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Articolo metodologico

Modello di co-coltura senza contatto per lo studio dell'attivazione delle cellule immunitarie innate durante l'infezione da virus respiratorio

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DOI:

10.3791/62115

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28 febbraio 2021

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1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio un'indagine sulle prime interazioni tra cellule epiteliali nasali infettate viralmente e attivazione cellulare innata. I singoli sottoinsiemi di cellule immunitarie possono essere distinti in base alla loro attivazione in risposta alle infezioni virali. Possono quindi essere ulteriormente studiati per determinare i loro effetti sulle prime risposte antivirali.

Abstract

Le prime interazioni tra lo strato epiteliale nasale e le cellule immunitarie innate durante le infezioni virali rimangono un'area poco esplorata. Il significato della segnalazione dell'immunità innata nelle infezioni virali è aumentato sostanzialmente poiché i pazienti con infezioni respiratorie che mostrano un'elevata attivazione innata delle cellule T mostrano un esito migliore della malattia. Quindi, sezionare queste prime interazioni immunitarie innate consente di chiarire i processi che le governano e può facilitare lo sviluppo di potenziali bersagli terapeutici e strategie per smorzare o addirittura prevenire la progressione precoce delle infezioni virali. Questo protocollo descrive un modello versatile che può essere utilizzato per studiare la diafonia precoce, le interazioni e l'attivazione delle cellule immunitarie innate da fattori secreti da cellule epiteliali delle vie aeree infettate viralmente. Utilizzando un virus influenzale H3N2 (A/Aichi/2/1968) come modello di virus rappresentativo, l'attivazione cellulare innata delle cellule mononucleate del sangue periferico co-coltivate (PBMC) è stata analizzata utilizzando la citometria a flusso per studiare i sottoinsiemi di cellule che vengono attivate dai fattori solubili rilasciati dall'epitelio in risposta all'infezione virale. I risultati dimostrano la strategia di gating per differenziare i sottoinsiemi di cellule e rivelano le chiare differenze tra le popolazioni attivate di PBMC e il loro crosstalk con il controllo e l'epitelio infetto. I sottoinsiemi attivati possono quindi essere ulteriormente analizzati per determinare le loro funzioni e i cambiamenti molecolari specifici delle cellule. I risultati di tale indagine crosstalk possono scoprire fattori importanti per l'attivazione di popolazioni cellulari innate vitali, che sono utili nel controllare e sopprimere la progressione dell'infezione virale. Inoltre, questi fattori possono essere universalmente applicati a diverse malattie virali, in particolare ai virus emergenti di recente, per smorzare l'impatto di tali virus quando circolano per la prima volta in popolazioni umane ingenue.

Introduzione

I virus respiratori sono forse tra i patogeni più diffusi che causano gravi oneri sanitari ed economici. Dai periodici focolai globali di ceppi epidemici emergenti (ad esempio, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ai ceppi stagionali di influenza ogni anno, i virus sono una minaccia costante per la salute pubblica. Sebbene i vaccini costituiscano la maggior parte della risposta a queste sfide globali per la salute pubblica, fa riflettere notare che queste contromisure sono semplicemente reattive 1,2. Inoltre, un ritardo tra l'emergere di un nuovo ceppo infettivo e il successo dello sviluppo del suo vaccino è inevitabile3, portando a un periodo in cui le misure disponibili per frenare la diffusione del virus sono altamente limitate.

Questi ritardi sono ulteriormente enfatizzati dai costi che vengono inflitti alla società, economicamente e socialmente. L'influenza stagionale da sola è responsabile di circa 8 miliardi di dollari di costi indiretti, 3,2 miliardi di dollari di spese mediche e 36,3 mila morti negli Stati Uniti d'America ogni anno4. Questo prima di considerare i costi di ricerca necessari per finanziare lo sviluppo del vaccino. Le epidemie hanno effetti ancora più gravi sulla società, aggravati dal crescente tasso di globalizzazione ogni anno, come evidenziato dalle interruzioni globali causate dall'emergere e dalla rapida diffusione del coronovirus della sindrome respiratoria acuta grave 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.

Studi recenti hanno dimostrato che i pazienti infetti che hanno una maggiore popolazione di cellule T innate attivate tendono ad avere un esito migliore della malattia 8,9,10. Inoltre, la popolazione innata di cellule T è classificata in più sottogruppi: le cellule T invarianti associate alla mucosa (MAIT), le cellule T Vδ1 γδ, le cellule T Vδ2 γδ e le cellule T natural killer (NKT). Questi sottogruppi di cellule T innate mostrano anche eterogeneità all'interno delle loro popolazioni, aumentando la complessità delle interazioni tra le popolazioni cellulari coinvolte nella risposta immunitaria innata11. Quindi, il meccanismo che attiva queste cellule T innate e la conoscenza dei sottogruppi specifici di cellule T innate possono fornire una diversa via di ricerca per ridurre gli effetti infettivi di questi virus sull'ospite umano, specialmente durante il periodo di sviluppo del vaccino.

