Method Article

Generazione efficiente e scalabile di astrociti ventrali umani del mesencefalo da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

DOI:

10.3791/62095

⸱

October 2nd, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology Laboratories, School of Biochemistry, University of Bristol, Bristol, UK, 2Department of Physiology and Trinity College Institute of Neuroscience, Trinity College, Dublin, Ireland, 3Regenerative Medicine Laboratory, School of Clinical Sciences, University of Bristol, Bristol, UK

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, presentiamo un metodo per la generazione riproducibile di astrociti ventrali con pattern mesencefalico da hiPSC e protocolli per la loro caratterizzazione per valutare il fenotipo e la funzione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nella malattia di Parkinson, la progressiva disfunzione e la degenerazione dei neuroni della dopamina nel mesencefalo ventrale causano sintomi che cambiano la vita. La degenerazione neuronale ha diverse cause nel Parkinson, inclusi meccanismi autonomi non cellulari mediati dagli astrociti. In tutto il SNC, gli astrociti sono essenziali per la sopravvivenza e la funzione neuronale, poiché mantengono l'omeostasi metabolica nell'ambiente neurale. Gli astrociti interagiscono con le cellule immunitarie del SNC, la microglia, per modulare la neuroinfiammazione, che si osserva fin dalle prime fasi del Parkinson, e ha un impatto diretto sulla progressione della sua patologia. Nelle malattie con un elemento neuroinfiammatorio cronico, tra cui il Parkinson, gli astrociti acquisiscono un fenotipo neurotossico e quindi aumentano la neurodegenerazione. Di conseguenza, gli astrociti sono un potenziale bersaglio terapeutico per rallentare o arrestare la malattia, ma ciò richiederà una comprensione più profonda delle loro proprietà e dei loro ruoli nel Parkinson. Sono quindi urgentemente necessari modelli accurati di astrociti ventrali umani del mesencefalo per lo studio in vitro.

Abbiamo sviluppato un protocollo per generare colture ad alta purezza di astrociti specifici del mesencefalo ventrale (vmAstros) da hiPSC che possono essere utilizzati per la ricerca sul Parkinson. vmAstros può essere prodotto di routine da più linee hiPSC ed esprimere specifici marcatori astrocitici e ventrali del mesencefalo. Questo protocollo è scalabile e quindi adatto per applicazioni ad alto rendimento, anche per lo screening di farmaci. Fondamentalmente, i vmAstros derivati da hiPSC dimostrano caratteristiche immunomodulatorie tipiche delle loro controparti in vivo, consentendo studi meccanicistici della segnalazione neuroinfiammatoria nel Parkinson.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La malattia di Parkinson colpisce il 2%-3% delle persone di età superiore ai 65 anni, il che la rende il disturbo neurodegenerativo del movimentopiù diffuso 1. È causata dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici ventrali del mesencefalo all'interno della substantia nigra, con conseguenti sintomi motori debilitanti, nonché frequenti problemi cognitivi e psichiatrici2. La patologia del Parkinson è caratterizzata da aggregati della proteina, la α-sinucleina, che sono tossici per i neuroni e provocano la loro disfunzione e morte 1,2,3. Poiché i neuroni dopaminergici sono la popolazione degenerante del Parkinson, sono stati storicamente al centro della ricerca. Tuttavia, è evidente che un altro tipo di cellula nel cervello, gli astrociti, dimostra anche anomalie nel Parkinson e si ritiene che contribuisca alla degenerazione nei modelli di Parkinson 4,5,6,7.

Gli astrociti sono una popolazione cellulare eterogenea che può trasformarsi sia fisicamente che funzionalmente secondo necessità. Supportano la funzione e la salute neuronale attraverso una pletora di meccanismi, tra cui la modulazione della segnalazione neuronale, la modellazione dell'architettura sinaptica e il supporto trofico delle popolazioni neuronali attraverso la secrezione di fattori specifici 6,8,9,10. Tuttavia, gli astrociti hanno anche un ruolo immunomodulatore sostanziale, fondamentale per lo sviluppo e la propagazione della neuroinfiammazione10,11. La neuroinfiammazione è osservata nel cervello dei pazienti con Parkinson e recentemente è stato dimostrato in modo significativo che previene l'insorgenza dei sintomi del Parkinson 12,13,14,15, prendendo così il centro della ricerca sul Parkinson.

A livello cellulare, si dice che gli astrociti diventino reattivi in risposta a lesioni, infezioni o malattie, nel tentativo di facilitare la neuroprotezione 9,6,10,16. La reattività descrive un cambiamento nel fenotipo degli astrociti caratterizzato da cambiamenti nell'espressione genica, nel secretoma, nella morfologia e nei meccanismi di eliminazione dei detriti cellulari e dei sottoprodotti tossici 9,10,11,17. Questo cambiamento reattivo si verifica in risposta a segnali induttivi provenienti dalla microglia, che sono le cellule immunitarie del SNC e le prime a rispondere a lesioni e malattie9. Sia gli astrociti che la microglia rispondono ai segnali infiammatori moderando la propria funzione e possono trasdurre i segnali infiammatori e quindi influenzare direttamente la neuroinfiammazione 9,10. Tuttavia, la natura cronica del Parkinson si traduce in una transizione in cui gli astrociti reattivi diventano tossici per i neuroni e promuovono essi stessi la degenerazione e la patologia della malattia 6,9,10,18,19. Significativamente, è stato recentemente dimostrato che il blocco della trasformazione degli astrociti nel fenotipo neurotossico reattivo previene la progressione del Parkinson in modelli animali11. La reattività degli astrociti nel paradigma della neuroinfiammazione è quindi diventata uno dei principali obiettivi della ricerca sul Parkinson e allo stesso modo si riferisce a un ampio spettro di malattie del SNC. Insieme, questi risultati costruiscono un quadro di un significativo coinvolgimento astrocitario nell'eziologia del Parkinson, sottolineando la necessità di modelli di ricerca accurati che ricapitolino il fenotipo delle popolazioni di astrociti umani coinvolti nel Parkinson.

