Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Summary

L'ozono combinato e i topi esposti all'endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l'interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l'aumento dell'espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l'angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.

Abstract

I polmoni si trovano continuamente di fronte a insulti diretti e indiretti sotto forma di condizioni infiammatorie sterili (particelle o tossine reattive) e infettive (batteriche, virali o fungine). Una risposta ospite travolgente può comportare respirazione compromessa e lesioni polmonari acute, che è caratterizzata dal reclutamento di neutrofili polmonari a seguito della risposta immunitaria, coagulativa e rimodellante dei tessuti dell'ospite pato-logico. Metodi microscopici sensibili per visualizzare e quantificare gli adattamenti cellulari polmonari murini, in risposta all'ozono a basse dosi (0,05 ppm), un potente inquinante ambientale in combinazione con lipopolysaccharide batterico, un agonista TLR4, sono cruciali per comprendere i meccanismi infiammatori e riparatori dell'ospite. Descriviamo un'analisi microscopica fluorescente completa di vari compartimenti polmonari e sistemici del corpo, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare, il perfusato vascolare polmonare, le criosezioni polmonari sinistra e il perfusato di midollo osseo sternale. Mostriamo danni di macrofagi alveolari, neutrofili, tessuto parenchimico polmonare, così come cellule del midollo osseo in correlazione con una risposta immunitaria ritardata (fino a 36-72 ore) che è contrassegnata da gradienti discreti di chemiochina nei compartimenti analizzati. Inoltre, presentiamo la matrice extracellulare polmonare e le interazioni citoscheletriche cellulari (actina, tubulina), specie di ossigeno mitocondriale e reattivo, plasminogeno antico coagulativo, angiostatina del frammento peptidico anti-angiogenico, subunità V complesso mitocondriale di ATP sintasi, α e β. Questi marcatori surrogati, se integrati con adeguati saggi a base cellulare in vitro e tecniche di imaging animale in vivo come la microscopia intravitale, possono fornire informazioni vitali per comprendere la risposta polmonare a nuovi agenti immunomodulatori.

Introduction

La lesione polmonare acuta (ALI) è una risposta patologica cruciale dei polmoni a stimoli infettivi o altri stimoli dannosi che è contrassegnata dall'attivazione simultanea di sistemi immunitari coagulativi, fibrinolitici e innati¹. I neutrofili percepisce prontamente modelli di danni microbici e intracellulari attraverso la famiglia di recettori simili a pedaggio (TLR)^2,3,4. I neutrofili rilasciano citochine preformate e contenuti di granuli citotossici, che possono quindi causare danni collaterali ai tessuti. Il conseguente danno alveolare è rovinato dalla morte cellulare secondaria che porta al rilascio di molecole come il trifosfato di adenosina (ATP)⁵, stabilendo così in un circolo vizioso di disregolazione immunitaria.

Un problema irrisolto nella comprensione dell'ALI si riferisce alla questione di come la lesione sia iniziata all'interno della membrana alveolare. Il complesso di trasporto elettronico V, F1F0 ATP sintasi, è una proteina mitocondriale nota per essere espressa onnipresentemente, sulla membrana plasmatica cellulare (inclusa endoteliale, leucocita, epiteliale) durante l'infiammazione. Il citoscheletro cellulare, composto da actina e tubulina, ospita rispettivamente molte forme cellulari e funzioni modulanti, nonché proteine mitocondriali. Abbiamo recentemente dimostrato che il blocco dell'ATP sintasi da parte di una molecola endogena, angiostatina, silenzia il reclutamento neutrofilo, l'attivazione e l'infiammazione polmonare indotta dal lipopolysaccharide (LPS)⁶. Pertanto, sia i meccanismi biochimici (ATP sintasi) che immunitari (TLR4) potrebbero regolare la barriera alveolare durante l'infiammazione polmonare.