Le cellule epiteliali infettate dall'influenza producono fattori che attivano rapidamente le cellule T innate 12,13,14. Basandosi su questa scoperta, questo modello di co-coltura Air-Liquid Interface (ALI) senza contatto mira a imitare le prime interazioni chimiche (mediate da fattori solubili rilasciati dallo strato epiteliale infetto) tra lo strato epiteliale nasale infetto e le PBMC durante l'infezione precoce. La separazione fisica tra lo strato epiteliale nasale (coltivato su inserti di membrana) e le PBMC (nella camera sottostante) e l'integrità epiteliale prevengono l'infezione diretta delle PBMC da parte del virus, consentendo uno studio dettagliato degli effetti dei fattori solubili derivati dall'epitelio sulle PBMC. I fattori identificati possono quindi essere ulteriormente studiati per il loro potenziale terapeutico nell'indurre l'appropriata popolazione di cellule T innate che possono proteggere dall'infezione influenzale. Questo documento ha quindi dettagliato i metodi per stabilire una co-coltura per lo studio dell'attivazione innata delle cellule T da fattori solubili derivati dall'epitelio.

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Protocollo

NOTA: fare riferimento alla Tabella 1 per le ricette dei supporti utilizzati in questo protocollo.
NOTA: hNECS coltivati su transwell a 12 pozzetti sono stati trovati per crescere in uno spessore più ottimale per i fattori solubili per raggiungere facilmente la camera basale quando infettati dal virus dell'influenza. Quindi si raccomanda l'uso di transwell di dimensioni 12-well per la co-coltura.

1. Istituzione dello strato di alimentazione 3T3

  1. Stabilimento a partire da scorte congelate
    1. Scongelare una crioviale di fibroblasti NIH / 3T3 da scorte congelate. Aggiungere il contenuto della crioviale a 2 ml di Minimal Essential Media (DMEM) completo di Dulbecco e risospescere le cellule.
    2. Centrifugare per 5 minuti a 300 × g e temperatura/pressione ambiente (rtp), ed eliminare il surnatante. Risospesce le celle in DMEM completo.
    3. Conta le cellule usando la colorazione blu trypan. Aggiungere 10 μL di tripano blu a 10 μL della sospensione cellulare risospesa. Mescolare accuratamente e aggiungere 10 μL della sospensione a un emocitometro per contare le cellule.
    4. Cellule di semi ad una densità di 1 × 104 cellule/cm2 in un piatto di coltura appropriato (ad esempio, pallone T75). Incubare il matraccio di coltura risultante per 3 giorni a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
  2. Trattamento con mitomicina C
    1. A 3 giorni, assicurarsi che la confluenza sia del 60% -80%, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      NOTA: è importante che lo strato di alimentazione 3T3 non raggiunga la piena confluenza; in caso contrario, il trattamento con mitomicina C non sarà efficace.
    2. Aggiungere il DMEM completo integrato con mitomicina C al matraccio e incubare per 3,5 ore a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%. Rimuovere il mezzo contenente mitomicina C e lavare le cellule 2x con 1x PBS.
  3. Semina di cellule 3T3 in piastre a 6 pozzetti
    1. Aggiungere 3 mL di 1x tripsina-EDTA al pallone per 3-5 minuti per dissociare le cellule. Raccogliere le cellule dissociate in un tubo fresco da 15 ml. Centrifugare il tubo da 15 ml per 5 min a 300 × g, rtp; scartare il surnatante. Risospesce le celle in DMEM completo.
    2. Conta le cellule usando la colorazione blu trypan. Seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti a 7,5 × 10 5-2,5 × 106 cellule/ pozzetto. Incubare la piastra durante la notte a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
      NOTA: lo strato di alimentazione 3T3 è considerato pronto se le cellule sono sane. A questo punto, seminare le cellule staminali /progenitrici epiteliali nasali umane (hNESPC) sullo strato di alimentazione per l'espansione.
    3. Aggiungere DMEM completo al pallone e incubare a 37 ° C, 5% CO2 durante la notte per le cellule 3T3 per recuperare dal trattamento con mitomicina C.

2. Istituzione della coltura di cellule epiteliali nasali umane (hNEC)

NOTA: I campioni clinici devono essere ottenuti da pazienti privi di sintomi di infezione del tratto respiratorio superiore.