Nel cervello embrionale, i neuroni compaiono per primi, con la linea astrogliale, cioè gli astrociti e gli oligodendrociti, che appaiono più tardi nello sviluppo6. Studi in vivo e in vitro hanno evidenziato una serie di vie di segnalazione che sembrano controllare la potenza delle cellule progenitrici neurali dai derivati neuronali a quelli astrogliali. In particolare, la segnalazione JAK/STAT, EGF e BMP svolge un ruolo nella proliferazione, differenziazione e maturazione dell'astroglia20,21. Queste vie sono state al centro di protocolli in vitro per la generazione di astrociti da cellule pluripotenti, tra cui hiPSC 6,22,23. Ci sono stati molti esempi di successo di generazione di astrociti da hiPSCs 6,24,25. Tuttavia, è evidente che gli astrociti in vivo nel SNC possiedono specifiche identità regionali, che si riferiscono direttamente alla loro funzione, in accordo con i requisiti specifici di quegli astrociti in relazione ai loro vicini neuronali specializzati 17,24,25,26. Ad esempio, in relazione specificamente al mesencefalo ventrale, è stato dimostrato che gli astrociti in questa regione esprimono specifici insiemi di proteine, inclusi i recettori per la dopamina che consentono la comunicazione con la popolazione locale di neuroni dopaminergici del mesencefalo26. Inoltre, gli astrociti ventrali del mesencefalo dimostrano proprietà di segnalazione uniche26. Pertanto, per studiare il ruolo degli astrociti ventrali del mesencefalo nel Parkinson, abbiamo bisogno di un modello in vitro che rifletta il loro insieme unico di caratteristiche.

Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per generare astrociti ventrali del mesencefalo (vmAstros) da hiPSC. I vmAstros risultanti mostrano caratteristiche delle loro controparti mesencefaliche ventrali in vivo, come l'espressione di proteine specifiche, così come le funzioni immunomodulatorie. I risultati presentati provengono dalla differenziazione delle linee hiPSC NAS2 e AST23, che sono state derivate e donateci dal Dr. Tilo Kunath27. NAS2 è stato generato da un soggetto di controllo sano, mentre AST23 è derivato da un paziente di Parkinson portatore di una triplicazione nel locus che codifica per la α-sinucleina (SNCA). Queste linee hiPSC sono state precedentemente caratterizzate e utilizzate in una serie di articoli di ricerca pubblicati, anche per la generazione di vari tipi di cellule neurali 27,28,29,30,31.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Scongelamento, manutenzione e crioconservazione della linea hiPSC umana