L'esposizione all'ozono (O_3),un inquinante ambientale, compromette la funzione polmonare, aumenta la suscettibilità alle infezioni polmonari e brevi bassi livelli di esposizioni O₃ aumentano il rischio di mortalità in quelli con condizioni cardiorespiratorie sottostanti^{7,8,9,10,11,12,13,14}. Pertanto, l'esposizione a concentrazioni fisiologicamente rilevanti di O₃ fornisce un modello significativo di ALI per studiare i meccanismi fondamentali dell'infiammazione^7,8. Il nostro laboratorio ha recentemente stabilito un modello murino di ALI¹⁵indotto da O₃ a basso consumo. Dopo aver eseguito una dose e una risposta nel tempo a basse concentrazioni di O_3, abbiamo osservato che l'esposizione a 0,05 ppm O₃ per 2 ore, induce una lesione polmonare acuta che è contrassegnata dalla subunità V complessa di ATP sintasi polmonare β (ATPβ) e dall'espressione di angiostatina, simile al modello LPS. L'imaging polmonare intravitale ha rivelato la disorganizzazione dei microfilamenti di actina alveolare che indicano danni polmonari, e l'ablazione dei livelli di ossigeno reattivo del setto alveolare (ROS) (che indica l'abrogazione della segnalazione cellulare basale) e del potenziale della membrana mitocondriale (che indica la morte acuta delle cellule) dopo 2 h di esposizione a 0,05 ppm O₃^{15 che} era correlato con un polmone eterogeneo ¹⁸ritenzione di FDG¹⁶, reclutamento neutrofilo e rilascio di citochine, in particolare IL-16 e SDF-1α. Il messaggio da portare a casa dai nostri recenti studi è che O 3 produce tossicità esponenzialmente_elevata se esposto a concentrazioni inferiori ai limiti consentiti di 0,063 ppm su 8 h (al giorno) per l'esposizione umana. È importante sottolineare che non esiste una chiara comprensione se queste esposizioni subclinica O₃ possano modulare meccanismi mediati da TLR4 come l'endotossina^{batterica 17}. Pertanto, abbiamo studiato un modello di esposizione O₃ e LPS a doppio colpo e abbiamo osservato gli adattamenti cellulari immunitari e non immuni.

Descriviamo un'analisi microscopica fluorescente completa di vari compartimenti polmonari e sistemici del corpo, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare (cioè, BAL) che campiona gli spazi alveolari, il perfusato vascolare polmonare (cioè l'LVP) che campiona la vascolarizzazione polmonare e l'interstizio settale alveolare in caso di barriera endoteliale compromessa, criosezioni polmonari sinistra, per esaminare i leucociti parenchimici e aderenti residenti lasciati nel tessuto polmonare lavato , sangue periferico che rappresenta i leucociti circolanti e i perfusati del midollo osseo sternale e femore che campionano rispettivamente i siti prossimali e distale della mobilitazione cellulare ematopoietica durante l'infiammazione.

Protocol

Il progetto dello studio è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca sugli animali dell'Università del Saskatchewan e ha aderito alle linee guida del Canadian Council on Animal Care per l'uso umano degli animali. Sono stati acquistati topi maschi di sei-otto settimane C57BL/6J. NOTA: Eutanasia di tutti gli animali che sviluppano letargia grave, angoscia respiratoria o altri segni di grave disagio prima del punto finale programmato.

NOTA: Preparare quanto segue: 27-18 G smussato con ago (dipenderà dal diametro del tracheale del mouse), tubi in PE di dimensioni appropriata per adattarsi all'ago smussato (fare una cannula PE per ogni topo), cannula, 2 forbici affilate, 2 forcelle smussate (piccole), 1 forcep affilato (piccolo), 3 siringhe da 1 ml, tubi di microfugo etichettati (per la raccolta di BAL, sangue, perfusato di midollo vascolare e osseo) e fiale etichettate (per la fissazione dei tessuti), sacchetti di campioni / crioviali per la raccolta dei tessuti, rotolo di filo di cotone della macellaio (tagliato in legature di dimensioni adeguate). Tutte le sostanze chimiche utilizzate per gli esperimenti sono indicate nella tabella dei materiali.