  1. Trasformazione del tessuto nasale in sospensione unicellulare
    1. Lavare il tessuto nasale in 1x PBS di Dulbecco (dPBS) (PBS senza Mg2+ e Ca2+) contenente 100 μL/mL di una miscela antibiotico-antimicotica. Tagliare il tessuto in piccoli frammenti e trattare il campione in 10 mg/mL di proteasi neutra durante la notte a 4 °C con agitazione.
    2. Centrifugare per 5 minuti a 200 × g e rimuovere il surnatante dopo la centrifugazione. Incubare il pellet in 1-2 ml di 1x tripsina-EDTA (37 °C, 15 min), e spegnere aggiungendo un volume di siero bovino fetale pari al 10% del volume nel tubo.
    3. Dissociare meccanicamente il tessuto digerito in aggregati unicellulari mediante pipettaggio, quindi far passare la sospensione risultante attraverso un filtro cellulare da 70 μm. Risospesce le celle in DMEM completo.
      NOTA: Dopo questo passaggio, la sospensione cellulare è una miscela di cellule terminalmente differenziate e cellule staminali che sono indicate come cellule staminali / progenitrici epiteliali nasali umane (hNESPC). L'obiettivo dei passaggi successivi è quello di selezionare e arricchire la popolazione hNESPC dalla miscela di diverse popolazioni cellulari.
  2. Semina di una sospensione a cella singola sullo strato di alimentazione 3T3 per la selezione di hNESPC
    1. Centrifugare la sospensione cellulare dal punto 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp) e rimuovere il surnatante. Risospese le cellule in 3-5 mL di mezzo 3.
      NOTA: Medium 3 è formulato per promuovere la crescita selettiva delle hNESPC.
    2. Conta le cellule tramite la colorazione blu tripano. Semina 1 x 106 celle in 2mL di mezzo 3 per pozzetto su piastra a 6 pozzetti contenente lo strato di alimentazione 3T3 preparato dopo aver rimosso il supporto nella piastra a 6 pozzetti. Incubare la co-coltura risultante a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
      NOTA: Dopo la semina, fare attenzione a non agitare la piastra in quanto ciò influenzerà l'attacco degli hNESPC.
    3. Cambiare il mezzo 3 (2 ml) ogni 2-4 giorni rimuovendo completamente il vecchio mezzo e sostituendolo con il mezzo fresco 3.
      NOTA: Il mezzo viene modificato per reintegrare i nutrienti e per evitare che condizioni eccessivamente acide influenzino negativamente la crescita delle hNESPC. L'intervallo tra ogni cambiamento di mezzo dipende da quanto acido (giallo) diventa il mezzo. Gli intervalli dovrebbero essere accorciati se il mezzo diventa acido rapidamente.
    4. Dopo 7-10 giorni, osservare che le hNESPC sono ad una confluenza adatta per trasferirle su inserti a membrana. Vedere la Figura 1 per la morfologia rappresentativa delle hNESPC in 3 diversi timepoint (2 giorni, 5 giorni e 10 giorni).
  3. Trasferimento di hNESPC su inserti a membrana
    NOTA: A causa del trattamento con mitomicina C, lo strato di alimentazione 3T3 si degraderà lentamente durante il periodo di espansione hNESPC. Ciò si tradurrà in un'adesione indebolita alla superficie del pozzo, consentendo il loro spostamento mediante lavaggio con una pipetta, lasciando dietro di sé solo le hNESPC sane.
    1. Rimuovere il mezzo e aggiungere 500 μL di 1x dPBS a ciascun pozzetto. Lavare le celle 3x con una micropipetta per rimuovere le celle 3T3 e scartare 1x dPBS. Osservare al microscopio che le hNESPC rotonde rimangono mentre lo strato di alimentazione 3T3 a forma di mandrino viene spostato.
    2. Aggiungere 500 μL di un reagente di disassociazione cellulare per pozzetto e incubare a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 5-10 minuti, o fino a quando le hNESPC si sono staccate dalla superficie del pozzo.
    3. Raccogliere la sospensione hNESPC, la centrifuga (300 × g, 5 min, rtp) e rimuovere il surnatante.
    4. Risospesso il pellet in mezzo 3. Conta le cellule tramite la colorazione blu tripano. Seme 3 × 104 cellule in 150 μL di mezzo 3 per inserto di membrana (piastra a 24 pozzetti) o 1 × 105 cellule in 300 μL di mezzo 3 per inserto di membrana (piastra a 12 pozzetti) (Figura 2). Incubare le cellule a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5%.
    5. Cambiare il mezzo (medio 3) delle camere apicali e basali ogni 2 giorni. Navigare tra i bracci di supporto dell'inserto a membrana per accedere alla camera basale, rimuovere il vecchio mezzo e quindi reintrodurre il mezzo fresco con lo stesso metodo. Sebbene la camera apicale sia facilmente accessibile, fare attenzione a non disturbare lo strato hNESPC in crescita.
      NOTA: Non disturbare il mezzo nella camera apicale per almeno 2 giorni dopo la semina poiché le cellule hanno bisogno di tempo per attaccarsi alla membrana.
  4. Differenziazione delle hNESPC in hNEC
    1. Quando le hNESPC raggiungono il 100% di confluenza (circa 3-7 giorni dalla semina sull'inserto a membrana), iniziare la coltura ALI. Cambiare il mezzo basale in mezzo di differenziazione e rimuovere il mezzo dalla camera apicale. Aggiungere il mezzo alla camera basale senza aggiungerlo alla camera apicale quando si cambia il mezzo ogni 2-3 giorni, come indicato nella Figura 3 e nel passaggio 2.3.5.
      NOTA: Medium viene cambiato in medium di differenziazione per promuovere la differenziazione degli hNESPC in hNEC in ALI. Le hNESPC impiegano circa 3-4 settimane per raggiungere la piena maturità per diventare hNEC in ALI, a quel punto le cellule sarebbero cresciute in un multistrato con diverse popolazioni di cellule in ogni strato. Le ciglia dovrebbero anche essere osservate con un ingrandimento di 400x (le ciglia possono essere identificate dal loro movimento di battito, che fa apparire il campo del microscopio come se stesse vibrando). A questo punto, le cellule sono pronte per essere utilizzate per gli esperimenti di co-coltura. Fare riferimento alla Figura 4 per la sezione trasversale di uno strato hNEC completamente differenziato.
    2. Dopo aver ottenuto hNEC maturi, lavare le cellule nella camera apicale 3x con 1x dPBS a intervalli di 2-3 giorni per 1 settimana prima dell'esperimento di co-coltura. Sinergizzare la fase di lavaggio con i cambiamenti del mezzo basale ed eseguire i lavaggi come segue.
      1. Aggiungere 50 μL (24-well)/150 μL (12-well) di 1x dPBS nella camera apicale dell'inserto a membrana e incubare le cellule a 37 °C per 10 min. Rimuovere il dPBS dopo 10 minuti di incubazione per rimuovere il muco accumulato e le cellule morte nel corso della differenziazione.
        NOTA: A seconda della natura dell'esperimento, la soluzione di bicarbonato di sodio può essere utilizzata per lavare completamente lo strato di muco. Tuttavia, per l'infezione virale negli esperimenti di co-coltura, lo strato di muco viene trattenuto e solo il muco in eccesso viene rimosso con il lavaggio dPBS. Questa ritenzione è quella di imitare lo strato di muco fisiologico presente sull'epitelio nasale che interagirà con l'infezione virale in arrivo.