  1. Per il rivestimento di piastre di coltura hiPSC, diluire la vitronectina a 5 μg/mL (1:100) in PBS a 1 mL per 10 cm2 di superficie della piastra di coltura cellulare. Lasciare agire per 1 ora a temperatura ambiente.
  2. Rimuovere la vitronectina e procedere immediatamente all'aggiunta di hiPSC/terreni di coltura alla piastra di coltura.
    NOTA Quando si rimuove la vitronectina dalla piastra, è fondamentale che la superficie della coltura non si asciughi.
  3. Per scongelare le hiPSC, rimuovere i crioviali contenenti hiPSC dall'azoto liquido e metterli a bagnomaria a 37 °C fino a quando il contenuto non si è completamente scongelato.
  4. Preparare 9 mL di terreno di coltura cellulare preriscaldato (ad es. E8 o E8 Flex) contenente 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell). Aggiungere 1 mL goccia per goccia al contenuto del crioviale. Mettere i restanti 8 mL di terreno in una provetta da centrifuga da 15 mL e a questa aggiungere il contenuto diluito del crioviale.
    ATTENZIONE: Non triturare il contenuto.
  5. Centrifugare a 150 x g per 3 min. Aspirare il liquido senza disturbare il pellet cellulare e risospeso in un volume appropriato di terreno di coltura cellulare (ad es. E8 o E8 Flex) contenente 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell). Ad esempio, 2 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
  6. Aggiungere le hiPSC risospese alle piastre rivestite di vitronectina e metterle in un'incubatrice a 37 °C/5% di CO2 .
    NOTA: le hiPSC dovrebbero iniziare ad attaccarsi alla plastica rivestita di vitronectina in 30 minuti-2 ore dopo lo scongelamento.
  7. Mantenere le hiPSC nel terreno di coltura cellulare (ad es. E8 o E8 Flex). Alimentare le cellule ogni giorno mediante scambio di terreni. Preriscaldare sempre i terreni di coltura per 30 minuti prima di somministrarli.
    NOTA Se si utilizza E8 Flex, le hiPSC non richiedono la sostituzione del fluido ogni 24 ore e gli incrementi di alimentazione possono essere estesi a 48 ore, se necessario. I terreni E8 Flex o E8 producono colture hiPSC di qualità uguale. Le HiPSC devono essere coltivate per un minimo di 14 giorni dopo lo scongelamento e prima di iniziare le fasi di differenziazione. Periodi di coltura inferiori a 14 giorni sembrano avere un impatto negativo sulla sopravvivenza delle hiPSC durante il periodo iniziale di differenziazione. HiPSC di passaggio a circa l'80% di confluenza (Figura 1A: intervallo di passaggio di 3-4 giorni).
  8. 1 ora prima dell'inizio, aggiungere 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell) alla coltura hiPSC.
  9. Lavare una volta le hiPSC con PBS (senza calcio o magnesio) e aggiungere 0,5 mM di EDTA (diluito dal magazzino in PBS senza calcio o magnesio).
  10. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, o fino a quando le hiPSC iniziano a staccarsi l'una dall'altra e assumono un aspetto più arrotondato, con i bordi di ciascuna iPSC che appaiono più luminosi al microscopio a campo chiaro.
  11. Aggiungere 200 μl di EDTA su un'area focalizzata delle hiPSC con una pipetta. Se si staccano facilmente, creando uno spazio libero nello strato cellulare, allora sono pronti per essere raccolti. Se non si staccano facilmente, lasciare in EDTA e ripetere dopo 1 minuto.
  12. Quando si è pronti per procedere, rimuovere delicatamente l'EDTA e, utilizzando una pipetta, lavare delicatamente le hiPSC due volte con un terreno di coltura cellulare (ad esempio, E8 o E8 Flex).
    NOTA: Per ottenere questo risultato senza che le hiPSC si stacchino, inclinare la piastra e aggiungere il terreno in senso gocciolare lungo il lato della piastra di coltura.
  13. Per raccogliere le hiPSC utilizzare 1 mL di terreno di coltura cellulare (ad es. E8 o E8 Flex) contenente 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell). Rilasciare il terreno direttamente sullo strato hiPSC e le cellule dovrebbero staccarsi. Se necessario, ripetere con un altro terreno da 1 mL.
  14. Osserva le hiPSC al microscopio. Idealmente, le hiPSC dovrebbero apparire in cluster relativamente uniformi, come mostrato nella Figura 1B. Se i cluster di hiPSC sono molto più grandi o di dimensioni molto variabili, utilizzare la pipetta per suddividere i cluster di hiPSC più grandi (Figura 1B).
    NOTA Non triturare eccessivamente le hiPSC. Sebbene l'integratore aumenti la sopravvivenza cellulare complessiva, la triturazione eccessiva ha un impatto negativo sulla sopravvivenza della coltura hiPSC. Si consigliano 1-4 passaggi con una pipetta.
  15. Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire la sospensione di hiPSC su una piastra rivestita di vitronectina come preparato al punto 1.1. Riportare la coltura hiPSC nell'incubatore a 37 °C/5% di CO2 .
    NOTA: Crioconservare le hiPSC a circa l'80% di confluenza.
  16. 1 ora prima dell'inizio, aggiungere 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell) alla coltura hiPSC.
  17. Staccare le hiPSC dalle piastre di coltura utilizzando EDTA 0,5 mM come descritto nella fase 1.4, raccogliendo le cellule nel terreno di coltura cellulare (ad es. E8 o E8 Flex) contenente 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell). Centrifugare a 150 x g per 3 min.
  18. Risospendere le hiPSC pellettate in mezzi di congelamento cellulare (vedere la tabella dei materiali). Utilizzare 700 μl per 10 cm2 di area di coltura, equivalenti a 1 crioviale di cellule per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
  19. Trasferire i crioviali in un recipiente di congelamento cellulare appropriato (per i dettagli vedere la Tabella dei materiali).
  20. Trasferire il recipiente di congelamento in un congelatore a -80 °C per 24 ore. Dopo 24 ore, i crioviali possono essere trasferiti in azoto liquido (-196 °C) per la conservazione a lungo termine.

2. Protocollo di differenziazione vmAstro

NOTA: Un riassunto schematico del protocollo di differenziazione vmAstros è mostrato nella Figura 1A. Un elenco dettagliato dei reagenti necessari per il protocollo e la loro preparazione è riportato nella Tabella 1.