1. Esposizioni all'ozono e all'LPS per induzione di lesioni polmonari murine

1. Esposizione all'ozono
   1. Preparare una scatola di induzione O₃ personalizzata. Aggiungere mangime per topi, bottiglia d'acqua, giocattoli di arricchimento e biancheria da letto pulita in ordine e imitare l'ambiente abitativo dei topi.
      NOTA: Questi passaggi garantiranno che i topi abbiano libero accesso a cibo e acqua quando sono ospitati nella scatola di induzione personalizzata e aiuteranno ad alleviare lo stress indebito.
   2. Cambiare il_{calibratore/generatore} O 3 "ON" (posizionato verso la porta di ingresso) per stabilizzare la lampada UV prima della mano (circa 15 minuti prima delle esposizioni) e connettersi con il monitor O₃ in linea.
      NOTA: Il monitor O 3 deve leggere una media di 0,05 ppm, come campionare_dall'uscita a temperatura dell'aria a camera costante (72 ±3 ° F) e umidità relativa (50±15%).
   3. Per le esposizioni O_3, posizionare delicatamente i topi nella scatola di induzione personalizzata ed esporre continuamente i topi a 0,05 ppm O₃ per 2 ore.
2. Anestesia e somministrazione intranasale di LPS
   1. Preparare separatamente 10 mg/mL di alcole e xiazina.
   2. Preparare un cocktail mescolando 20 parti di ketamina e 1 parte di xiazina. Se il topo pesa X g, iniettare (X/200) mL di chetamina/xiazina nella cavità peritoneale. Per un topo, preparare 1 mL di cocktail composto da 1000 μL del 10 mg/mL di ketamina e 50 μL dello stock di xiazina. Mescolare bene tubazione su e giù in un tubo di microfugo.
      NOTA: Le scorte di ketamina e xiazina possono essere preparate con una settimana di anticipo.
   3. Anestetizzare i topi sotto una leggera miscela di chetamina intraperitoneale (IP) (50 mg/kg)/xiazina (1 mg/kg) (ad esempio, per un topo da 25 g, iniettare 0,125 mL del cocktail).
   4. Preparare una soluzione da 1 mg/mL di LPS, in salina, e riempire 50 μL della soluzione in una pipetta.
   5. Tenere il mouse in posizione verticale con il lato posteriore/dorsale sul palmo, tenendo le orecchie con la stessa mano. Ora, posizionare 50 μL della soluzione LPS¹⁸ delicatamente al di fuori delle narici (cioè 25 μL su ogni narice o 50 μL in una narice; non importa finché la procedura è rapida) e consentire ai topi di inalare la soluzione LPS.
   6. Infondere topi di controllo con 50 μL di soluzione salina sterile.
      Attenzione: Non superare più di 100 μL per l'instillazione, che potrebbe essere fatale. Troppo meno di un volume (cioè <50 μL) e c'è il rischio di una deposizione nasale.
   7. Dopo la somministrazione di LPS, posare delicatamente i topi, sullo stomaco o sulla schiena sul tumulo della biancheria da letto con la testa leggermente inclinata verso il basso.
      NOTA: Questo orientamento prolunga la ritenzione della soluzione nella cavità^{nasale 19}.
   8. A 0, 2, 4, 24, 36 e 72 ore dopo l'esposizione, anestetizzare i topi i.p. con dose completa di ketamina (200 mg/kg)/xiazina (4 mg/kg) mix (cioè X/50 mL del cocktail, dove X è il peso del topo in grammi o 0,50 mL per un topo da 25 g).
   9. Osserva il mouse fino a quando non perde conoscenza e il riflesso giusto (cioè non torna indietro quando è posato in posizione supina). Ora, controlla il mouse per la profondità dell'anestesia, monitorando la respirazione (escursioni toraciche ritmiche) e la frequenza cardiaca, che dovrebbe cadere notevolmente, dopo 1-2 minuti.
   10. Quindi, controllare la presenza di riflessi del pedale, ad esempio pizzicare una delle cifre degli arti posteriori e osservare per la retrazione dell'arto, come riflesso. Se il mouse risponde, ricaricare con ulteriori iniezioni da 0,1 mL o più, a richiesta.
       NOTA: Per ottenere un'anestesia profonda, tenere presente che alcuni ceppi o topi obesi di solito hanno un volume maggiore di distribuzione e quindi possono essere facilmente sovradosati, se non è consentito un tempo sufficiente se non consentito per l'anestesia completa (che può essere di circa 10 minuti o più). Di conseguenza, alcuni ceppi possono essere resistenti all'anestesia e quindi richiedere più ricarica. Questa conoscenza viene acquisita dopo molte osservazioni pratiche ed esperienza con topi di diversi ceppi ed età. Poiché alcuni esperimenti pilota sono stati eseguiti anche immediatamente dopo le esposizioni O₃ e LPS (cioè al momento di 2 ore), abbiamo anche incluso alcune analisi delle cellule BAL molto presto da quegli esperimenti per evidenziare gli effetti immediati dell'esposizione combinata O₃e^LPS.