3. Misurazione della resistenza elettrica transepiteliale (TEER)

NOTA: La conferma dell'integrità epiteliale è importante per garantire che si ottenga uno strato epiteliale intatto e sano. Uno strato epiteliale intatto viene determinato attraverso la misurazione TEER eseguita su 4 pozzi casuali utilizzando un voltohmmetro.

  1. Risciacquare l'elettrodo con etanolo al 70% e sterilizzarlo con luce ultravioletta per 15 minuti prima dell'uso per garantire la sterilità. Risciacquare con 1x dPBS dopo la sterilizzazione.
  2. Aggiungere 100 μL (per 24 pozzetti) o 300 μL (per 12 pozzetti) di 1x dPBS alla camera apicale dell'inserto a membrana. Incubare la piastra a 37 °C per 10 min; quindi, rimuovere il dPBS.
  3. Per ogni pozzetto da misurare, preparare un pozzo inutilizzato con 1 mL (per 24 pozzetti) o 3 mL (per 12 pozzetti) di terreno di differenziazione preriscaldato (a 37 °C). Posizionare l'inserto a membrana nel pozzetto preparato e aggiungere 200 μL (per 24 pozzetti) o 600 μL (per 12 pozzetti) di mezzo di differenziazione preriscaldato alla camera apicale. Equilibrare a 37 °C (soggetto alla temperatura di incubazione del tipo di virus aggiunto, ad esempio 35 °C per l'influenza) per 15 min.
    NOTA: Preparare un blank (inserto a membrana vuoto) allo stesso modo per il calcolo del TEER.
  4. Equilibrate anche un tubo da 15 mL di mezzo di differenziazione preriscaldato alla stessa temperatura per 15 minuti. Posizionare gli elettrodi nel tubo da 15 ml e accendere il voltohmmetro.
    NOTA: A questo punto, la lettura dovrebbe essere 0 resistenza, in quanto gli elettrodi sono nello stesso mezzo. Se si ottiene qualsiasi altra lettura, equilibrare l'elettrodo nel tubo da 15 ml fino a quando la lettura è 0.
  5. Partendo dal bianco, posizionare gli elettrodi in ciascun pozzetto in modo tale che un elettrodo sia immerso nel mezzo della camera apicale e l'altro nel mezzo della camera basale. Registrare la lettura solo quando si ottiene una lettura costante per un periodo di almeno 5 min.
  6. Dopo ogni misurazione, lavare l'elettrodo con PBS prima della misurazione successiva. Per ogni pozzo testato, prendere misure per tre campioni in diverse posizioni della membrana. Per calcolare il TEER netto di ciascun campione, sottrarre la resistenza di fondo, data dall'inserto a membrana vuota, da ogni misurazione.
  7. Calcola la lettura totale del TEER per un pozzo usando la seguente equazione:
    Integrità epiteliale (Ωcm2) = Net TEER(ohm) × Area della membrana (cm2)
    NOTA: I valori TEER delle hNEC per gli esperimenti di infezione virale devono essere >1000 Ωcm2 13,15,16. 

4. Isolamento dei monociti del sangue periferico e delle cellule NK

NOTA: I campioni di sangue devono essere ottenuti da volontari sani e utilizzati lo stesso giorno di isolamento.

