È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Conservazione della fertilità nei pazienti con grave disfunzione ovarica

4.6K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/62098

⸱

25 marzo 2021

 , 
1Advanced Reproduction Medicine Research Center, Department of Obstetrics and Gynecology, International University of Health and Welfare School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Presentiamo dettagli sulle procedure di laboratorio per l'attivazione in vitro senza farmaci (IVA) dei follicoli ovarico per pazienti con grave disfunzione ovarica. Questo metodo potrebbe aumentare il numero di ovociti recuperabili per iperstimolazione ovarica e beneficiare della conservazione della fertilità per quei pazienti.

Abstract

La funzione ovarica diminuisce progressivamente durante l'invecchiamento e in alcune condizioni fisiopatologiche tra cui anomalie del cariotipo, malattie autoimmuni, terapie chemio- e radiazioni, nonché interventi chirurgici ovarici. Nelle donne non sposate con grave disfunzione ovarica, la conservazione della fertilità è importante per le gravidanze future. Sebbene la crioconservazione degli ovociti sia un metodo stabilito per la conservazione della fertilità, questi pazienti potrebbero preservare solo un numero limitato di ovociti anche dopo l'iperstimolazione ovarica, portando a stimolazioni ripetute per garantire ovociti sufficienti a garantire la gravidanza futura. Per risolvere questo problema, abbiamo recentemente sviluppato una procedura di attivazione in vitro (IVA) senza farmaci, che ci consente di stimolare le prime fasi dei follicoli ovarico a svilupparsi allo stadio del follicolo preantrale. Questi follicoli preantrali possono rispondere al protocollo unico della stimolazione della gonadotropina, con conseguente aumento del numero di ovociti recuperati per stimolazione ovarica per la crioconservazione. L'IVA senza farmaci comprendeva l'approccio chirurgico e la stimolazione ovarica. Abbiamo rimosso una parte della corteccia da una o entrambe le ovaie da pazienti in chirurgia laparoscopica. I tessuti corticali ovarico sono stati tagliati a cubetti per interrompere la via di segnalazione dell'Ippopotamo e stimolare lo sviluppo dei follicoli allo stadio iniziale. Questi cubi sono stati innestati ortotropicamente nelle ovaie rimanenti e sotto il serosa di entrambe le tube di Falloppio. Abbiamo già pubblicato la procedura chirurgica dell'IVA senza farmaci e il protocollo di successiva stimolazione ovarica, ma qui presentiamo i dettagli dei metodi di laboratorio richiesti per l'IVA senza farmaci.

Introduzione

La funzione ovarica diminuisce progressivamente durante l'invecchiamento e alcune condizioni fisiopatologiche tra cui anomalie del cariotipo, malattie autoimmuni, terapie chemio- e radiazioni e interventi chirurgici ovarici. La conservazione della fertilità è una delle migliori opzioni per le donne non sposate con grave disfunzione ovarica per preservare il loro potenziale per la gravidanza futura. Per la conservazione della fertilità, attualmente sono disponibili due metodi principalmente nel campo dell'onco-fertilità. La crioconservazione degli ovocite è una procedura ben consolidata per la conservazione della fertilità e molti casi di successo sonostati segnalati 1,2. D'altra parte, la crioconservazione del tessuto ovarico è stata stabilita anche per la conservazione della fertilità nei pazienti oncologici,ma è ancora una strategia sperimentale 3,4. In entrambi i metodi, sono necessari più numeri di ovociti maturi per la gravidanza. Generalmente, i pazienti con insufficienza ovarica prematura (POI), che diventano amenorrea prima dei 40 anni di età, e le donne di mezza età con bassa riserva ovarica hanno mostrato una scarsa risposta ovarica (POR) alla stimolazione ovarica per la resa di ovociti maturi5,6,7. Inoltre, i giovani pazienti con un basso numero di follicoli astrali hanno anche mostrato POR alla stimolazione ovarica7. Questi pazienti hanno un numero molto limitato di ovociti recuperabili anche dopo una corretta iperstimolazione ovarica, richiedendo così più procedure costose per garantire un numero sufficiente di ovociti per la gravidanza.