2. Raccolta dei campioni

1. Posizionare il mouse sul vassoio chirurgico. Ora, mettere delicatamente un unguento oculare lubrificante su entrambi gli occhi per evitare la perdita di liquidi e sanificare il mouse con spray al 70% di etanolo.
   1. Fai piccoli tagli attraverso le membrane della pelle superiore e inferiore con le forbici, per esporre la trachea e il torace.
   2. Fai un taglio appena sotto lo sterno ed esponi il cuore.
2. Puntura cardiaca
   1. Posizionare un ago 25G attaccato alla siringa eparinizzata nel ventricolo destro e prelevare il sangue per puntura cardiaca.
      NOTA: Il sangue di solito disegna con un disegno minimo dello stantuffo, se il tempo dall'esposizione del cuore alla puntura cardiaca è inferiore a un minuto. Dopo aver raccolto circa 0,4-0,5 mL, potrebbe essere necessario fermarsi per alcuni secondi prima di raccogliere il sangue rimanente. Questo viene fatto per lasciare che il cuore pompa il volume rimanente nella camera ventricolare destra. Alla fine della raccolta del sangue, il cuore si ferma per pompare.
   2. Raccogliere il sangue e conservare in tubi di microfugo per un'ulteriore lavorazione.
3. tracheostomia
   1. Utilizzare con cura pinzette /pinze smussate per liberare la regione tracheale dal tessuto sovrascrivimento. Utilizzare le mani guantate più degli strumenti chirurgici per evitare sanguinamenti. Se molto sangue trasuda, c'è il rischio di contaminare i campioni di BAL. Utilizzare tamponi di cotone, se necessario, anche se non preferito. I kimwipes sono alternative migliori.
   2. Ora, taglia la gabbia toracica per esporre i polmoni. Ancora una volta, fare attenzione a non tagliare lo sterno e le arterie intercostali o l'aorta ascendente; fare tagli più piccoli mentre si avanza attraverso la gabbia toracica)
   3. Passare una legatura di cotone sotto il taglio tracheale e lasciare come tale per il momento.
   4. Tagliare la trachea in una posizione adatta nella porzione distale 1/3^rd, puntando verso i polmoni, per consentire l'accesso a una cannula tracheale da 28 G.
   5. Inserire una cannula da 28 G PE (una lunghezza minima di 3-5 mm e un'estremità distale tagliata per facilitarne l'inserimento) nella trachea. Fare attenzione alla fine della trachea prima della biforcazione e quindi tirare indietro di circa un mm per evitare di campiostare un solo lobo.
   6. Saldamente, legare la legatura del cotone per tenere la cannula in posizione. Non comprimere la cannula.
4. Lavanda bronco-alveolare (BAL)
   1. Riempire 0,5 ml di PBS in una siringa da 1 ml.
   2. Ora iniettare gradualmente 0,5 ml di PBS nella cannula con l'aiuto di una siringa da 1 ml.
   3. Dopo aver iniettato PBS, aspirare la siringa purché non resista all'aspirazione.
      NOTA: Se c'è resistenza durante l'aspirazione del fluido BAL, ciò indica il collasso del tessuto alveolare o bronchiale. In tal caso, tirare indietro la cannula da un minuscolo per staccare la cannula formare le pareti del tessuto.
   4. Raccogliere il fluido aspirato in un tubo di microfugo etichettato e posizionare sul ghiaccio.
   5. Eseguire altri due lavaggi in modo simile raccogliendo nello stesso flaconcino (cioè, un totale di 0,5 X 3 = 1,5 mL di lavanda).
   6. Misurare il volume del fluido BAL raccolto. Il recupero del lavage dovrebbe essere vicino al 90%.
5. Perfusato vascolare polmonare (LVP)
   1. Tagliare l'aorta toracica discendente in una posizione tra la metà toracica e addominale, per evitare qualsiasi backup di perfusato nei polmoni mentre si perfonde attraverso il ventricolo destro.
   2. Macchiare la cavità vicino all'estremità tagliata dell'aorta, senza sangue.