  1. Raccogliere 30-40 ml di sangue intero da ciascun donatore in 10 ml di provette per la raccolta del sangue.
  2. Isolare i PBMC utilizzando la centrifugazione a gradiente di densità e ottenere PBMC dal buffy coat dopo i passaggi seguenti (vedere anche la Tabella dei materiali).
    1. Mescolare accuratamente ~ 10 ml di sangue dal tubo di raccolta del sangue in un vacutainer prima di diluire con un volume uguale di soluzione salina bilanciata (PBS).
    2. Aggiungere 15 mL di gradiente di densità medio alla base di un tubo da 50 mL.
      NOTA: Il rapporto tra gradiente di densità medio e sangue diluito deve essere 2:3-3,5.
    3. Strato 35 mL di sangue diluito sul mezzo gradiente di densità con una pistola a pipetta (con l'impostazione di erogazione impostata al minimo possibile) inclinando il tubo di 45° e permettendo al sangue diluito di cadere a goccia sulla parete interna del tubo in modo che lo strato di gradiente di densità medio non sia disturbato.
    4. Centrifuga lisata a 500 × g, 18-20 °C per 30 min (freno: spento). Rimuovere con cura e scartare lo strato di plasma superiore senza disturbare lo strato inferiore.
    5. Trasferire il buffy coat in un nuovo tubo senza mescolare lo strato di globuli rossi, lo strato medio di densità sfumata o il buffy coat. Una volta che il buffy coat è stato raccolto in un nuovo tubo da 50 mL, ricaricare il volume a 50 mL con 1x PBS.
    6. Centrifugare lisare a 800 × g, 18-20 °C, 8 min (freno: spento), e rimuovere il surnatante con una pistola a pipetta. Risospesciare il pellet cellulare con 50 mL di 1x PBS e centrifugare a 120 × g, 18-20 °C, 10 min per rimuovere le piastrine.
    7. Scartare il surnatante mediante pipettaggio, senza disturbare il pellet cellulare.
      NOTA: Poiché il pellet cellulare potrebbe essere sciolto, è sconsigliabile scartare il surnatante versando.
    8. Risospesciare il pellet cellulare con un supporto RPMI (Roswell Park Memorial Institute) completo. Eseguire un conteggio cellulare aggiungendo 10 μL di acido acetico al 3% con blu di metilene a 10 μL della sospensione cellulare risospesa. Mescolare accuratamente e aggiungere 10 μL della miscela a un emocitometro per contare le cellule.
  3. PBMC diluiti con RPMI completo medio ad una densità di 2 × 106/mL (per 24 pozzetti) o 4 × 106/mL (per 12 pozzetti).

5. Infezione virale hNEC e transizione alla co-coltura hNEC:PBMC

NOTA: H3N2 (A/Aichi/2/1968) è usato come ceppo rappresentativo dell'infezione in questo protocollo. La molteplicità dell'infezione (MOI) di 0,1 è usata come MOI rappresentativa in questo protocollo.

  1. Giorno 0 (Infezione da hNEC)
    NOTA: Un pozzo delle hNEC cresciuto dallo stesso donatore viene utilizzato per ottenere un conteggio cellulare rappresentativo per ogni pozzo utilizzato nell'esperimento.
    1. Nel pozzetto rappresentativo, aggiungere 150 μL di 1x tripsina-EDTA alla camera apicale dell'inserto a membrana e 350 μL di 1x tripsina-EDTA alla camera basale, e incubare a 37 °C per 10 minuti, o fino a quando le cellule si staccano dalla membrana.
    2. Lavare le cellule sulla membrana tubando su e giù e raccogliere la sospensione in un tubo centrifugo da 1,5 ml. Aggiungere 200 μL di DMEM completo per estinguere l'attività della tripsina. Conta le cellule tramite la colorazione blu tripano per ottenere il conteggio delle cellule per pozzo.
    3. Calcolare il MOI richiesto del virus in base al numero di cellule per pozzetto e diluire lo stock di virus di conseguenza con RPMI completo sul ghiaccio.
      NOTA: MOI 0,1 di 1,26 × 106 hNEC per pozzetto = 1,26 × 105 particelle virali H3N2 per pozzetto in 30 μL (per 24 pozzetti)/100 μL (per 12 pozzetti)
    4. Per i pozzetti rimanenti per l'esperimento di infezione, aggiungere 50 μL (per 24 pozzetti)/150 μL (per 12 pozzetti) di 1x dPBS nelle camere apicali degli inserti di membrana, incubare a 37 °C per 10 minuti e rimuovere 1x dPBS.
    5. Cambiare il mezzo basale negli inserti a membrana per completare il mezzo RPMI trasferendo gli inserti su una nuova piastra con RPMI completo aggiunto ai pozzetti (350 μL (per 24-well)/700 μL (per 12-well)).
      NOTA: quando gli hNESPC si sono completamente differenziati in hNEC, sono tolleranti/permissivi a supporti diversi per un massimo di 72 ore, senza modifiche alla morfologia o all'organizzazione quando il mezzo è passato a RPMI12. RPMI viene utilizzato per supportare la crescita e il mantenimento della popolazione PBMC.
    6. Aggiungere i 30 μL (per 24-well)/100 μL (per 12-well) preparati dell'inoculo virale nella camera apicale dell'inserto di membrana, incubare a 35 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 1 ora e rimuovere l'inoculo virale dalla camera apicale.
    7. Cambiare il mezzo basale dell'inserto a membrana in un mezzo RPMI fresco completo e incubare a 35 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 24 ore.
  2. Giorno 1 (istituzione della co-coltura hNECs + PBMC)
    1. Seminare il numero richiesto di PBMC in 150 μL (per 24 pozzetti)/300 μL (per 12 pozzetti) di mezzo RPMI completo aggiungendo direttamente la sospensione PBMC nella camera basale di ciascun pozzetto di hNEC non infetti o infetti dal giorno 0 (1,5 × 106 per piastre a 24 pozzetti e 3 × 106 per piastre a 12 pozzetti). Incubare a 37 °C per 24/48 h.
      NOTA: Il volume finale nella camera basale dopo l'istituzione della cocoltura è di 500 μL (per 24 pozzetti)/1000 μL (per 12 pozzetti).
  3. Giorni 2-3 (raccolta di PBMC 48/72 h infezione post-virale)
    1. Raccolta di supernatanti apicali (infezione post-virale 48/72 h)
      1. Aggiungere 50 μL (per 24 pozzetti)/150 μL (per 12 pozzetti) di 1x dPBS a ciascuna camera apicale e incubare a 37 °C per 10 min. Raccogliere 1x dPBS in tubi da 1,5 mL. Aliquota 25 μL (per 24 pozzetti)/50 μL (per 12 pozzetti) del surnatante per il saggio della placca in un nuovo tubo da 1,5 mL e congelare immediatamente sia il materiale che le aliquote a -80 °C.
    2. Raccolta di RNA cellulare da hNECs (infezione post-virale 48/72 h)
      1. Trasferire l'inserto della membrana in un pozzo pulito, aggiungere 300 μL (per 24-well)/600 μL (per 12-well) di tampone di lisi dell'RNA alla camera apicale e incubare a rtp per 5 min. Raccogliere il surnatante in un tubo di centrifuga da 1,5 ml e conservarlo a -80 °C fino all'estrazione dell'RNA per l'analisi molecolare.
    3. Raccolta PBMC (48/72 h infezione post-virale)
      1. Con l'ampia base di una punta di pipetta sterile, raschiare delicatamente la superficie del pozzo per rimuovere i PBMC attivati che potrebbero essere aderenti alla superficie del pozzo. Raccogliere il mezzo basale contenente PBMC in un tubo di centrifuga da 2 ml.
      2. Lavare i pozzetti 2x con 300 μL di 1x dPBS e raccogliere il lavaggio nello stesso tubo da 2 mL. Centrifugare il tubo da 2 mL (500 × g, 5 min, rtp) e raccogliere il surnatante in un tubo fresco da 2 ml senza disturbare il pellet cellulare. Conservare il surnatante a -80 °C per l'analisi delle citochine e delle chemochine; risospese il pellet di cella in 200 μL di 1x dPBS.