La donazione di ovociti seguita da fecondazione in vitro (FIV) con trasferimento di sperma ed embrioni del marito (ET) è l'unica opzione per questi pazienti con POI e POR che hanno difficoltà ad ottenere i propri ovociti8,9,10. Tuttavia, la donazione di ovociti è complicata da questioni etiche, nonché complicazioni autoimmuni e di gravidanza11,12,13,14. Per risolvere questi problemi, si desidera l'istituzione di un trattamento di infertilità utilizzando gli ovociti dei pazienti. Per i pazienti con POI, abbiamo sviluppato l'approccio di attivazione in vitro (IVA) per consentire una crescita follicolare di successo e la generazione di ovociti maturi, guidando una serie digravidanze e consegne 15. Nell'IVA, abbiamo frammentato le corteccia ovarico dopo la rimozione delle ovaie in chirurgia laparoscopica e le abbiamo coltivate per due giorni per attivare follicoli da farmaci stimolanti Akt e quindi eseguire l'innesto eterotopico in sacchetti artificiali realizzati sotto la serosa delle tube di Falloppio sotto la seconda chirurgia laparoscopica15. Questa procedura ha promosso la crescita dei follicoli primordiali, primari e secondari dopo la frammentazione della corteccia ovarica per promuovere l'interruzione della segnalazione di Ippopotamo16, seguitada una cultura di due giorni con stimolatori di segnalazione Akt17.

A differenza dei casi gravi di POI, i pazienti con POR con diminuzione della riserva ovarica hanno più follicoli secondari. Poiché Hippo segnala l'interruzione da solo è efficace nel promuovere la crescita del follicolosecondario 16, abbiamo recentemente dimostrato gravidanze e consegne di successo per i pazienti POR utilizzando la procedura IVA senza farmaci che comporta frammentazione corticale e innesto ortotopico senza trattamento dei farmaci stimolanti Akt. L'IVA senza farmaci stimola la fase iniziale dei follicoli ovarici a svilupparsi allo stadio del follicolo preantrale dopo un solo intervento chirurgico e aumenta il numero di ovociti recuperati per il trasferimento di fecondazione invitro-embrione 15,18. L'approccio IVA senza farmaci ha diversi vantaggi rispetto alla nostra IVA originale di 1) evitando potenziali perdite follicolari durante la coltura, 2) riducendo al minimo l'invasività e i costi del secondo intervento chirurgico, 3) coinvolgendo solo il riposo a letto post-chirurgico a breve termine e 4) il potenziale di gravidanza spontanea a causa dell'innesto ortotopico. Recentemente abbiamo pubblicato un video articolo che mostra le procedure chirurgiche dell'IVA19 senza farmaci e protocolli dettagliati di stimolazione ovarica dopo l'interventochirurgico 20. Qui, presentiamo i dettagli dei metodi di laboratorio richiesti per l'IVA senza farmaci.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ogni paziente POR con riserva ovarica decrescimento che si è iscritto al trattamento IVA senza farmaci. Questo studio è stato approvato dal comitato etico dell'Università Internazionale di Salute e Benessere (n. 17-S-21). Lo studio clinico è stato registrato con il numero UMIN000034464 ed eseguito in conformità con il Codice Etico della World Medical Association (Dichiarazione di Helsinki).

1. Estrazione della corteccia ovarica

  1. Rimuovere parte della corteccia ovarica (10 x 10 mm, spessore 2-3 mm) da una o entrambe le ovaie in anestesia generale attraverso la chirurgia laparoscopica comeprecedentemente descritto 19,20.
  2. Posizionare le corteccia ovarica raccolte in un contenitore sterile contenente 10 mL di HTF modificato (mHTF) a 37 °C.

2. Frammentazione della corteccia ovarica

NOTA: Prima della dissezione della corteccia ovarica, riscaldare mHTF a 37 °C. Mantenere condizioni sterili durante tutta la procedura. Tutti gli strumenti per questa procedura sono elencati in Table of Materials.