  1. Induzione di vmNPCs
    NOTA: Questo protocollo è stato ottimizzato per iniziare con un minimo di 1x pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (10 cm2) di hiPSC con confluenza del 70%-80%, che è di circa 4-5 x 104 cellule/cm2 (Figura 1B)30. Il numero e la densità delle cellule iniziali devono essere ottimizzati per ogni linea hiPSC in quanto influiscono in modo significativo sulla sopravvivenza e sull'efficienza di differenziazione.
    1. Rimuovere il terreno di coltura cellulare dalle hiPSC e lavare 3 volte in DMEM/F12 + glutamax. Sostituire il terreno con 2 ml di terreno di induzione vmNPC (N2B27 + CHIR99021 + SB431542 + SHH(C24ii) + LDN193189. Vedere la Tabella 1 per i dettagli sulla preparazione dei terreni e dei reagenti).
    2. Nutri a giorni alterni con un cambio di mezzo terreno dopo 24 ore e un cambio completo del terreno a 48 ore.
      NOTA: dopo 3-4 giorni le impostazioni cultura vmNPC richiederanno il passaging. Si consiglia un rapporto di passaggio standard di 1:3 o 1:4, che deve essere ottimizzato per ogni linea hiPSC utilizzata.
    3. 1 ora prima del passaggio, aggiungere 1 integratore cellulare (ad es. Revitacell) alle vmNPC e preparare 1 matrice di membrana basale (ad es. Geltrex) in plastica per colture tissutali rivestite (sezione 2.2 Preparazione della matrice a membrana basale e rivestimento in plastica per colture di reparti).
    4. Rimuovere il supporto dai vmNPC e lavare 2 volte con D-PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione preriscaldata per il distacco di cellule (ad es. Accutase) per 10 cm2 di area di coltura (1 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti).
    5. Posizionare a 37 °C per 1 minuto e quindi esaminare le vmNPC utilizzando un microscopio a contrasto di fase.
      NOTA: I vmNPC inizieranno ad arrotondarsi, i loro processi si ritrarranno e appariranno degli spazi vuoti nello strato cellulare. Questo può richiedere da 1 a 3 minuti a seconda della densità cellulare.
    6. Quando le vmNPC assumono questo aspetto, aggiungere 100 μL di soluzione di distacco cellulare (ad esempio, Accutase) sullo strato di vmNPCs.
      NOTA: Se i vmNPC sono pronti per il distacco, apparirà un buco nello strato di celle. Se ciò non accade, le vmNPC richiedono un'ulteriore incubazione con una soluzione di distacco cellulare.
    7. Se le vmNPC si staccano facilmente, rimuovere delicatamente la soluzione di distacco cellulare e lavare le vmNPC 2 volte con terreni N2B27. Aggiungere delicatamente il terreno N2B27 lungo il lato del pozzetto o del recipiente di coltura e agitare delicatamente per lavare, assicurandosi che le vmNPC non si stacchino.
      NOTA: questo passaggio deve essere completato rapidamente per garantire che i vmNPC non si riattacchino alla superficie della cella. Se le vmNPC iniziano a staccarsi durante le fasi di lavaggio, raccoglierle tramite centrifugazione a 150 x g per 3 minuti. Le vmNPC non vengono centrifugate come standard durante il passaggio in quanto ciò può ridurre la loro sopravvivenza.
    8. Infine, rimuovere le vmNPC utilizzando una pipetta, espellendo energicamente il terreno di induzione vmNPC contenente 1x integratore cellulare (ad esempio, Revitacell) direttamente sullo strato cellulare. Questo dovrebbe rimuovere le vmNPC, che possono quindi essere trasferite direttamente nei nuovi recipienti di coltura rivestiti con matrice.
      NOTA: Non riutilizzare i terreni che contengono già vmNPC risospese per rimuovere ulteriori cellule, poiché ciò comporterebbe la loro sovratriturazione, che ne ridurrebbe la sopravvivenza.
    9. Sostituire in un incubatore a 37 °C/5% CO2 . Le vmNPC dovrebbero iniziare ad attaccarsi alla superficie rivestita di matrice dopo 20-30 minuti. Sostituire metà del terreno con un terreno di induzione vmNPC fresco (senza supplemento cellulare) dopo 24 ore e continuare il programma di alimentazione come in precedenza.
    10. Continua il regime di alimentazione e passaggio per 10 giorni.
  2. Preparazione della matrice della membrana basale e rivestimento della plastica per colture tissutali
    NOTA: Per la manutenzione delle vmNPC viene utilizzata 1 matrice di membrana basale (ad es. Geltrex) per il rivestimento di articoli in plastica. Per la manutenzione di vmAPC o vmAstros, è possibile utilizzare una matrice a membrana basale 0,25x.
    1. Rimuovere la matrice della membrana basale da un congelatore a -80 °C e metterla in frigorifero a 4 °C per una notte a scongelare.
    2. Diluire 1:10 con DMEM/F12 ghiacciato + glutamax, aliquotare e conservare a -80 °C come brodo 10x.
    3. Quando si rivestono gli articoli in plastica, diluire questo stock 10x a 1x (per vmNPC) o 0,25x (per vmAPC o vmAstros) con DMEM/F12 + glutamax ghiacciato.
    4. Aggiungere immediatamente alla coltura tissutale plastica a 1 mL per 10 cm2, ad esempio, 1 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
    5. Portare a 37 °C per 1 ora. La soluzione della matrice della membrana basale non deve essere rimossa dalla plastica fino al momento dell'aggiunta di terreni/celle per garantire che la plastica rivestita non si asciughi. Le piastre rivestite a matrice non richiedono il lavaggio prima dell'aggiunta delle celle.
  3. Espansione dei vmNPC
    1. Il giorno 10 del protocollo, sostituire il terreno di induzione con il mezzo di espansione vmNPC (N2B27 + GDNF + BDNF + acido ascorbico. Vedere la Tabella 1 per i dettagli sulla preparazione dei terreni e dei reagenti).
      NOTA: Le vmNPCs non richiedono l'aggiunta di mitogeni per indurre la proliferazione. BDNF, GDNF e acido ascorbico supportano la sopravvivenza e il mantenimento delle vmNPCs30.
    2. Nutri a giorni alterni con un cambio di mezzo terreno dopo 24 ore e un cambio completo del terreno a 48 ore.
      NOTA: dopo 3-4 giorni, le impostazioni cultura vmNPC richiederanno il passaging. Per il passaggio, si consiglia un rapporto di passaggio standard di 1:3 o 1:4 (che deve essere ottimizzato per ogni linea hiPSC utilizzata). Determinare il rapporto che offre la migliore sopravvivenza, proliferazione e generazione di vmNPCs).
    3. 1 ora prima del passaggio, aggiungere 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell) alle vmNPC e preparare in anticipo 1x piastre/flaconi rivestiti di matrice (sezione 2.2 Preparazione della matrice della membrana basale e del rivestimento della plastica di coltura del rep). Preriscaldare la soluzione di distacco cellulare (ad es. accutasi) a 37 °C. Preriscaldare il terreno di espansione vmNPC fresco contenente 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell).