6. Citometria a flusso

NOTA: questa sezione del protocollo viene continuata direttamente dalla sezione precedente utilizzando la sospensione della cella PBMC dal passaggio 5.3.3.2. Garantire un'esposizione minima alla luce durante i passaggi seguenti in questa sezione. Un pannello campione di marcatori di colorazione superficiale è disponibile nella Tabella 2.

  1. Colorazione superficiale
    1. Trasferire il pellet di cella PBMC risospeso in una piastra del pozzo inferiore a 96 V. Centrifugare lisare a 800 × g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
    2. Incubare tutti i PBMC (ad eccezione di quelli "non macchiati") con 100 μL di una macchia di vitalità per 15 minuti a rtp. Ricarica fino a 200 μL con 150 μL di buffer MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting). Centrifugare lisare a 800 × g per 3 minuti e scartare il surnatante.
    3. Preparare un pannello di anticorpi coloranti superficiali di interesse con opportuni rapporti di diluizione e un volume finale di 50 μL per reazione (rabbocco con tampone MACS per ottenere il volume finale). Eseguire la colorazione superficiale aggiungendo 50 μL della miscela di anticorpi preparata alle cellule utilizzando una pipetta multicanale. Incubare a 4 °C per 15 minuti al buio.
    4. Lavare aggiungendo 150 μL di buffer MACS. Centrifugare lisare a 800 × g per 3 minuti e scartare il surnatante. Se non è richiesta la colorazione intracellulare, procedere direttamente all'incubazione di 15 minuti nel passaggio 6.3.
  2. Colorazione intracellulare (se necessario)
    1. Aggiungere 100 μL di una soluzione di fissazione e permeabilizzazione a ciascun pozzetto. Incubare a 4 °C per 20 minuti al buio. Riempire i pozzetti con 100 μL di 1x buffer MACS.
    2. Centrifugare (800 × g, 3 min, 25 °C) e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio aggiungendo 200 μL di 1x tampone di lavaggio permeabilizzazione. Centrifugare (500 × g, 3 min, 25 °C) e rimuovere il surnatante.
    3. Preparare le diluizioni per il pannello anticorpale di interesse per ottenere un volume finale di 50 μL utilizzando 1x tampone di lavaggio a permeabilizzazione. Incubare sul ghiaccio per 30 minuti al buio. Aggiungere 200 μL di 1x tampone di lavaggio a permeabilizzazione.
    4. Centrifugare le cellule (800 × g, 3 min, 4 °C) e rimuovere il surnatante. Risospesciare le cellule in 100 μL di tampone di selezione cellulare attivato dalla fluorescenza.
  3. Pipettare 200 μL di una soluzione di lisatura in ciascun pozzetto. Incubare per 15 minuti a rtp. Centrifugare lisare a 800 × g per 3 minuti ed eliminare il surnatante.
  4. Risospesare i pellet di cella in 200 μL di tampone MACS. Eseguire la citometria a flusso secondo le impostazioni descritte in precedenza13 o conservare a 4 °C al buio.

7. Determinazione dei livelli di citochine e chemochine

  1. Elaborare 25 μL del surnatante a camera basale utilizzando un test multisala immunologico secondo il protocollo18 del produttore.
  2. Calcola la concentrazione di ciascun analita utilizzando il software di gestione multiplex utilizzando un algoritmo di adattamento della curva (5 parametri) per la curva standard.

