Method Article

L'apparato che annulla il sonno: un metodo altamente efficiente per privare la drosophila del sonno

DOI:

10.3791/62105

⸱

December 14th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La privazione del sonno è un potente strumento per studiare la funzione e la regolazione del sonno. Descriviamo un protocollo per privare di sonno Drosophila usando l'apparato annullante del sonno e per determinare l'entità del sonno di rimbalzo indotto dalla privazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'omeostasi del sonno, l'aumento del sonno osservato dopo la perdita di sonno, è uno dei criteri di definizione utilizzati per identificare il sonno in tutto il regno animale. Di conseguenza, la privazione del sonno e la restrizione del sonno sono strumenti potenti che sono comunemente usati per fornire informazioni sulla funzione del sonno. Tuttavia, gli esperimenti di privazione del sonno sono intrinsecamente problematici in quanto lo stimolo di privazione stesso può essere la causa dei cambiamenti osservati nella fisiologia e nel comportamento. Di conseguenza, le tecniche di privazione del sonno di successo dovrebbero mantenere gli animali svegli e, idealmente, provocare un robusto rimbalzo del sonno senza indurre anche un gran numero di conseguenze indesiderate. Qui, descriviamo una tecnica di privazione del sonno per Drosophila melanogaster. Lo Sleep Nullifying Apparatus (SNAP) somministra uno stimolo ogni 10 secondi per indurre geotaxi negativi. Sebbene lo stimolo sia prevedibile, lo SNAP previene efficacemente >95% del sonno notturno anche nelle mosche con un elevato calo del sonno. È importante sottolineare che la successiva risposta omeostatica è molto simile a quella ottenuta utilizzando la privazione della mano. I tempi e la spaziatura degli stimoli possono essere modificati per ridurre al minimo la perdita di sonno e quindi esaminare gli effetti non specifici dello stimolo sulla fisiologia e sul comportamento. Lo SNAP può essere utilizzato anche per la restrizione del sonno e per valutare le soglie di eccitazione. Lo SNAP è una potente tecnica di interruzione del sonno che può essere utilizzata per comprendere meglio la funzione del sonno.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sonno è quasi universale negli animali, ma la sua funzione rimane poco chiara. L'omeostasi del sonno, l'aumento compensatorio del sonno dopo la privazione del sonno, è una proprietà determinante del sonno, che è stata utilizzata per caratterizzare gli stati del sonno in un certo numerodi animali1,2,3,4,5.

Il sonno nella mosca ha molte somiglianze con il sonno umano, tra cui una robusta risposta omeostatica alla perdita di sonno4,5. Numerosi studi sul sonno nella mosca hanno utilizzato la privazione del sonno sia per dedurre la funzione del sonno esaminando le conseguenze negative che derivano dalla veglia prolungata, sia per comprendere la regolazione del sonno determinando i meccanismi neurobiologici che controllano la regolazione omeostatica del sonno. Così le mosche private del sonno hanno dimostrato di mostrare menomazioni nell'apprendimento e nella memoria6,7,8,9,10,11,12, plasticità strutturale13,14,15, attenzione visiva16, recupero da lesioni neuronali17,18, accoppiamento e comportamenti aggressivi19, 20, proliferazione cellulare21e risposte allo stress ossidativo22,23 per citarne alcuni. Inoltre, leindagini sui meccanismi neurobiologici che controllano il sonno di rimbalzo hanno prodotto informazioni critiche sul meccanismo neuronale che costituisce l'omeostato del sonno8,9,23, 24,25,26,27,28,29 . Infine, oltre a rivelare intuizioni fondamentali sulla funzione del sonno negli animali sani, gli studi sulla privazione del sonno hanno anche informato le intuizioni sulla funzione del sonno negli statipatologici 30,31.

Mentre la privazione del sonno è innegabilmente uno strumento potente, con qualsiasi esperimento di privazione del sonno, è importante distinguere i fenotipi che derivano dalla veglia prolungata, da quelli indotti dallo stimolo utilizzato per mantenere sveglio l'animale. La privazione del sonno per privazione della mano o manipolazione delicata, è generalmente considerata come lo standard per la privazione del sonno minimamente dirompente. Qui descriviamo un protocollo per privare il sonno delle mosche usando il Sleep Nullifying Apparatus (SNAP). Lo SNAP è un dispositivo che fornisce uno stimolo meccanico alle mosche ogni 10 secondi, mantenendo sveglie le mosche inducendo geotaxi negativi (Figura 1). Lo SNAP priva efficacemente le mosche di >98% del sonno notturno, anche nelle mosche con un elevato livello di sonno8,32. Lo SNAP è stato calibrato su mosche sensibili al botto, l'agitazione delle mosche nello SNAP non danneggia le mosche; la privazione del sonno con lo SNAP induce un rimbalzo paragonabile a quello ottenuto dalla privazione della mano7. Lo SNAP è quindi un metodo robusto per privare le mosche del sonno mentre controlla gli effetti dello stimolo eccitante.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione sperimentale