    4. Rimuovi i media dai vmNPC e lavali 2 volte con D-PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione per il distacco di cellule (ad es. Accutase) per 10 cm2 di area di coltura (1 mL per pozzetto di una piastra a 6 pozzetti). Posizionare a 37 °C per 1 minuto e quindi esaminare le vmNPC utilizzando un microscopio a contrasto di fase.
      NOTA: I vmNPC inizieranno ad arrotondarsi, i loro processi si ritrarranno e appariranno degli spazi vuoti nello strato cellulare. Questo può richiedere da 1 a 3 minuti a seconda della densità cellulare.
    5. Quando le vmNPC assumono un aspetto arrotondato, aggiungere 100 μL di soluzione di distacco cellulare (ad es. Accutase) sullo strato di vmNPC.
      NOTA: Se i vmNPC sono pronti per il distacco, apparirà un buco nello strato di celle. Se ciò non accade, le vmNPC richiedono un'ulteriore incubazione con la soluzione di distacco cellulare.
    6. Se le vmNPC si staccano facilmente, rimuovere delicatamente la soluzione di distacco cellulare e lavare le vmNPC 2 volte con terreno N2B27. Aggiungere delicatamente il terreno N2B27 lungo il lato del pozzetto o del recipiente di coltura e agitare delicatamente per lavare, assicurandosi che le vmNPC non si stacchino.
      NOTA: Se le vmNPC iniziano a staccarsi in gran numero nelle fasi di lavaggio, raccoglierle tramite centrifugazione a 150 x g per 3 minuti. Le vmNPC non vengono centrifugate come standard durante il passaggio in quanto ciò può ridurre la loro sopravvivenza. Questo passaggio deve essere completato rapidamente per garantire che le vmNPC non si riattacchino alla superficie della cella.
    7. Rimuovere le vmNPC utilizzando una pipetta ed espellere energicamente il terreno di espansione vmNPC contenente 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell) direttamente sullo strato cellulare. In questo modo si dovrebbero rimuovere le vmNPC, che possono quindi essere trasferite direttamente nelle piastre/matracci rivestite di matrice pre-preparate (vedere la sezione 2.2 «Preparazione della matrice della membrana basale e del rivestimento di plastica per colture tissutali»).
      NOTA: Non riutilizzare i terreni che contengono già vmNPC risospese per rimuovere ulteriori cellule, poiché ciò comporterebbe la loro sovratriturazione, che ne ridurrebbe la sopravvivenza.
    8. Sostituire in un incubatore a 37 °C/5% CO2 . Le vmNPC dovrebbero iniziare ad attaccarsi alla superficie rivestita della matrice dopo 20-30 minuti. Dopo 24 ore, sostituire metà del terreno di coltura con un nuovo terreno di espansione vmNPC (senza supplemento cellulare) e continuare il programma di alimentazione precedente.
    9. Continua questo regime di alimentazione e passaggio per 10 giorni. I vmNPC possono essere espansi fino al giorno 50.
  4. Differenziazione ed espansione delle vmAPC
    NOTA: i vmNPC possono essere utilizzati con successo per la generazione di vmAPC/vmAstros ovunque tra i 30 e i 50 giorni dallo stadio iniziale di hiPSC (Figura 1A).
    1. Prendere una coltura vmNPC confluente e lavare vmNPC 3 volte in DMEM/F12 avanzato per rimuovere le tracce dei componenti dei mezzi di espansione vmNPC. Sostituire il supporto con il supporto di espansione vmAPC (supporto ASTRO +EGF +LIF. Vedere la Tabella 1 per i dettagli sulla preparazione dei terreni e dei reagenti).
    2. Dopo 72 ore di passaggio, la coltura vmNPC è ad un rapporto elevato (1:7,5). Ad esempio, supponendo che le vmNPC siano state mantenute in un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, dovrebbero ora essere fatte passare in un pallone da 75 cm2 rivestito con matrice 1x (rivestito come descritto nella sezione 2.2 "Preparazione della matrice della membrana basale e rivestimento della plastica per colture tissutali"). Passaggio utilizzando una soluzione di distacco cellulare, come descritto per le vmNPC nella sezione 2.3 «Espansione delle vmNPC».
    3. Risospendere i vmNPC in un volume appropriato di supporti di espansione vmAPC (7,5-15 ml di supporti per 75 cm2 matraccia). Completare le sostituzioni dei supporti ogni 3 giorni o in base alle esigenze delle celle.
      NOTA: Da questo momento in poi, le vmNPC sono indicate come vmAPC e devono essere passate come singole celle piuttosto che come cluster di cellule. Le vmAPC devono essere passate ogni 3-7 giorni o quando diventano confluenti per evitare di diventare sovraconfluenti. Da questo punto in poi, la concentrazione ridotta della matrice 0,25x deve essere utilizzata per rivestire la plastica (come descritto nella sezione 2.2, Preparazione della matrice della membrana basale e rivestimento della plastica per colture tissutali).
    4. Espandere le vmAPC fino a raggiungere il giorno 90 (dalla fase hiPSC), crioconservando le vmAPC in vari punti della loro espansione.
  5. Generazione di vmAstros maturi da vmAPC
    NOTA: In questa fase, le vmAPC possono essere coltivate in fiasche per colture tissutali da 175 cm2 . Questo può essere ampliato per la generazione di un gran numero di vmAstros maturi.
    1. Quando i vmAPC raggiungono l'80% di confluenza, lavare 3 volte con i terreni ASTRO e sostituirli con i mezzi di maturazione vmAstros (ASTRO media +BMP4 +LIF. Vedere la Tabella 1 per i dettagli sulla preparazione dei terreni e dei reagenti).
    2. Effettuare un cambio completo del terreno ogni 3 giorni, o come richiesto dalle cellule, per 10 giorni.
      NOTA: a) A questo punto, la caratterizzazione indica che i vmAstros sono maturi, come confermato dall'immunocitochimica (Figura 2G - I) e dall'analisi dell'espressione genica (manoscritto in preparazione). b) i vmAstros utilizzati immediatamente dopo la maturazione devono essere riplaccati su una superficie rivestita di matrice appena preparata. Mantenere vmAPC o vmAstros sulla stessa superficie di coltura per oltre 14 giorni potrebbe portare a colture non ottimali, in cui le cellule iniziano a ridursi di dimensioni e persino a staccarsi. c) Per le applicazioni che esaminano la modulazione neuroinfiammatoria, BMP e LIF vengono rimossi 72 ore prima della stimolazione neuroinfiammatoria. Questo per evitare qualsiasi potenziale interazione tra la segnalazione BMP/LIF e la segnalazione neuroinfiammatoria indotta.
    3. vmAstros può ora essere ri-placcato per saggi sperimentali, ad esempio, su vetrini coprioggetti per immunocitochimica o crioconservato per applicazioni future (sezioni 3, 4).
      NOTA: Il passaggio non dovrebbe essere necessario in questa fase del protocollo, poiché la proliferazione dovrebbe avvenire solo a un tasso molto basso. Le vmAPC placcate troppo densamente in questa fase mantengono livelli più elevati di proliferazione. In questo caso, passare e dividere le celle per ottenere una densità come mostrato nella Figura 1F.