8. Valutazione della contaminazione virale

  1. Estrarre l'RNA virale utilizzando un kit di estrazione su 4 set di soluzioni: la soluzione H3N2 di riserva, la diluizione MOI 0.1 per l'infezione, le diluizioni seriali 10x del MOI 0.1 e il mezzo basale dai campioni (infezione post-virale sia 48 che 72 h)12.
  2. Selezionare il gene non strutturale (NS1) e la matrice (M1) come bersagli per la reazione a catena della polimerasi (PCR) (vedere la Tabella dei materiali per i primer utilizzati nell'esperimento rappresentativo).
  3. Eseguire la PCR a trascrizione inversa (RT-PCR) (42 °C, 60 min) per convertire l'RNA virale in cDNA prima di eseguire la PCR quantitativa (qPCR) per misurare i livelli di NS1 e M1 come proxy per la presenza virale e correlare i livelli alla curva standard ottenuta dalla RT-qPCR eseguita sulla diluizione seriale 10x dell'aliquota MOI 0.1. Fare riferimento alla Tabella 3 per la composizione delle miscele di reazione e utilizzare le seguenti condizioni: preincubazione a 95 °C per 10 minuti, seguita da un'amplificazione in 3 fasi per 40 cicli: 95 °C per 10 s, 60 °C per 10 s, 72 °C per 30 s; curva di fusione: 95 °C per 10 s, 65°C per 60 s e 97 °C per 1 s.

9. Analisi della placca

  1. Giorno 0: semina MDCK (Madin Darby Canine Kidney) in piastre a 24 pozzetti
    1. Rimuovere il mezzo da un pallone T75 di celle MDCK confluenti. Lavare 2x con 1x PBS per rimuovere tutte le tracce di siero. Tripsinizzare le cellule MDCK aggiungendo 10 ml di tripsina e incubando a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 20-30 minuti fino a quando le cellule si staccano.
      NOTA: non toccare il pallone in quanto ciò potrebbe causare aggregazione.
    2. Pipettare la sospensione cellulare in un tubo da 15 mL contenente 2 mL di Eagle's Minimal Essential Medium (EMEM) completo. Centrifugare (300 × g, 5 min, rtp) e rimuovere il surnatante.
    3. Risospesere le celle in 6 mL di EMEM completo. Conta le cellule con la colorazione blu del tripano.
    4. Diluire la sospensione cellulare MDCK ad una concentrazione di 1 × 105 cellule/mL e seminare 1 mL della sospensione diluita in ciascun pozzetto di una piastra sterile a 24 pozzetti. Incubare a 37 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 24 ore per ottenere un monostrato confluente di cellule MDCK in ciascun pozzetto.
  2. Giorno 1: infezione delle cellule MDCK
    1. Preparare il mezzo di infezione. Rimuovere il mezzo dal monostrato MDCK nella piastra a 24 pozzetti e lavare 2 volte con 1x dPBS. Per il secondo lavaggio, lasciare il PBS nei pozzetti mentre si preparano le diluizioni seriali del virus.
    2. Scongelare i campioni di virus sul ghiaccio e diluirli in serie in una piastra a 24 pozzetti per ottenere diluizioni seriali da 10-1 a 10-6.
      NOTA: Ad esempio, riempire ogni pozzetto in una piastra a 24 pozzetti con 270 μL di terreno di infezione.
    3. Aggiungere 30 μL del campione di virus al primo pozzetto della fila. Con una nuova punta della pipetta, mescolare bene e trasferire al pozzo successivo nella fila per diluire il campione di 10 volte. Procedere fino a quando non è stata raggiunta una diluizione di 10-6 ; eseguire i passaggi 9.2.1-9.2.3 per tutti i campioni di virus.
    4. Rimuovere PBS dalla piastra MDCK e infettare in duplice copia con 100 μL delle diluizioni virali preparate. Per i pozzetti di controllo, aggiungere 100 μL del mezzo di infezione (senza il campione virale). Incubare a 35 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 1 ora, agitando la piastra per eliminare i punti asciutti ogni 15 minuti.
    5. Rimuovere l'inoculo virale e aggiungere 1 mL di rivestimento liquido per ciascun pozzetto. Incubare a 35 °C in un'atmosfera di CO2 al 5% per 72 ore.
  3. Giorno 4 (72 h post-infezione): visualizzazione della placca
    1. Rimuovere la sovrapposizione liquida e fissare le cellule con il 4% di formaldeide in 1x PBS per 1 ora. Rimuovere la soluzione di formaldeide e lavare una volta con 1x PBS o acqua distillata.
    2. Macchiare le cellule fisse aggiungendo una soluzione viola cristallina all'1% per 15 minuti. Rimuovere il colorante viola cristallino e lavare le cellule con acqua corrente. Asciugare la piastra a rtp.
    3. Una volta asciutto, conta le placche e calcola il titolo virale secondo la seguente formula:
      Numero di placche × fattore di diluizione = numero di placche - unità formanti in 100 μL

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Risultati

Sebbene le cellule T convenzionali costituiscano il principale repertorio di risposta immunitaria adattativa contro l'infezione virale per facilitare la clearance virale, la popolazione innata di cellule T lavora su uno spettro più ampio per sopprimere la carica virale per una clearance efficace in una fase successiva. Pertanto, questo protocollo crea specificamente una condizione robusta per studiare le cellule T innate, la loro attivazione e la loro popolazione funzionale a seguito dell...