  1. Raccogli le mosche mentre si chiude in fiale, separando le mosche maschili e femminili.
    NOTA: gli esperimenti sul sonno sono comunemente condotti con mosche femmine. È importante raccogliere femmine vergini. Le femmine accoppiate deporteranno uova che si schiudono in larve complicando l'analisi dei dati.
  2. Mosche domestiche di un solo sesso in gruppi di <20.
    NOTA: l'alloggiamento vola in un ambiente socialmente arricchito (gruppi di >50) modula il sonno6,13 misurazioni potenzialmente confondenti del sonno di rimbalzo. Inoltre, a seguito dell'arricchimento sociale, il sonno diminuirà in pochi giorni6. Pertanto, il sonno basale non è stabile complicando l'analisi del sonno di rimbalzo. Mantenere le mosche in gruppi di <20 evita questo potenziale confusione.
  3. Tenere le mosche in fiale per 3-5 giorni in un ambiente controllato dalla luce e dall'umidità.
    NOTA: L'età e la maturità delle mosche influenzano fortemente il sonno. Il sonno è alto nelle mosche di un giorno e si stabilizza entro 3-5 giorni di età4. Le mosche sono in genere mantenute su una luce di 12 ore: 12 ore di buio al 50% di umidità.

2. Preparazione dei tubi per la registrazione del sonno

NOTA: il sonno viene monitorato utilizzando monitor di attività locomotoria. Un monitor può contenere 32 mosche alloggiate singolarmente in tubi di diametro 5 mm. Tipicamente, i genotipi vengono analizzati in gruppi di 16 o 32 mosche.

  1. Preparare un numero appropriato di tubi con cibo volante a un'estremità.
    NOTA: La dieta e il metabolismo sono noti per influenzare il sonno33,34, quindi è particolarmente importante posizionare le mosche sullo stesso cibo su cui sono state allevate.
  2. Sigillare l'estremità dei tubi con cera.
    NOTA: la privazione del sonno e il rimbalzo sono un esperimento di cinque giorni e il cibo può asciugarsi se non adeguatamente sigillato. In tubi adeguatamente sigillati, il cibo può essere mantenuto per 10 giorni o più. Pertanto, è fondamentale assicurarsi che le estremità dei tubi siano ben sigillate. Tuttavia, le mosche possono anche rimanere attaccate al cibo umido. Pertanto, aiuta a realizzare tubi 1-2 giorni prima dell'inizio dell'esperimento.
  3. Posizionare individualmente la scia, comportandosi mosche in tubi di vetro lunghi 65 mm per la registrazione del sonno utilizzando un aspiratore e collegare l'estremità dei tubi con un tappo di schiuma.
    NOTA: le mosche non vengono mai riconseposte all'anestesia co2 quando inseriscono le mosche in tubi per la registrazione del sonno. L'aspiratore è costituito da tubi di gomma con un'estremità ricoperta di garza e inserita in una punta della pipetta da 1 mL.