3. Crioconservazione di vmNPC, vmAPC e vmAstros

NOTA: Cryopreserve vmNPCs/vmAPCs/vmAstros alla piena confluenza.

  1. 1 ora prima dell'inizio, aggiungere 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell) alla coltura. Riempire il recipiente di crioconservazione (vedi Tabella dei materiali) con isopropanolo a temperatura ambiente.
  2. Staccare le cellule dalle piastre di coltura utilizzando la soluzione di distacco cellulare come descritto in precedenza, raccogliendo le cellule in terreni appropriati (terreni N2B27 o ASTRO) contenenti 1x integratore cellulare (ad es. Revitacell). Centrifugare a 150 x g per 3 min.
  3. Risospendere i volumi di vmNPC/vmAPCs/vmAstros pellettati in mezzi di congelamento cellulare (vedere la Tabella dei materiali) come segue (passaggi 3.3.1. - 3.3.3.)
    1. Per le vmNPC: utilizzare 700 μl per 10 cm2 di area di coltura, in 1 crioviale.
    2. Per le vmAPC: utilizzare 700 μl per 60 cm2 di area di coltura, in 1 crioviale (circa 1/3 di un matraccio di coltura T175).
    3. Per vmAstros: risospendere in 2 mL di media e contare il numero di vmAstros. Ricentrifugare e risospendere in mezzi di congelamento cellulare (vedere la tabella dei materiali) a un numero per crioviale appropriato per applicazioni future. Ipotizzando una perdita di cellule approssimativa del 15% dovuta al congelamento-scongelamento, i vmAstro appena scongelati vengono contati e piastrati con un numero di cellule in eccesso del 15% per compensare la morte cellulare nel processo di congelamento-scongelamento. Ciò equivale quindi a 74.750 vmAstros per cm2. I vmAstro scongelati vengono mantenuti per 72 ore in terreni ASTRO prima del test.
  4. Trasferire i crioviali in un recipiente di congelamento delle celle (per i dettagli vedere la Tabella dei materiali) e trasferire il recipiente di congelamento in un congelatore a -80 °C per 24 ore. Dopo 24 ore, i crioviali possono essere trasferiti in azoto liquido (-196 °C) per la conservazione a lungo termine.