   3. Successivamente, perfondere i polmoni con 0,5 mL di soluzione salina eparinata a temperatura ambiente iniettata attraverso il ventricolo destro.
   4. Raccogliere il perfusato vascolare dalla cavità all'estremità tagliata dell'aorta toracica discendente, in un tubo di microfugo, posto sul ghiaccio e misurarne il volume.
   5. Legare il bronco destro prossimale alla sua ramificazione dalla trachea (con filo di cotone).
6. Fissazione polmonare sinistra in situ
   1. Collegare una siringa da 1 ml alla cannula tracheale, che è abbastanza lunga da essere inserito attraverso la precedente incisione tracheale.
   2. Tirare indietro l'aria nella siringa fino a 0,6 mL.
   3. Quindi, riempire la siringa rimanente (fino alla fine) con paraformaldeide al 2% a temperatura ambiente. Assicurarsi che lo stantuffo sia pronto a uscire senza aspirare aria dalla cannula.
   4. Ora, apporre la siringa con un nastro adesivo, su un contenitore verticale, misurato fino a 20 cm di altezza.
   5. Delicatamente, disegnare lo stantuffo per lasciare che il fissatore fluisce verso la trachea. Nel caso in cui ci siano alcune bolle d'aria nella cannula, posizionare delicatamente lo stantuffo sopra la siringa e il fluido inizierà a fluire dopo alcuni secondi.
   6. Lasciare gonfiare il polmone sinistro alla sua capacità totale insitu, per 5 minuti, da un'altezza di 20 cm formando una colonna d'acqua di 20 cm.
   7. Durante questa procedura, assicurarsi di proteggere i lobi polmonari giusti dall'entrare in contatto con la paraformaldeide in quanto ciò influenzerà i test a valle.
   8. Posizionare tessuti di laboratorio piegati per assorbire qualsiasi paraformaldeide che potrebbe entrare in contatto con i lobi polmonari giusti.
      ATTENZIONE: La paraformaldeide è altamente tossica. Pertanto, non inalare o posizionare il contatto con parti esposte del corpo. Esercitare estrema cautela durante la manipolazione.
   9. Durante il tempo di instillazione della paraformaldeide, sanificare l'addome.
   10. Tagliare i lobi polmonari giusti dalla trachea assicurandosi di rimuovere qualsiasi filo e mettere immediatamente i lobi in un crioviogenico marcato e lasciarlo cadere in azoto liquido per l'analisi molecolare /biochimica a valle delle citochine/RT-PCR/analisi western blot dell'omogeneato polmonare.
   11. Tagliare con cura il polmone sinistro per qualsiasi tessuto connettivo o membrana pleurica e immergerlo in paraformaldeide al 2% per 24 ore a 4 °C.
   12. Incorporare il polmone fisso in paraffina secondo il protocollo di incorporamento standard.
       Attenzione:non scaldare esosi i campioni polmonari.
   13. Tagliare la parte addominale e de-skin dall'osso pelvico (anca).
   14. Separare le ossa del femore sinistro e destro dalla porzione pelvica, in una piastra di Petri piena di salina tenuta sul ghiaccio.
7. Collezione aspirata di midollo osseo sternale e femore
   1. Pulire il tessuto e i muscoli dalle ossa utilizzando tessuti di laboratorio.
   2. Raccogliere la gabbia toracica ventrale e lo sterno in una piastra di Petri piena di salina tenuta sul ghiaccio.
   3. Tagliare le punte distali e prossimali delle ossa sternali e del femore.
   4. Perfondere le ossa 4 volte con 0,5 ml di soluzione salina, utilizzando aghi ben montati (da 24 a 28 G) su siringhe da 1 ml, e raccogliere le frazioni da ciascun osso in tubi etichettati dotati di filtri e posti sul ghiaccio.
      NOTA: L'ago varia tra le dimensioni dell'animale. Dopo il lavaggio, l'osso del femore dovrebbe presentarsi trasparente.
   5. Una volta raccolti i campioni, insacca il topo in un sacchetto di plastica e metti in un congelatore di carcasse animali per un corretto smaltimento, secondo le linee guida dell'impianto istituzionale per gli animali.