3. Registrazione del sonno

  1. Carica le mosche in tubi nei monitor di attività per monitorare il sonno.
    NOTA: le rocce SNAP monitorano avanti e indietro da -60° a +60° ogni ~10 s. I monitor sono tenuti a -60 ° per ~ 5.9s ; ci vogliono ~ 2,9 s perché il vassoio che tiene i monitor passi da -60 ° a +60 ° e ~ 1 s per tornare indietro da +60 ° a -60 °. La lunghezza del ciclo può essere modificata secondo necessità regolando la tensione fornita al motore.
    1. Fare attenzione a garantire che i tubi siano posizionati nei monitor di attività con l'orientamento corretto. Nell'orientamento corretto, l'estremità del tubo con il cibo è nella parte superiore dello SNAP per garantire che le mosche non vengano spinte nel cibo. Inoltre, la fine con il cibo è sul lato del monitor con il jack di registrazione del sonno. Ciò consente ai monitor di attività di essere orientati correttamente nello SNAP per un'efficiente privazione del sonno e contemporaneamente monitorare l'attività.
  2. Posizionare i monitor di attività nella camera di registrazione per monitorare il sonno.
  3. Monitorare il sonno per almeno due giorni interi per stimare il sonno basale.
    NOTA: il giorno in cui le mosche vengono caricate nei monitor di attività è in genere escluso come giorno di adattamento per consentire alle mosche di adattarsi ad essere alloggiate in tubi. Il sonno di base viene registrato per almeno due giorni interi (48 ore) a partire dalla mattina successiva al giorno in cui vengono caricate le mosche.
  4. Salva il conteggio dell'attività locomotoria delle mosche nei contenitori di 1 minuto dal momento delle luci di un determinato giorno alle luci del giorno precedente utilizzando il software di registrazione delle attività (ad esempio, dalle 8:00 alle 8:00).
  5. Stimare il sonno dai dati dell'attività locomotoria con macro personalizzate utilizzando 5 minuti di inattività come soglia per un attacco di sonno35.
    NOTA: un certo numero di metriche del sonno vengono calcolate dai conteggi dell'attività locomotoria. Questi includono il sonno in min / h oltre 24 ore, il tempo di sonno totale in 24 ore, la durata media e massima del sonno diurno e notturno36.

