L'ozono combinato e i topi esposti all'endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l'interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l'aumento dell'espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l'angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.
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Articolo metodologico
Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS
In questo articolo
Sommario
Abstract
I polmoni si trovano continuamente di fronte a insulti diretti e indiretti sotto forma di condizioni infiammatorie sterili (particelle o tossine reattive) e infettive (batteriche, virali o fungine). Una risposta ospite travolgente può comportare respirazione compromessa e lesioni polmonari acute, che è caratterizzata dal reclutamento di neutrofili polmonari a seguito della risposta immunitaria, coagulativa e rimodellante dei tessuti dell'ospite pato-logico. Metodi microscopici sensibili per visualizzare e quantificare gli adattamenti cellulari polmonari murini, in risposta all'ozono a basse dosi (0,05 ppm), un potente inquinante ambientale in combinazione con lipopolysaccharide batterico, un agonista TLR4, sono cruciali per comprendere i meccanismi infiammatori e riparatori dell'ospite. Descriviamo un'analisi microscopica fluorescente completa di vari compartimenti polmonari e sistemici del corpo, vale a dire il liquido di lavanda bronco-alveolare, il perfusato vascolare polmonare, le criosezioni polmonari sinistra e il perfusato di midollo osseo sternale. Mostriamo danni di macrofagi alveolari, neutrofili, tessuto parenchimico polmonare, così come cellule del midollo osseo in correlazione con una risposta immunitaria ritardata (fino a 36-72 ore) che è contrassegnata da gradienti discreti di chemiochina nei compartimenti analizzati. Inoltre, presentiamo la matrice extracellulare polmonare e le interazioni citoscheletriche cellulari (actina, tubulina), specie di ossigeno mitocondriale e reattivo, plasminogeno antico coagulativo, angiostatina del frammento peptidico anti-angiogenico, subunità V complesso mitocondriale di ATP sintasi, α e β. Questi marcatori surrogati, se integrati con adeguati saggi a base cellulare in vitro e tecniche di imaging animale in vivo come la microscopia intravitale, possono fornire informazioni vitali per comprendere la risposta polmonare a nuovi agenti immunomodulatori.
Introduzione
La lesione polmonare acuta (ALI) è una risposta patologica cruciale dei polmoni a stimoli infettivi o altri stimoli dannosi che è contrassegnata dall'attivazione simultanea di sistemi immunitari coagulativi, fibrinolitici e innati1. I neutrofili percepisce prontamente modelli di danni microbici e intracellulari attraverso la famiglia di recettori simili a pedaggio (TLR)2,3,4. I neutrofili rilasciano citochine preformate e contenuti di granuli citotossici, che possono quindi causare danni collaterali ai tessuti. Il conseguente danno alveolare è rovinato....
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Protocollo
Il progetto dello studio è stato approvato dal Comitato etico per la ricerca sugli animali dell'Università del Saskatchewan e ha aderito alle linee guida del Canadian Council on Animal Care per l'uso umano degli animali. Sono stati acquistati topi maschi di sei-otto settimane C57BL/6J. NOTA: Eutanasia di tutti gli animali che sviluppano letargia grave, angoscia respiratoria o altri segni di grave disagio prima del punto finale programmato.
NOTA: Preparare quanto segue: 27-18 G smussato con ago (dipenderà dal diametro del tracheale del mouse), tubi in PE di dimensioni appropriata per adattarsi all'ago smussato (fare una cannula PE per ogni t....
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Risultati
L'esposizione combinata A3 e LPS porta all'infiammazione sistemica e alla mobilizzazione del midollo osseo a 72 ore: il numero di cellule in diversi compartimenti ha rivelato cambiamenti significativi nel sangue periferico e nel midollo osseo del femore il conteggio totale delle cellule su esposizioni combinate O3 e LPS. Sebbene leesposizioni combinate O 3 e LPS non inducano a variazioni nel numero totale di cellule BAL (
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Discussione
I metodi presentati nello studio attuale evidenziano l'utilità dell'analisi a compartimento multiplo per studiare più eventi cellulari durante l'infiammazione polmonare. Abbiamo riassunto i risultati della tabella 2. Noi e molti laboratori abbiamo studiato ampiamente la risposta murina all'instillazione intranasale LPS, che è segnata dal rapido reclutamento di neutrofili polmonari, che raggiunge picchi tra 6-24 ore dopo di che, la risoluzione prende il via. E recentemente, abbiamo dimostrato che il sub-c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse o divulgazioni da fare.