3. Elaborazione del campione

1. Conteggio dei leucociti totali (TLC) e differenziali (DLC)
   1. Campioni di sangue periferico centrifuga, BAL, perfusato vascolare polmonare e midollo osseo (sterno e femore) per 10 min a 500 g.
   2. Raccogli i supernatanti, bloccali e conservali a -80 °C fino a ulteriori analisi.
   3. Ricostituire le cellule in un minimo di 200 μL di PBS.
   4. Eseguire TLC contando bal, sangue, perfusato vascolare polmonare e cellule del midollo osseo su un emocitometro.
   5. Macchiare un'altra aliquota di 9 μL di BAL con un mix di 1 μL di omodimero di etidio verde e rosso di calceina-1 per quantificare le cellule vive (verdi) a causa dell'attività esterasi intracellulare e di eventuali cellule BAL danneggiate (in rosso) a causa della perdita dell'integrità della membrana plasmatica.
   6. Aggiungere il 2% di acido acetico agli RBC a lire, in un rapporto 1:10 per il TLC nel sangue e un rapporto 1:2 per il TLC vascolare polmonare.
      ATTENZIONE: Regolare le concentrazioni cellulari diluindo in PBS se la concentrazione è superiore a 1x10^{6 cellule} per mL (molto importante per i campioni di midollo osseo).
   7. Centrifugare le cellule per preparare i citospini su diapositive e macchie, come spiegato di seguito per i DLC. Contare un minimo di 100 cellule per il conteggio differenziale delle cellule leucociti (DLC).
      NOTA: In genere, si possono preparare due citospin su una diapositiva. E dopo 10-15 minuti di asciugatura ad aria, procedere con la fase di colorazione.
   8. Dividere il BAL raccolto da tre topi pilota per gruppo in due citospini ciascuno e macchiare per actina / tubulina e mitocondri con fosforilazione ossidativa attiva (mitotracker ridotto). Utilizzare il BAL da altri tre topi per dividersi in due citospini ciascuno, per diapositive macchiate NK1.1/Gr1/CX3CR1 e ATPβ/Ki-67/CD61/Angiostatin. Dividere il BAL da altri tre topi in due citospin ciascuno per macchiare per ATPα/Ly6G e CX3CR1/Siglec-F.
2. Lavanda broncoalveolare (BAL) e Perfusato vascolare polmonare (LVP) quantificazione totale delle proteine
   1. Al fine di quantificare le perturbazioni indotte da O₃ e LPS della barriera vascolare o la relativa pressione oncotica nei due compartimenti polmonari (cioè il setto alveolare (interstiziale) e i compartimenti perfusato vascolare polmonare (vascolare), misurare il contenuto proteico totale nei fluidi raccolti.
   2. Analizzare le frazioni supernatanti scongelate per la loro concentrazione totale di proteine utilizzando un saggio colorimetrico standard resistente ai detergenti.
   3. Analisi delle chemiochine broncoalveolare (BAL) e perfusato vascolare polmonare (LVP)
      1. Quindi, analizzare le chemiochine nei supernaganti BAL e perfusato vascolare polmonare (LVP) utilizzando un test immunologico a base di perline magnetiche a 33 plex. Ciò informerà sulla direzionalità dei gradienti di chemiochina delle vie aeree / interstizio vs chemiochina vascolare stabiliti dopo esposizioni combinate.
      2. Analyze the following panel of chemokines : CXCL13 (B-lymphocyte chemoattractant), CCL27 (IL-11 R-alpha-locus chemokine (ILC)), CXCL5 (epithelial-derived neutrophil-activating peptide 78 (ENA-78)), CCL-11 (eotaxin-1), eotaxin-2 (CCL-24), CX3CL1 (fractalkine), GM-CSF (CSF-2), CCL1, IFNγ (interferon gamma), IL-10 (interleukin-10), IL-16 (interleukin-16), IL-1β (interleukin-1 beta), IL-2 (interleukin-2), IL-4 (interleukin-4), IL-6 (interleukin-6), CXCL-10 (interferon gamma-induced protein 10 (IP-10)), CXCL11 (Interferon-gamma-inducible protein 9 (IP-9)), KC (keratinocyte chemoattractant), MCP-1 (monocyte chemoattractant protein-1), MCP-3 (monocyte chemoattractant protein-3), MCP-5 (monocyte chemoattractant protein-5), MDC (macrophage-derived chemokine (CCL22)), MIP-1α (macrophage inflammatory protein-1 alpha), MIP-1β (macrophage inflammatory protein-1 beta), MIP-2 (macrophage inflammatory protein-2), MIP-3α (macrophage inflammatory protein-3 alpha), MIP-3β (macrophage inflammatory protein-3 beta), RANTES (regolato all'attivazione, normale cellula T espressa e secreta (CCL5)), CXCL-16, CXCL-12/SDF-1alpha (fattore derivato da cellule stromali 1), TARC (timo e chemiochina regolata dall'attivazione (TARC)), TECK (Chemiochina espressa dal timo (CCL25)) e TNFα (fattore di necrosi tumorale alpha).