4. Privazione del sonno e recupero

  1. Poiché le mosche possono essere private del sonno per periodi di tempo variabili (ad esempio, 12 h, 24 h e 36 h) e il sonno di recupero può anche essere valutato a vari intervalli (ad esempio, 6 h, 12 h, 24 h e 48 h), determinare la durata del recupero per necessità sperimentale. Il recupero del sonno può essere visualizzato utilizzando un grafico di guadagno / perdita di sonno o esaminando la percentuale di sonno recuperato in un intervallo predeterminato (ad esempio, 6 ore).
  2. Se il sonno è stabile nei due giorni di base, il terzo giorno, inserire i monitor di attività nello SNAP per la privazione del sonno durante la notte.
    NOTA: le mosche mostreranno un robusto rimbalzo del sonno su un intervallo di tempi di sonno8,32,37,38,ma il sonno deve essere stabile per valutare in modo affidabile il sonno di rimbalzo. Il sonno è stabile quando la differenza di sonno tra i giorni di base è di ± 100 minuti.
  3. Assicurarsi che i monitor di attività siano fissati in posizione con i pin del supporto del monitor, i cavi del monitor collegati e i monitor orientati correttamente con l'estremità con il cibo sul retro e le barriere di plastica davanti (Figura 1).
    NOTA: SNAP è progettato in modo che la camma ruoti una volta ogni 10 s (Figura 1). L'inserto in plastica ripristina i tubi spingendo i tubi indietro quando l'apparecchio è in posizione "up". Il ripristino dei tubi è importante per garantire che tutti i tubi abbiano l'intera gamma di movimento all'inizio di ogni ciclo.
  4. Scollegare i monitor di attività e togliere i monitor dallo SNAP immediatamente dopo l'accendersi dopo la privazione del sonno durante la notte.
    NOTA: è fondamentale che la privazione del sonno sia terminata e che le mosche siano poste in recupero immediatamente dopo le luci accese dopo 12 ore di privazione del sonno durante la notte. Anche un ritardo di 20-30 minuti nel mettere le mosche in recupero può interferire con l'estensione del sonno di rimbalzo.
  5. Posiziona le mosche in una camera di registrazione dove saranno indisturbate per due giorni (48 ore) per monitorare il sonno di recupero.
    NOTA: Se la camera di registrazione viene utilizzata per altri esperimenti, è necessario prestare particolare attenzione per evitare di stimolare il recupero delle mosche.
  6. Calcola la quantità di sonno perso. Per ogni singola mosca, calcolare la differenza oraria tra il sonno ottenuto durante la privazione del sonno e l'ora corrispondente durante il basale; sommare le differenze orarie per calcolare il sonno totale perso.
  7. Calcola la quantità di sonno recuperato. Per ogni singola mosca, calcolare la differenza oraria tra il sonno ottenuto durante il recupero e l'ora corrispondente durante il basale; sommare le differenze orarie per calcolare il sonno totale guadagnato.
    NOTA: Se una mosca è effettivamente privata del sonno è empirico. Pertanto, lo sperimentatore dovrebbe esaminare la percentuale di sonno perso. Se la mosca non ha perso una quantità sufficiente di sonno può essere esclusa dall'analisi. Anche se questo potrebbe essere richiesto per altri approcci di privazione del sonno, è raramente se mai richiesto per lo SNAP. Più comunemente, il sonno potrebbe non essere stabile in una determinata mosca prima dell'inizio della privazione del sonno. Se il sonno non è stabile, l'omeostasi non può essere calcolata. Accettiamo una differenza massima di ± 100 minuti di sonno calcolata prima dell'inizio della privazione del sonno come candidati per l'inclusione. A volte, il sonno di una singola mosca è distribuito in modo non uniforme durante il giorno di 24 ore (ad esempio, alcuni individui possono ottenere il 60-70% della loro quota di sonno durante il giorno e quindi perdere solo una piccola parte della loro quota di sonno di 24 ore quando privati per 12 ore di notte). Queste mosche possono essere valutate separatamente.
  8. Calcola la percentuale media di sonno recuperato (rispetto al basale) su 12 ore, 24 ore e 48 ore del periodo di recupero per ciascun genotipo.
  9. Dai dati del sonno, calcola la durata media e massima del sonno diurno sul basale e i giorni di recupero per ciascun genotipo.
    NOTA: il sonno di rimbalzo nelle mosche è caratterizzato da una maggiore quantità di sonno e da una maggiore profondità del sonno nei giorni di recupero. Il consolidamento del sonno viene utilizzato come misura della profondità del sonno. Le soglie di eccitazione potrebbero anche essere utilizzate come misura della profondità del sonno.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il Canton S (Cs) è stato utilizzato come ceppo selvatico. Le mosche sono state mantenute su una luce di 12 ore: 12 ore di buio e sonno privato per 12 ore durante la notte. L'ispezione dei profili del sonno delle mosche Cs nel giorno di base (bs), nel giorno di privazione del sonno (sd) e in due giorni di recupero (rec1 e rec2)(Figura 2A)suggerisce che le mosche sono state effettivamente private del sonno nello SNAP e hanno recuperato il sonno durante il giorn...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il sonno in Drosophila è stato caratterizzato in modo indipendente nel 2000, da due gruppi4,5. In questi studi pionieristici, le mosche sono state private del sonno da una manipolazione delicata (cioè la privazione della mano) e hanno dimostrato di mostrare una robusta risposta omeostatica alla privazione del sonno notturno. È importante sottolineare che con qualsiasi esperimento di privazione del sonno è fondamentale controllare i potenziali effetti con...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH 5R01NS051305-14 e 5R01NS076980-08 a PJS.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubi per attività locomotoria
Fisher Cera per la preparazione dei tessutiThermo Fisher13404-122Cera utilizzata per sigillare i tubi
Tubi di vetroApparecchio Wale244050Tagliamo il vetro Pyrex di 5 mm di diametro... tubi in tubi lunghi 65 mm  per registrare il sonno. Tubi pretagliati  Può anche essere acquistato.
Nutri Fly Bloomington Formulation cibo per moscheGenesee Scientific66-113Labs potrebbe utilizzare la propria ricetta di cibo per mosche. È importante che il sonno sia registrato con lo stesso cibo in cui sono state allevate le mosche.
Utensile rotante per il taglio del vetroDremel Multi Pro395Utilizzato per tagliare tubi di vetro lunghi 65 mm.
Monitoring Sleep
DAM System e software DAMFileScanSoftware Trikineticsutilizzato per acquisire i dati dai monitor DAM e salvare i dati acquisiti in un formato appropriato
Computer di acquisizione datiLenovoIdea Centre AIO3Un computer equivalente di qualsiasi produttore può sostituire
monitordi attività DrosophilaTricineticaDAM2Questi monitor sono utilizzati per registrare l'attività locomotoria delle mosche
Monitoraggio ambientaleTricineticaDEnMNon essenziale, ma un modo semplice per monitorare le condizioni ambientali nella camera in cui viene registrato il sonno
Controllore di luceTricineticoLC4Un modo conveniente per controllare i tempi di accensione e spegnimento dello SNAP
Unità di interfaccia di alimentazione per DAMTricineticaPSIU-9Necessario per i computer di acquisizione dati per registrare i dati di attività locomotoria tricinetica
Connettore RJ117001-64PCI monitor DAM Multicompaccettano jack RJ11
SplitterTricineticiSPLT5Utilizzato per collegare fino a 5 monitor DAM
Cavo telefonico Cavo telefonicoRadioshack278-367Cavi telefonici per acquisire dati dai monitor
DAMSleep Deprivation
AlimentatoreGw INSTEKGPS-30300Alimentatore per l'apparato di annullamento del
sonnoUniversity School of Medicine officina meccanica
i SNAP Washington

References

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