  1. Mettere le corteccia ovarica raccolte in un piatto di plastica contenente 5-10 mL di mHTF a 37 °C e posizionarle sulla piastra termica per mantenere il tessuto a 37 °C(Figura 2A).
  2. Scatta una foto di ogni corteccia usando una fotocamera digitale con il nome del paziente prima di iniziare la procedura successiva per collegare i dati in background del paziente.
  3. Posizionare una corteccia individuale su una garza sterile inumidita con mHTF (Figura 2B).
    NOTA: Applicare mHTF aggiuntivo con una pipetta monouso sulla garza per evitare che la superficie della corteccia venga asciugata durante questa procedura.
  4. Rimuovere il tessuto midollare residuo in cui appare rosa utilizzando una micro-forbice in modo che lo spessore del tessuto raggiunga 1-2 mm(Figura 2C e D).
    NOTA: Per evitare la perdita di follicoli nella fase iniziale, non preparare le strisce corticali di spessore inferiore a 1 mm, perché i follicoli in fase iniziale si trovano entro 1-2 mm dalla superficie della corteccia ovarica21.
  5. Sezionare un pezzo di tessuto di 1 mm x 1 mm x 5 mm da ogni striscia corticale ovarica utilizzando un bisturi fine e sottoposerlo ad analisi istologiche per determinare la presenza di follicoli residui comedescritto in precedenza 18 (Figura 2E).
    NOTA: I tessuti sezionati per l'istologia sono immersi in mHTF e si mantengono a 4 °C fino al fissaggio(Figura 2F, vedere fase 4).
  6. Tagliare la corteccia in strisce da 1 mm x 1 mm x 10 mm utilizzando un bisturi fine (Figura 2G).
    NOTA: È più facile da tagliare premendo sul bisturi che tirandolo su di esso.
  7. Tagliare queste strisce di tessuto in cubi piccoli da 1 mm x 1 mm x 1 mm(Figura 2H).
    NOTA: Per evitare cambiamenti di pressione osmotica nel mezzo, aggiungere mHTF con moderazione prima dell'autoinnesto dei tessuti.

3. Auto-innesto di frammenti corticali ovarico

  1. Aprire la confezione della cannula IVA e metterla su un drappo sterile.
  2. Risciacquare all'interno della cannula IVA con mHTF aspirando e scaricando mHTF più volte.
  3. Aspirare 100-200 μL di mHTF per riempire la punta della cannula IVA per evitare che i cubi corticali si asciughino durante il caricamento(Figura 3A).
  4. Caricare i cubi corticali nella punta della cannula IVA utilizzando una pinzetta fine (Figura 3B-E).
    NOTA: Il numero di cubi corticali per il caricamento dipende dal sito di innesto. Generalmente, 20-30 cubi possono essere trapiantati in un'ovaia rimanente ortotropica, mentre 10-15 cubi possono essere trapiantati in una busta sotto la serosa della tube di Falloppio.
  5. Dopo aver caricato i cubi corticali, tenere la punta della cannula contenente i cubi corticali dalle dita fino a trasferire la cannula IVA a un chirurgo. Ciò eviterà che la temperatura del cubo diminuisca.
    NOTA: I dettagli della procedura di autoinnesto in chirurgia laparoscopica sono stati riportati in precedenza19. Per l'innesto di cubi corticali ovarico, il nostro collaboratore, la Kitazato Corporation, ha sviluppato un dispositivo a forma di cannula (IVA cannula).

4. Analisi istologica della corteccia ovarica

NOTA: Per contare il numero di follicoli residui, eseguire analisi istologiche come descritto in precedenza15.

  1. Contrassegnare la superficie della striscia corticale con un colorante di marcatura tissutale prima della fissazione del campione. Questo indicherà il lato della corteccia in striscia per l'istologia.
  2. Fissare le strisce tissutali durante la notte a 4 °C utilizzando la soluzione di Bouin.
    NOTA: Per rilevare i follicoli atretici, si s consiglia di utilizzare la paraformaldeide per il fissaggio per evitare il restringimento del citoplasma degli ovocite.
  3. Disidratare e incorporare le strisce tissutali in paraffina.
  4. Sessò in serie il blocco di paraffina contenente il campione di tessuto.
  5. Macchiare ogni sezione usando ematossilina ed eosina per visualizzare i follicoli.
  6. Contare i follicoli come descritto in precedenza17.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

Nella prima pubblicazione dell'approccio IVA15,abbiamo trapiantato i cubi corticali ovarici uno per uno nei siti di innesto in chirurgia laparoscopica(Figura 1A). Poiché sono stati usati 100-150 cubi ovarici, ci sono volle 3-4 ore per l'innesto tissutale sotto chirurgia laparoscopica. Inoltre, alcuni cubi ovarico sono stati persi prima dell'innesto. Poiché la cannula IVA potrebbe trasferire 20-30 cubi in un sito di innesto contemporaneamente (Figu...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