4. Caratterizzazione del fenotipo vmAstro

  1. Immunocitochimica
    1. Posizionare 100-200 vetrini coprioggetti da 13 mm in piastre di Petri di vetro su uno strato di carta da filtro e sterilizzarli in autoclave asciutta.
    2. Trasferire i vetrini coprioggetti in pozzetti di piastre a 4 o 24 pozzetti utilizzando una pinza sterile. Aggiungere 1 soluzione di matrice (ad es. Geltrex) sui vetrini coprioggetti sotto forma di goccioline da 50 μl e incubare a 37 °C per 1 ora.
    3. Passaggio o scongelamento vmAstros, risospendere in ASTRO media ed effettuare un conteggio. Piastra vmAstros a 25-100.000 cellule per vetrino coprioggetti in una goccia da 50 μL.
    4. Rimuovi la matrice dal vetrino coprioggetti e aggiungi immediatamente vmAstros in una goccia di supporto. Posizionare a 37 °C per 30 minuti e quindi inondare i pozzetti con altri 250 μL di terreno ASTRO.
      NOTA: Se si esegue l'immunocitochimica per verificare semplicemente l'espressione dei marcatori degli astrociti e del mesencefalo, vmAstros può essere fissato 24 ore dopo la piastra.
    5. Preparare una soluzione di formaldeide al 4% diluendo la soluzione di formaldeide al 36% 1:9 in D-PBS.
    6. Lava vmAstros 1x con D-PBS. Aggiungere immediatamente il 4% di formaldeide ai pozzetti e lasciare a temperatura ambiente per 10 min.
    7. Rimuovere la formaldeide e sostituirla con D-PBS. Conservare a 4 °C o procedere all'immunocitochimica.
    8. Lavare i vetrini coprioggetti nei pozzetti 3 volte con D-PBS. Permeabilizzare e bloccare in siero di capra al 10%, BSA all'1% in PBTx allo 0,1% (D-PBS + 1:1000 Triton-X) per 1 ora a temperatura ambiente.
    9. Aggiungere anticorpi primari (Tabella dei materiali) in siero di capra all'1%, BSA allo 0,1% in PBTx allo 0,1% (D-PBS + 1:1000 Triton-X) e incubare per una notte a 4 °C su un bilanciere.
    10. Il giorno successivo, rimuovere gli anticorpi primari e lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con D-PBS.
    11. Aggiungere anticorpi secondari appropriati (Tabella dei materiali) in siero di capra all'1%, BSA allo 0,1% in PBTx allo 0,1% e incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente e proteggerlo dalla luce su un bilanciere. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con D-PBS.
    12. Aggiungere la soluzione DAPI (0,1 μg/mL di DAPI in D-PBS) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con D-PBS.
    13. Per montare il vetrino, aggiungere una goccia da 5 μL di terreno di montaggio Mowiol/DABCO [12% Mowiol (p/v), 12% glicerolo (p/v) sciolto per una notte agitando in 0,2 M Tris (pH 8,5) con 25 mg/mL di 1,4-diazabicelo[2.2.2]ottano (DABCO)] a un vetrino da microscopio. Utilizzando una pinza, rimuovere con cautela il vetrino coprioggetti dal pozzo; tamponare il bordo del vetrino coprioggetti sul fazzoletto per rimuovere il liquido in eccesso e posizionare vmAstros con il lato rivolto verso il basso sulla gocciolina di Mowiol/DABCO.
    14. Ripetere l'operazione per ogni vetrino coprioggetti e lasciare asciugare per 8 ore prima dell'esame microscopico.
  2. Misura ELISA della secrezione di IL-6 da parte di vmAstros in risposta al trattamento con citochine
    NOTA: Dopo la maturazione di 10 giorni con BMP4 e LIF, vmAstros deve essere fatto passare, contare e placcare su plastica per colture tissutali rivestita con matrice 0,25x (come descritto in Sezione 2.2Preparazione della matrice della membrana basale e rivestimento della plastica per colture tissutali), con una densità di 65.000 vmAstros per cm2 in ASTRO media. BMP4 e LIF devono essere rimossi dal vmAstros 72 ore prima del trattamento con citochine poiché la segnalazione attiva di questi fattori può interferire con l'efficacia del trattamento con citochine. In alternativa, i vmAstros crioconservati possono essere scongelati e utilizzati per i saggi.
    1. Il giorno del test, lavare delicatamente vmAstros 3x in terreno non redox (DMEM/F-12 + glutamax + N2).
    2. Utilizzare un pozzetto di controllo non trattato e trattato con citochine per il confronto. Aggiungere la citochina scelta a concentrazione ottimizzata. I dati nella Figura 2J - L sono stati generati utilizzando IL-1α a 3 ng/mL9 in terreni non redox a 1 mL per 10 cm2 di area di coltura cellulare.
    3. Sostituire vmAstros in un incubatore a 37 °C/5% CO2 per 24 ore. Dopo 24 ore, raccogliere i terreni di coltura in provette sterili per microfuge.
    4. Se l'ELISA non viene eseguito immediatamente, prelevare i campioni di terreno di congelamento immergendo le provette per microfugi nell'azoto liquido e conservarli a -80 °C per analisi future.
      NOTA: Il seguente protocollo è ottimizzato specificamente per l'uso con il kit ELISA IL-6 descritto nella Tabella dei materiali. Gli anticorpi e gli standard forniti come polvere liofilizzata in un nuovo kit ELISA devono essere ricostituiti prima del primo utilizzo e aliquotati per un uso futuro. La scheda tecnica fornita con il kit descrive in dettaglio i reagenti e i volumi necessari per la ricostituzione. L'anticorpo di cattura deve essere ricostituito in PBS (senza proteina trasportatrice).
    5. Eseguire l'ELISA in un formato di piastra a 96 pozzetti e calcolare i volumi dei reagenti in base ai pozzetti utilizzati. Il giorno dell'ELISA, preparare l'anticorpo di cattura diluendo il materiale 1:120 in PBS. Rivestire la piastra caricando 50 μL di anticorpo di cattura per pozzetto. Coprire la piastra con una striscia adesiva e incubare a temperatura ambiente per una notte.
    6. Il giorno successivo, lavare la piastra 3 volte con D-PBS-Tween (D-PBS con 0,05% Tween-20), 100 μL per pozzetto. Asciugare a secco.
    7. Bloccare la piastra caricando 150 μL D-PBS/1% BSA per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per almeno 1 ora. Lavare la piastra come descritto.
    8. Scongelare i campioni su ghiaccio (questo può richiedere 1-2 ore). Diluire i campioni 1:5 caricando 10 μL di campione e 40 μL DI D-PBS/1% BSA. Agitare ogni campione prima del caricamento.
      NOTA: È necessario diluire i campioni quando si esegue un ELISA IL-6, le diluizioni devono essere ottimizzate.
    9. Preparare lo standard superiore (1.000 ρg/mL) diluendo il materiale 1:180 in D-PBS/1% BSA. Preparare 7 standard effettuando una diluizione seriale dello standard superiore. Vortice tra ogni diluizione.