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Discussione

Le risposte immunitarie innate contro i virus sono un campo di studio poco studiato nella gestione antivirale. Le cellule epiteliali delle vie aeree e le cellule immunitarie innate lavorano di concerto per sopprimere la replicazione virale durante un'infezione, oltre a servire come determinante della risposta adattativa iperattiva se la carica virale non viene tenuta sotto controllo 12,13,17. Tuttavia, lo sviluppo di un modello ...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare il personale di ricerca del Dipartimento di Otorinolaringoiatria della NUS e del Dipartimento di Microbiologia e Immunologia per il loro aiuto con il lavoro relativo alla cultura hNEC e alla cultura virale. Vorremmo anche ringraziare i chirurghi e il team chirurgico del National University Hospital, Dipartimento di Otorinolaringoiatria, per la loro assistenza nel fornire i campioni di cellule e sangue necessari per lo studio.
Questo studio è stato finanziato dal National Medical Research Council, Singapore No. NMRC/CIRG/1458/2016 (a De Yun Wang) e MOH-OFYIRG19may-0007 (a Kai Sen Tan). Kai Sen Tan ha ricevuto una borsa di studio sostenuta dalla European Allergy and Clinical Immunology (EAACI) Research Fellowship 2019.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,5% Tripsina-EDTAGibco15400-054
0,5 M Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA), pH 8,0, privo di RNasiThermofisherAM9260G0,5 M EDTA
1,5 mL Provette SafeLockEppendorf00301200861,5 mL Provette per centrifuga 10
mL K3EDTA Provette VacutainerBD36664310 mL 10 mPBS
Gibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
Piastra a 12 pozzettiCorning 3513
Inserto per pozzetto trans a 12 pozzettiCorning Inserto a membrana3460
1x Soluzione di lisi FACSBD349202
Provette SafeLock da 2,0 mLEppendorf0030120094Provetta da centrifuga da 2 mL
a 24 pozzettiCorning 3524
Inserto per pozzetto a 24 pozzettiCorning 3470
Acido acetico al 3% con blu di metileneSTEMCELL Technologies07060
3,3',5-triiodo-l-tironinaSigmaT-074
Soluzione di formaldeide al 37% con metanolo al 15% come stabilizzante in H2OSigma533998
5810R CentrifugaEppendorf5811000320
5 mL di polipropilene tubi (tubi di flusso)BD352058
70 µ m Filtro cellulareCorning 
A-4-62 RotoreEppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501Reagente di dissociazione cellulare
Antibiotico-AntimicoticoGibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolimeroNASovrapposizione liquida
Bio-Plex Manager 6.2 Software standardBio-Rad Laboratories, Inc171STND01Multiplex Manager Software
Ago a farfalla 21 GBD367287
Colera TossinaSigmaC8052
Cristallo Violetto MerckC6158
Cytofix/Cytoperm SolutionBD554722di fissazione e permeabilizzazione
Dispase IISigmaD4693Proteasi neutra
DMEM/Alto glucosioGE Healthcare Life SciencesSH30243.01
DMEM/Miscela di nutrienti F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP MixPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (w L-Glutammina)ATCC30-2003
Dispositivo voltohmmetro EVOMWPI, Sarasota, FL, USA300523
FACS Lysing SolutionBD3492021x Soluzione di lisi
Falcon tube 15 mLCellStar 18827115 mL provetta
Falcon 50 mLCellStar22726150 mL Provette
Fast Start Essential DNA Probes MasterRoche6402682001qPCR Master Mix
Ficoll Paque Strumentidi ricerca17544203Gradiente di densità
H3N2 (A/Aichi/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 Sequenza di primer in avantiSigma5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 Sequenza di primer inversaSigma5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 Sequenza di primer in avantiSigma5'- ACCCGTGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 Sequenza di primer inversaSigma5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'Siero
fetale bovino inattivato a caldoGibco10500-064
hNESPCsDonatori umaniNA
Fattore di crescita epiteliale umanoGibco-InvitrogenPHG0314
IdrocortisoneTecnologie STEMCELL7925Raccolto da biopsie nasali durante interventi
chirurgici di deviazione del settoInsulinaSigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR
Strumento Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *per eccitazione UVThermofisherL23105Viability Stain
MILLIPLEX MAP Citochine/Chemochine umane Pannello di perline magnetiche II - Premiscelato 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23Immunologia Multiplex Assay
Mitomicina CSigmaM4287
M-MLV 5x BufferPromegaM1705RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Trascrittasi inversaPromegaM1706Supplemento di trascrittasi inversa
N-2Gibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
Perm/Wash BufferBD554723Permeabilizzazione Integratore Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10xTecnologie STEMCELL5001
PneumaCult-ALI Medium basaleTecnologie STEMCELL5001
Supplemento di mantenimento PneumaCult-ALI (100x)Tecnologie STEMCELL5001
Primer casualiPromegaC1181Primer casuali
Inibitore ricombinante della rnasinaPromegaN2511RNase Inibitore RNA
Lisi TamponeQiagenParte di 52904
RPMI 1640 (w L-Glutammina)ATCC30-2001
STX2 elettrodiWPI, Sarasota, FL, USASTX2Elettrodo
T25 PalloneCorning430639
T75Pallone Corning430641U
TPCK TrypsinSigmaT1426
Trypan BlueHycloneSV30084.01
Kit di estrazione dell'RNA viraleQiagen52904Kit di estrazione dell'RNA virale
Piastra a 96 pozzetti a forma di VCorning3894
431751 Soluzione premium

Riferimenti

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