In questo manoscritto, abbiamo mostrato un protocollo di laboratorio dettagliato per l'IVA senza farmaci. L'IVA senza farmaci è un nuovo approccio di trattamento dell'infertilità per il paziente POR con riserva ovarica in diminuzione per promuovere la crescita dei follicoli secondari, con conseguente rendimento di ovociti più maturi dopo la stimolazione ovarica e aumento della gravidanza disuccesso 20. In 15 pazienti por con riserva ovarica in diminuzione, questo approccio ha raggiunto una gravida...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

Gli autori confermano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Ringraziamo Tatsuji Ihana, Sachiyo Kurimoto, Kazuko Takahasih, Yuki Yoshizawa, Maho Arashi, Kentaro Fujita, Erina Kudo, Yuka Kurimoto e Mayuko Wakatsuki per aver supportato la procedura IVA senza farmaci e il Prof. Ringraziamo anche Rebecca Truman e Gregory Truman per aver inserito la narrazione inglese. Questo studio è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), Scientific Research B (19H03801) e Challenging Exploratory Research (18K19624).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
contenitore per campioni 4.5 onzFALCON354013Possono essere adatti anche altri prodotti
Piatto da 60 mmFALCON351007Altri prodotti possono essere adatti
Telo sterile da 50 x 50 cmHOGY MedicalSR-823Può essere adatto anche qualsiasi tipo di polvere sterile
Pippete monousoFALCON357575Possono essere adatti
anche altri prodottiForbici fini, curveWPI#14224-GSebbene anche altri prodotti possano essere adatti, si consiglia vivamente di utilizzare questi prodotti
Piastra riscaldanteTOKAI HITTPiE-SPUtilizzare in sala operatoria per mantenere la temperatura delle piastre contenenti tessuto ovarico prima del trapianto
Soluzione di albumina sierica umanaIrvine Scientific9988Mezzo per la manipolazione del tessuto ovarico
Cannula IVAKITAZATO446030 IVA-6030ECannula specifica per autotrapianto tissutale
KAI medical Bisturi monousoWPI#5 10-ASebbene anche altri prodotti possano essere adatti, consigliamo vivamente di utilizzare questi prodotti
Micro forbici, CurvedWPI#503364Sebbene anche altri prodotti possano essere adatti, consigliamo vivamente di utilizzare questi prodotti
HTF modificato Medium-HEPESIrvine Scientific90126Terreno per la manipolazione di tessuto ovarico
Garza sterileOsaki Medical15004Qualsiasi tipo di propolvero sterile può essere adatto anche
Pinzette svizzere, punte curveKAI#504505Sebbene anche altri prodotti possano essere adatti, si consiglia vivamente di utilizzare questi prodotti