    10. Aggiungere 50 μl di standard/campioni ai pozzetti. Utilizzare D-PBS/1% BSA come vuoto. Incubare a temperatura ambiente per 2 ore su un agitatore orbitale per miscelare correttamente i campioni diluiti. Lavare la piastra come descritto.
    11. Preparare l'anticorpo di rilevamento diluendo il materiale 1:60 in D-PBS/1% BSA. Caricare 50 μL di anticorpo di rilevamento per pozzetto. Coprire la piastra e incubare a RT per 2 ore. Lavare la piastra come descritto.
    12. Preparare la streptavidina coniugata alla perossidasi di rafano (Strep-HRP) diluendo il brodo 1:40 in D-PBS/1% BSA. Caricare 50 μL di Strep-HRP per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. Lavare la piastra come descritto.
    13. Avviare la reazione cromatica caricando 50 μL di soluzione di substrato TMB per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente al buio per 20 minuti (o fino a quando gli standard e i campioni non hanno sviluppato un colore blu).
      NOTA: Il TMB viene conservato a 4 °C ma deve essere utilizzato a temperatura ambiente.
    14. Arrestare la reazione aggiungendo 25 μL di soluzione di arresto (1 M H2SO4) per pozzetto e notare il cambiamento di colore da blu a giallo.
    15. Leggere la piastra con un'assorbanza di 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre. Impostare la correzione della lunghezza d'onda su un'assorbanza di 540 nm per massimizzare la precisione. Calcolare le concentrazioni proteiche nei campioni dalla curva standard prodotta.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metodologia di differenziazione e progressione
Qui presentiamo i dettagli sia dei metodi impiegati per la generazione di vmAstros che dei protocolli utilizzati per la loro successiva caratterizzazione fenotipica. Il metodo per la generazione di vmAstros è costituito da diversi stadi di differenziazione distinti, che possono essere monitorati al microscopio e identificando caratteristiche morfologiche distinte (Figura 1A-F). Una coltura di...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo metodo per la generazione di vmAstros da hiPSC è altamente efficiente, generando colture pure di vmAstros ed essendo riproducibile per la generazione di vmAstros da diverse linee hiPSC. Questo protocollo è stato sviluppato attorno alla ricapitolazione degli eventi di sviluppo necessari nell'embrione per modellare correttamente il mesencefalo in via di sviluppo e generare astrociti e comprende tre fasi definite: 1) induzione del mesencefalo ventrale neurale per generare vmNPCs, 2) ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione del progetto Parkinson's UK (G-1402) e da una borsa di studio. Gli autori ringraziano la Wolfson Bioimaging Facility per il loro supporto e assistenza in questo lavoro.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagenti
0,2M Tris-Cl (pH 8,5)n/an/aComposto da base Tris e più HCl
0,5M EDTA, PH 8ThermoFisher  15575-0201:1000 in D-PBS a 0,5 mM finale 
1,4-diazabicilone[2.2.2]ottano (DABCO)SigmaD27802-  25 mg/mL in Mowiol soluzione di montaggio
vetrini coprioggetti da 13 mmVWR631-0149
2-Mercaptoetanolo (50 mM)ThermoFisher31350010
AccutaseThermoFisher13151014
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634010Ha 1x NEAA ma aggiungiamo alla concentrazione finale di 2x (0,2 mM)
Acido ascorbicoSigmaA5960200 mM di stock, da 1:1000 a 200 &; M final
B27 SupplementThermoFisher17504-04450x stock
BSASigma5470
Mezzi di congelamento cellulareSigmaC2874Cryostor CS10
Recipiente di congelamento cellulareNalgene5100-0001
CHIR99021Axon Medchem1386stock da 0,8 mM, diluizione 1:1000 a 0,8 &; M
Cryovials  SigmaCLS430487
DAPI SigmaD95421 mg/mL, da 1:10.000 a 100 ng/mL finale (in PBS)
DMEM/F12 + GlutamaxThermoFisher10565018
Dulbeccos-PBS (D-PBS senza Mg o Ca)ThermoFisher14190144pH 7,2
E8 Kit terreno flessibileThermoFisherA2858501
Formaldeide (soluzione al 36%)Sigma47608
GeltrexThermoFisherA14133021:100 o 1:400 in DMEM/F12
Glutamaxghiacciato ThermoFisher350500382 mM di stock (1:200 in N2B27, 1:100 in media ASTRO a 20 &; M finale) 
GliceroloSigmaG5516
BDNF umano Peprotech450-0220 & micro; g/mL di brodo, da 1:1000 a 20 ng/mL finale
BMP4 umanoPeprotech120-0520 µ g/mL stock, da 1:1000 a 20 ng/mL finale
EGF umanoPeprotechAF-100-1520 µ g/mL di brodo, da 1:1000 a 20 ng/mL finale
GDNF umanoPeprotech450-1020 µ g/mL di riserva, da 1:1000 a 20 ng/mL finale
Soluzione di insulina umanaSigma I927810 mg/mL stock, da 1:2000 a 5 &; g/mL finale
Umano LIFPeprotech300-0520 µ g/mL di riserva, da 1:1000 a 20 ng/mL finale
IL-6 Kit ELISABiotechneDY206
IsopropanoloSigma  I9516-4LPer il riempimento del recipiente di crioconservazione Mr Frosty
LDN193189SigmaSML0559100 &; Stock M, diluizione 1:10.000 a 10 nM finale
Mowiol 40-88Sigma324590
N2 SupplementThermoFisher17502048100x stock
NEAAThermoFisher1114003510 mM stock, da 1:100 a 0,1 mM finale 
Terreni neurobasaliThermoFisher21103049
Siero di capra normaleVector LabsS-1000-20
RevitacellThermoFisherA2644501100x stock, da 1:100 a 1x SB431542 finale
Tocris161410 mM stock, diluizione 1:1000 a 10 &; M finale
SHH-C24iiBiotechne1845-SH-025200 µ g/mL di stock, da 1:1000 a 200 ng/mL finale
Tris-HClSigma PHG0002 
Triton-XSigmaX100
Tween-20SigmaP7949
VitronectinaThermoFisherA147001:50 in D-PBS
Anticorpi per immunocitochimica  AziendaNumero di catalogoSpecie ospite
Anticorpo contro S100bSigmaSAB4200671Mouse; Anticorpo 1:200
contro FOXA2SCBTNB600501Mouse; 1:50
Anticorpo contro LMX1AProSci7087Rabbit; 1:300
Anticorpo contro LMX1AMilliporeAB10533Coniglio; 1:2000
Anticorpo contro LMX1BProteintech18278-1-APConiglio; 1:300
Anticorpo contro GLASTProteintech20785-1-APConiglio; 1:300
Anticorpo contro GFAPDakoZ0334Coniglio; 1:400
Anticorpo contro CD49fProteintech27189-1-APConiglio; 1:100
Anticorpo contro MSI1Abcamab52865Coniglio; 1:400
Alexa Fluor 488 Capra Anti-Coniglio ThermoFisherA32731Capra; 1:500
Alexa Fluor 488 Capra Anti-TopoThermoFisherA32723Capra; 1:500
Alexa Fluor 568 Capra Anti-ConiglioThermoFisherA11036Capra; 1:500
Alexa Fluor 488 Capra Anti-TopoThermoFisherA11031Capra; 1:500
finali

References

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