4. Colorazione dei citospini e istologia polmonare

1. Colorazione biochimica dei citospin
   1. Circonda i citospini con una penna idrofobica per contenere le sostanze chimiche per l'incubazione durante la procedura.
   2. Reidratare i citospini in PBS per 5 minuti.
   3. Fissare i campioni di citospino in paraformaldeide al 2% per 10 minuti, lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
   4. Permeabilizzare con ghiaccio freddo 70% acetone per 7 minuti e lavare di nuovo tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
   5. Macchia per actina e tubulina o mitotracker ridotto (incubare con una miscela di 2 μg/50 μL di Alexa 488 phalloidin coniugata mostrata in verde e 2 μg/μL di Alexa 555 topo coniugato anti-α tubulina o mitotracker ridotto mostrato rispettivamente in rosso) per 15 minuti.
      NOTA: Utilizzare l'anticorpo di controllo dell'isotipo IgG1 del mouse, in un citospino separato, per convalidare il protocollo di colorazione della tubulina. Eseguire gli stessi passaggi illustrati da 4.1.1 a 4.1.8, ma per i controlli isotipo.
   6. Rimuovere le macchie ribaltando delicatamente il mix dalla diapositiva. Incubare le diapositive con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) per 5-10 min per macchiare i nuclei.
   7. Lavare i citospini 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno, copriscili con mezzi di montaggio anti dissolvenza e conservare durante la notte al buio a temperatura ambiente prima dell'imaging.
   8. Acquisire immagini al microscopio verticale ad ampio campo dotato di una telecamera scientifica. Garantire tempi di esposizione coerenti della fotocamera impostati per i diversi canali fluorescenti durante le diapositive di imaging.
2. Colorazione immuno-fluorescente cytospin:
   1. Circonda i citospini con una penna idrofobica per contenere le sostanze chimiche per l'incubazione durante la procedura. Reidratare i citospini in PBS per 5 minuti.
   2. Fissare i campioni di citospino incubando in paraformaldeide al 2% per 10 minuti, lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
   3. Permeabilizzare con 0,1% tritone freddo X-100 per 2 minuti, lavare tre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
   4. Successivamente, fc blocca per 15 minuti incubando il citospino con 1:50 diluizione del patrimonio anticorpale del blocco Fc (per assicurarsi che l'anticorpo primario del topo non reagisca in modo non specifico con gli anticorpi Fc del topo).
   5. In questa punta le diapositive per rimuovere il blocco Fc e passare all'1% di BSA e incubare la citospina con una miscela di 3 anticorpi primari di interesse (fare riferimento alla tabella 1 per le varie combinazioni) per 30 minuti.
      NOTA: Assicurarsi di eseguire anticorpi di controllo dell'isotipo (incubare con un mix di anticorpi primari IgG1 e ratto IgG2b kappa eseguendo i passaggi da 4.2.1 a 4.2.9 e sostituendo gli anticorpi con controlli isotipo) in parallelo con anticorpi secondari corrispondenti come discusso nel nostro recente studio²⁰.
   6. Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno. Incubare i citospini con una miscela di anticorpi secondari opportunamente progettati (fare riferimento alla tabella 1 per i dettagli).
   7. Rimuovere le macchie ribaltando delicatamente la miscela dallo scivolo, incubare con DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) per 5-10 minuti per macchiare i nuclei. Lavare 3 volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
   8. Copriscivolo con supporti di montaggio anti dissolvenza e conservare durante la notte al buio a temperatura ambiente prima dell'imaging.
   9. Acquisire immagini al microscopio verticale ad ampio campo dotato di una telecamera scientifica. Garantire tempi di esposizione coerenti della fotocamera impostati per tutti i canali del fluorofore durante l'imaging delle diapositive.
3. Istologia di ematossilina ed eosina (H&E)
   1. Eseguire la colorazione H&E^{modificata 3 sulle} crio-sezioni polmonari per tutti i gruppi.
4. Analisi delle immagini
   1. Elaborare e analizzare i file di dati delle .tiff (in particolare) nel software aperto Fiji ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads).
   2. Controllare i parametri richiesti (Area, Perimetro, Densità integrata, Descrittori di forma, Diametro di Feret, Circolarità, Etichetta di visualizzazione) da registrare nella scheda Analizza e Imposta misure.
   3. Utilizzando gestione ROI, delineare manualmente circa 50-200 celle nel pannello immagine unito utilizzando lo strumento "selezioni a mano libera". Salvate le aree di interesse (ROI) con il comando CTRL+T e copiate le ROI salvate per ogni cella su tutti i canali del fluorofoforo.
   4. Premere quindi CTRL+M per misurare i parametri pre-impostati per tutti i canali fluorescenti (ad esempio, 405 nm (DAPI o ATPβ in blu), 488 nm (actin o NK1.1 o Ki-67 in verde), 568 nm (tubulina o Gr1 o CD61 in rosso) e 633 nm (CX3CR1 o angiostatina in magenta)).
   5. Salvare i risultati come .csv file con un nome appropriato che rappresenta l'analisi. Copiare i risultati del file .csv in un foglio di calcolo e dividere l'intensità di fluorescenza (FI) (che è la colonna Densità integrata grezza dal file Risultati) della molecola macchiata per quella di DAPI o CD61 FI, come disegno di colorazione. Questi rapporti sono definiti come "RAPPORTI FI normalizzati DAPI o CD61".
   6. Quindi, tracciare questi rapporti normalizzati, circolarità, perimetro cellulare e diametro Feret, per valutare eventuali cambiamenti nelle dimensioni delle celle dopo l'esposizione combinata O₃ e LPS.
   7. Utilizzare un software statistico appropriato per verificare la normalità dei dati raccolti e testare l'ipotesi nulla (si rimanda alla sezione di analisi statistica qui sotto).
5. analisi statistica
   1. Esprimere i risultati come ± SEM. Sono stati utilizzati almeno tre topi per gruppo.
   2. Per l'analisi dei dati delle chemiochine, regolare i valori p ANOVA unidirezione per il tasso di scoperta falso in base alla correzione di Benjamini e Hoshberg.
   3. Analizzare i parametri dell'immagine, la cellularità, il diametro feret, il perimetro, i rapporti di intensità della fluorescenza normalizzati DAPI o CD61 mediante il test Mann-Whitney U (per il confronto di due gruppi) o il test Kruskal Wallis (per il confronto di più gruppi) poiché questi dati non erano normalmente distribuiti.
   4. Per il resto degli esperimenti di imaging, analizzare i risultati utilizzando un'analisi uni-way della varianza seguita dai confronti multipli di Sidak. i valori p <0,05 sono stati considerati significativi.