Riferimenti

  1. Liang, T., Motan, T. Mature Oocyte Cryopreservation for Fertility Preservation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 155-161 (2016).
  2. Yoon, T. K., et al. Live births after vitrification of oocytes in a stimulated in vitro fertilization-embryo transfer program. Fertility and Sterility. 79 (6), 1323-1326 (2003).
  3. Donnez, J., et al. Livebirth after orthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue. Lancet. 364 (9443), 1405-1410 (2004).
  4. Meirow, D., et al. Pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue in a patient with ovarian failure after chemotherapy. New England Journal of Medicine. 353 (3), 318-321 (2005).
  5. De Vos, M., Devroey, P., Fauser, B. C. Primary ovarian insufficiency. Lancet. 376 (9744), 911-921 (2010).
  6. Scott, R. T., et al. Follicle-stimulating hormone levels on cycle day 3 are predictive of in vitro fertilization outcome. Fertility and Sterility. 51 (4), 651-654 (1989).
  7. Ferraretti, A. P., et al. ESHRE consensus on the definition of 'poor response' to ovarian stimulation for in vitro fertilization: the Bologna criteria. Human Reproduction. 26 (7), 1616-1624 (2011).
  8. Huhtaniemi, I., et al. Advances in the Molecular Pathophysiology, Genetics, and Treatment of Primary Ovarian Insufficiency. Trends in Endocrinology and Metabolism. 29 (6), 400-419 (2018).
  9. Męczekalski, B., Maciejewska-Jeske, M., Podfigurna, A. Reproduction in premature ovarian insufficiency patients - from latest studies to therapeutic approach. Prz Menopauzalny. 17 (3), 117-119 (2018).
  10. Baker, V. Life plans and family-building options for women with primary ovarian insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 29 (4), 362-372 (2011).
  11. Englert, Y., Govaerts, I. Oocyte donation: particular technical and ethical aspects. Human Reproduction. 13, Suppl 2 90-97 (1998).
  12. Englert, Y., Rodesch, C., Laruelle, C., Govoerts, I. Oocyte donation: ethical aspects related to the donor. Contraception, Fertilite, Sexualite. 25 (3), 251-257 (1997).
  13. Storgaard, M., et al. Obstetric and neonatal complications in pregnancies conceived after oocyte donation: a systematic review and meta-analysis. BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. 124 (4), 561-572 (2017).
  14. Storgaard, M., Malchau, S., Loft, A., Larsen, E., Pinborg, A. Oocyte donation is associated with an increased risk of complications in the pregnant woman and the fetus. Ugeskrift for Laeger. 179 (11), (2017).
  15. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  16. Hsueh, A. J., Kawamura, K., Cheng, Y., Fauser, B. C. Intraovarian control of early folliculogenesis. Endocrine Reviews. 36 (1), 1-24 (2015).
  17. Li, J., et al. Activation of dormant ovarian follicles to generate mature eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (22), 10280-10284 (2010).
  18. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Human Reproduction. 30 (3), 608-615 (2015).
  19. Tanaka, Y., Hsueh, A. J., Kawamura, K. Surgical approaches of drug-free in activation and laparoscopic ovarian incision to treat patients with ovarian infertility. Fertility and Sterility. , (2020).
  20. Kawamura, K., Ishizuka, B., Hsueh, A. J. W. Drug-free in-vitro activation of follicles for infertility treatment in poor ovarian response patients with decreased ovarian reserve. Reproductive Biomedicine Online. 40 (2), 245-253 (2020).
  21. Haino, T., et al. Determination of Follicular Localization in Human Ovarian Cortex for Vitrification. Journal of Adolescent and Young Adult Oncology. 7 (1), 46-53 (2018).
  22. Baird, D. T., Webb, R., Campbell, B. K., Harkness, L. M., Gosden, R. G. Long-term ovarian function in sheep after ovariectomy and transplantation of autografts stored at -196 C. Endocrinology. 140 (1), 462-471 (1999).
  23. Qin, Y., Jiao, X., Simpson, J. L., Chen, Z. J. Genetics of primary ovarian insufficiency: new developments and opportunities. Human Reproduction Update. 21 (6), 787-808 (2015).
  24. Domniz, N., Meirow, D. Premature ovarian insufficiency and autoimmune diseases. Best Practice & Research: Clinical Obstetrics & Gynaecology. 60, 42-55 (2019).
  25. Laven, J. S. Primary Ovarian Insufficiency. Seminars in Reproductive Medicine. 34 (4), 230-234 (2016).
  26. Grynberg, M., et al. Fertility preservation in Turner syndrome. Fertility and Sterility. 105 (1), 13-19 (2016).
  27. Tomao, F., Spinelli, G. P., Panici, P. B., Frati, L., Tomao, S. Ovarian function, reproduction and strategies for fertility preservation after breast cancer. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 76 (1), 1-12 (2010).
  28. Kim, S., Lee, Y., Lee, S., Kim, T. Ovarian tissue cryopreservation and transplantation in patients with cancer. Obstetrics & Gynecology Science. 61 (4), 431-442 (2018).
  29. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue freezing: current status. Current Opinion in Obstetrics and Gynecology. 27 (3), 222-230 (2015).
  30. Wu, R. C., Kuo, P. L., Lin, S. J., Liu, C. H., Tzeng, C. C. X chromosome mosaicism in patients with recurrent abortion or premature ovarian failure. Journal of the Formosan Medical Association. 92 (11), 953-956 (1993).
  31. De Munck, N., Vajta, G. Safety and efficiency of oocyte vitrification. Cryobiology. 78, 119-127 (2017).
  32. Argyle, C. E., Harper, J. C., Davies, M. C. Oocyte cryopreservation: where are we now. Human Reproduction Update. 22 (4), 440-449 (2016).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Tag

Crioconservazione degli ovocitiattivazione in vitroIVA senza farmaciframmentazione della corteccia ovaricainterruzione della segnalazione Hippoautotrapianto ovaricocrescita dei follicoli secondaricoltura di tessuto ovarico
Conservazione della fertilità nei pazienti con grave disfunzione ovarica
Contattaci
Consiglia alla biblioteca

Privacy

Termini di utilizzo

Politiche

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati.