embrioni) è stato separato dal gradiente di saccarosio in 12 frazioni. Picchi di assorbanza UV a 254 nm hanno identificato frazioni contenenti la subunità 40S, la subunità 60S, il monosome 80S e i polisomi(Figura 4A). Analisi delle frazioni per macchia occidentale per la grande subunità ribosomiale, Rpl10 ha mostrato la sua presenza nella subunità 60S (frazione 3), monosome (frazione 4) e polisomei (frazioni 5-.......

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Discussion

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La profilazione polisoma è una tecnica comunemente usata e potente per valutare lo stato traslazione sia a livello di singolo gene che di genoma14 . In questo report, presentiamo un protocollo di profilazione polisoma utilizzando una piattaforma assemblata in casa e la sua applicazione per analizzare la corteccia del mouse in via di sviluppo. Questa piattaforma economica è facile da assemblare e generare gradienti di saccarosio robusti e riproducibili e profilazione polisoma con elevata sensibilit.......

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Disclosures

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato finanziato da un NSERC Discovery Grant (RGPIN/04246-2018 a G.Y.). G.Y. è una presidente di ricerca canadese. S.K. è stato finanziato dalla Mitacs Globalink Graduate Fellowship e dalla Borsa di studio per studenti laureati ACHRI.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Microprovette da 1,5 mL prive di RNAAxygenMCT-150-C
Piatto da 10 cmGreiner-Bio664160
1M MgCl2InvitrogenAM9530G
ago 21-23GBD305193
2M KClInvitrogenAM8640G
Siringa da 30 mLBD302832
Estremità smussata agoVWR20068-781
BreadboardThorlabsMB2530/M
Blu di bromofenoloSigma115-39-9
CD1 mouseCharles River Laboratory
Pinza a punta curvaSigma#Z168785
CycloheximideSigma66-81-9
Software di acquisizione dati TracerDAQMeasurement Computing Convertitore
Measurement ComputingUSB-1208LS
Kit miniprep RNA Direct-zol ZymoR2070
Ditiotreitolo (DTT)Bio-basic12-03-3483
DMSOBioshop67-68-5
Dumont No.5 pinzeSigma#F6521
Collettore di frazioniBio-RadModello 2110
HBSSWisent311-513-CL
Attuatore a stadio lineareRattmmotorCBX1605-100A
RNA di controllo della luciferasiPromegaL4561
Kit di sintesi del cDNA del primo filamento MaximaThemo FisherM1681
Morsetto a V in miniaturaThorlabsVH1/M
Breadboard serie miniThorlabsMSB7515/M
Perno ottico serie miniThorlabsMS2R/M
Base portapalo piedistallo serie miniThorlabsMBA1
NaClBio-basic7647-14-5
Terreni neurobasaliGibco21103-049
Ø Perno in alluminio da 12,7 mmThorlabsTRA150/M
ParafilmBemisPM992
PerfeCTa SYBR verdefastmix Quanta BioCA101414-274
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Wisent311-010-CL
PuromicinaBioshop58-58-2
Morsetto ad angolo rettoThorlabsRA90/M
Angolo retto & Oslash; 1/2" a Ø Morsetto per palo da 6 mmThorlabsRA90TR/M
Rnase AWAYMolecular BioProducts7002
Punte senza RNasiFrogga BioFT10, FT200, FT1000
Acqua priva di RNasiWisent809-115-CL
RNasinPromegaN2111
Staffa sottile ad angolo rettoThorlabsAB90B/M
Piccolo V-clampThorlabsVC1/M
Sodio desossicolatoSigma302-95-4
Driver per motori passo-passoSongHeTB6600
SaccarosioBioshop57501
SW 41 Rotore TiBeckman Coulter331362
Pompa a siringaHarvard Apparatus70-4500
Pompa a siringaHarvard Apparatus70-4500
Triton-X-100Bio-basic9002-93-1
TrizolThermofisher Scientific15596018
Tube piercerBrandelBR-184
UltracentrifugaBeckman CoulterL8-70M
Provette per ultracentrifugaBeckman Coulter331372
UltraPure 1M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027
UNO project super starter kitElegooEL-KIT-003
Monitor UVBio-RadEM-1 Econo
Staffa verticaleThorlabsVB01A/M
digitale

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Götz, M., Huttner, W. B. The cell biology of neurogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 777-788 (2005).
  2. Guillemot, F. Spatial and temporal specification of neural fates by transcription factor codes. Development. 134, 3771-3780 (2007).

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Polysome ProfilingTranslational RegulationMouse Brain DevelopmentSucrose GradientNeural Stem CellsmRNA TranslationUltracentrifugationFraction CollectionRibosomal SubunitsWestern Blot

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