Ringraziamenti
La ricerca condotta è finanziata dalla sovvenzione NSERC del Presidente e dai fondi di start-up del Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation. Il Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation è finanziato da Innovation Saskatchewan. L'imaging a fluorescenza è stato eseguito presso il WCVM Imaging Centre, finanziato da NSERC. Jessica Brocos (MSc Student) e Manpreet Kaur (studentessa di laurea magistro) sono state finanziate dai fondi di start-up del Sylvia Fedoruk Canadian Center for Nuclear Innovation.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pannello di chemochine Bioplex a 33 plex | Olio Biorad | 12002231 | |
| 63X (NA 1,4-0,6) Obiettivi per microscopio | Leica | HCX PL APO CS (11506188) | |
| Alexa 350 capra coniugata anti-topo IgG (H+L) | Invitrogen | A11045 | |
| Alexa 488 capra coniugata anti-topo IgG (H+L) | Invitrogen | A11002 | |
| Alexa 488 falloidina coniugata | Invitrogen | A12370 | |
| Alexa 555 topo coniugato anti-alfa; clone di tubulina DM1A | Millipore | 05-829X-555 | |
| Alexa 568 capra coniugata anti-criceto IgG (H+L) | Invitrogen | A21112 | |
| Alexa 568 capra coniugata anti-ratto IgG (H+L) | Invitrogen | A11077 | |
| Alexa 633 capra coniugata anti-coniglio IgG (H+L) | Invitrogen | A21070 | |
| Criceto armeno anti-CD61 (clone 2C9. G2) IgG1 kappa | BD Pharmingen | 553343 | |
| C57BL/6 J Mice | Jackson Laboratories | 64 | |
| Microscopio confocale a scansione laser | Leica | Leica TCS SP5 | |
| DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilidolo) | Invitrogen | D1306 | aliquota in 2 µ l immagazzina e immagazzina a -20° C |
| Microscopio fluorescente invertito a campo largo | Olympus | Olympus IX83 | |
| Ketamina (Narketan) | Vetochinolo | 100 mg/ml | Diluire 10 volte per ottenere un stock di 10 mg/ml |
| Kit di citotossicità Vivo (calceina)/Morto (Etidio omodimero-1) | Invitrogen | L3224 | |
| Mouse anti-ATP5A1 IgG2b (clone 7H10BD4F9) | Invitrogen | 459240 | |
| Topo anti-ATP5β IgG2b (clone 3D5AB1) | Invitrogen | A-21351 | |
| IgG2a kappa di topo anti-NK1.1 (clone PK136) | Invitrogen | 16-5941-82 | |
| Pierce 660 nm protein assay | Thermoscientific | 22660 | |
| Coniglio anti-angiostatina (topo aa 98-116) IgG | Abcam | ab2904 | |
| Coniglio anti-CX3CR1 IgG (RRID 467880) | Invitrogen | 14-6093-81 | |
| Ratto anti-Ki-67 (clone SolA15) IgG2a kappa | Invitrogen | 14-5698-82 | |
| Ratto anti-Ly6G IgG2a kappa (clone 1A8) | Invitrogen | 16-9668-82 | |
| Ratto anti-Ly6G/Ly6C (Gr1) IgG2b kappa (clone RB6-8C5) | Invitrogen | 53-5931-82 | |
| Ratto anti-topo CD16/CD32 Blocco Fc (clone 2.4G2) | BD Pharmingen | 553142 | |
| Mitotracker ridotto arancia | Invitrogen | M7511 | |
| Xilazina (Rompun) | Bayer | 20 mg/ml | Diluire 2 volte per ottenere un brodo da 10 mg/ml |
Riferimenti
- Bhattacharya, J., Matthay, M. A. Regulation and repair of the alveolar-capillary barrier in acute lung injury. Annual Review of Physiology. 75, 593-615 (2013).
- Aulakh, G. K. Neutrophils in the lung: "the first responders". Cell Tissue Research. , (2017....
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Ristampe e permessi