Results

L'esposizione combinata A₃ e LPS porta all'infiammazione sistemica e alla mobilizzazione del midollo osseo a 72 ore: il numero di cellule in diversi compartimenti ha rivelato cambiamenti significativi nel sangue periferico e nel midollo osseo del femore il conteggio totale delle cellule su esposizioni combinate O₃ e LPS. Sebbene le_esposizioni combinate O 3 e LPS non inducano a variazioni nel numero totale di cellule BAL (

Discussion

I metodi presentati nello studio attuale evidenziano l'utilità dell'analisi a compartimento multiplo per studiare più eventi cellulari durante l'infiammazione polmonare. Abbiamo riassunto i risultati della tabella 2. Noi e molti laboratori abbiamo studiato ampiamente la risposta murina all'instillazione intranasale LPS, che è segnata dal rapido reclutamento di neutrofili polmonari, che raggiunge picchi tra 6-24 ore dopo di che, la risoluzione prende il via. E recentemente, abbiamo dimostrato che il sub-c...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pannello di chemochine Bioplex a 33 plex	Olio Biorad	12002231
63X (NA 1,4-0,6) Obiettivi per microscopio	Leica	HCX PL APO CS (11506188)
Alexa 350 capra coniugata anti-topo IgG (H+L)	Invitrogen	A11045
Alexa 488 capra coniugata anti-topo IgG (H+L)	Invitrogen	A11002
Alexa 488 falloidina coniugata	Invitrogen	A12370
Alexa 555 topo coniugato anti-alfa; clone di tubulina DM1A	Millipore	05-829X-555
Alexa 568 capra coniugata anti-criceto IgG (H+L)	Invitrogen	A21112
Alexa 568 capra coniugata anti-ratto IgG (H+L)	Invitrogen	A11077
Alexa 633 capra coniugata anti-coniglio IgG (H+L)	Invitrogen	A21070
Criceto armeno anti-CD61 (clone 2C9. G2) IgG1 kappa	BD Pharmingen	553343
C57BL/6 J Mice	Jackson Laboratories	64
Microscopio confocale a scansione laser	Leica	Leica TCS SP5
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilidolo)	Invitrogen	D1306	aliquota in 2 µ l immagazzina e immagazzina a -20° C
Microscopio fluorescente invertito a campo largo	Olympus	Olympus IX83
Ketamina (Narketan)	Vetochinolo	100 mg/ml	Diluire 10 volte per ottenere un stock di 10 mg/ml
Kit di citotossicità Vivo (calceina)/Morto (Etidio omodimero-1)	Invitrogen	L3224
Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9)	Invitrogen	459240
Topo anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1)	Invitrogen	A-21351
IgG2a kappa di topo anti-NK1.1 (clone PK136)	Invitrogen	16-5941-82
Pierce 660 nm protein assay	Thermoscientific	22660
Coniglio anti-angiostatina (topo aa 98-116) IgG	Abcam	ab2904
Coniglio anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880)	Invitrogen	14-6093-81
Ratto anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa	Invitrogen	14-5698-82
Ratto anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8)	Invitrogen	16-9668-82
Ratto anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5)	Invitrogen	53-5931-82
Ratto anti-topo CD16/CD32 Blocco Fc (clone 2.4G2)	BD Pharmingen	553142
Mitotracker ridotto arancia	Invitrogen	M7511
Xilazina (Rompun)	Bayer	20 mg/ml	Diluire 2 volte per ottenere un brodo da 10 mg/ml