Istituzione di un modello di ratto di occlusione sagittale-seno superiore tramite un metodo thread-embolismo

La trombosi venosa cerebrale (CVST) è una malattia rara del sistema venoso cerebrale che rappresenta solo lo 0,5-1,0% di tutte le cause di ictus ma ha un tasso di occorrenza relativamente elevato nei bambini e nei giovani^{adulti 1}. Durante l'autopsia, la CVST è stata trovata come la causa del 10% dei decessi per malattia cerebrovascolare². La trombosi può verificarsi in qualsiasi parte del sistema venoso intracraniale. Il seno sagittale superiore (SSS) è una delle aree più comunemente colpite in CVST e può coinvolgere più vasi sanguigni. A causa della stenosi o dell'occlusione dei seni venosi, il ritorno venoso intracraniciale è bloccato, che è spesso accompagnato da un aumento della pressione intracranale³. Le manifestazioni cliniche del CVST sono complesse e variano nel tempo; sebbene vi sia una mancanza di specificità dei sintomi, i sintomi più comuni includono mal di testa (77,2%), convulsioni (42,7%) e deficit neurologici (39,9%). Nei casi più gravi, il coma e persino la morte possono^{verificarsi 4,5}. Negli ultimi anni, a causa del miglioramento generale degli standard medici e sanitari e della consapevolezza della salute pubblica, la proporzione di fattori di rischio correlati è cambiata, la percentuale di traumi e infezioni è diminuita e la percentuale di CVST causata da gravidanza, puerperium, contraccettivi orali e altri motivi è gradualmente^{aumentata di 5}.

Al momento, la patogenesi del CVST non è ancora ben compresa. Per esplorare in profondità il CVST, è necessaria un'ulteriore ricerca fisiopatica. Tuttavia, la maggior parte di questi metodi di ricerca sono invasivi e quindi difficili da implementare clinicamente. A causa di molti limiti della ricerca clinica, i modelli animali hanno vantaggi insostituibili in termini di ricerca di base e traslazione.

La causa della CVST è complessa, in quanto il suo esordio iniziale è spesso non riconosciuto e la posizione della formazione di trombo è altamente variabile. Fortunatamente, i modelli animali possono ottenere un migliore controllo di questi fattori. Negli ultimi decenni, è stata stabilita una varietà di modelli animali CVST e ogni modello ha i suoi svantaggi. Secondo diversi metodi di produzione, possono essere approssimativamente suddivisi nelle seguenti categorie: il semplice modello di legatura SSS^6,7; l'acceleratore di iniezione interna SSS modello^8; la trombosi SSS indotta dal cloruro ferrico modello^9; la trombosi SSS indotta fotochimica modello^10; e l'embolia-occlusione autoprodista modello SSS¹¹. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli non è in grado di aggirare i danni invasivi alla corteccia cerebrale dell'animale e non è in grado di controllare con precisione il tempo e la posizione ischemica. In alcuni modelli, il trombo si ricanalizzerà spontaneamente; in altri modelli, l'SSS diventa permanentemente occluso. Inoltre, operazioni complicate e/o lesioni gravi possono influire sui successivi risultati fisiopatologici in questi modelli.

Nel presente studio, una spina di filettatura è stata inserita nel SSS dei ratti Sprague-Dawley (SD) per stabilire con successo un modello CVST che riduceva al minimo i danni, permetteva una controllabilità precisa e produceva una buona stabilità. Inoltre, la risonanza magnetica (MRI) di piccoli animali e l'imaging del flusso sanguigno con macchie laser sono state combinate per verificare l'efficacia del modello. Abbiamo valutato i cambiamenti nel flusso sanguigno cerebrale prima e dopo la definizione del nostro modello, nonché valutato la stabilità del nostro modello, gettando le basi per ulteriori studi che esplorano l'occorrenza, lo sviluppo e i relativi meccanismi fisiopatologici del CVST.

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato per le norme mediche e l'etica dell'Università medica di Wenzhou e sono in conformità con la legislazione cinese sull'uso e la cura degli animali da laboratorio.

1. Preparazione della spina del filo, ratti SD e attrezzature sperimentali

1. Utilizzare un filo di nylon con un diametro di 0,28 mm come corpo principale della spina del filo.
   NOTA: La morbidezza e la durezza del filo di nylon dovrebbero essere moderate.
2. Coprire un'estremità del filo di nylon con materiale silicone. La lunghezza della parte in silicone del tappo del filo è di circa 1,2 cm e il diametro è di circa 1,2 mm. L'estremità della testa è affusolata e la parte in silicone è cilindrica. Prenota altri 5-7 cm. Il filo di nylon è facile da bloccare e può essere tagliato in base alle esigenze specifiche dopo l'operazione.
3. Utilizzare il 75% di etanolo per immergere il tappo del filo per 3 minuti prima dell'operazione e risciacquare l'etanolo residuo con soluzione salina normale prima di tappare.
4. Selezionare 12 ratti SD maschi di peso compreso tra 280 e 320 g e dividerli casualmente in un gruppo fittizio e in un gruppo sperimentale (n = 6 per gruppo). Dopo una settimana di adattamento ambientale, digiunare i ratti per 12 ore e privarli d'acqua per 4 ore prima dell'operazione.
5. Preparare le seguenti attrezzature sperimentali necessarie per l'esperimento: una piccola macchina per l'anestesia animale, uno strumento stereotassico cerebrale, un microscopio sezionante, un trapano teschio ad alta velocità, forbici, pinzette, pinze vascolari, un portaaghi, un filo d'ago, una siringa da 2 ml, un sistema di imaging a flusso sanguigno con macchie laser e uno scanner MRI per piccoli animali.

2. Costruzione del modello SD-Rat SSS-Embolization tramite l'embolizzazione del filo

1. Posizionare il ratto SD in una scatola di induzione dell'anestesia e utilizzare una macchina anestetica per piccoli animali per fornire il 4% di isoflurane per indurre l'anestesia. Successivamente, utilizzare le forcep per confermare che gli arti posteriori e le dita posteriori del ratto SD non rispondono al pizzicare moderatamente.
2. Fissare rapidamente il ratto SD con i capelli rasati in posizione prona su un dispositivo stereotassico cerebrale. Mantenere l'anestesia con isoflurane 1,5-2,0% (ad una velocità di 0,5 L/min) e stabilizzare la frequenza respiratoria a 40-60 respiri/min. Stabilizzare la temperatura corporea del ratto tramite una pastiglia riscaldante a 37±0,2 °C.
   1. Applicare lubrificante oculistico oftalmico sterile dopo che il ratto è stato posizionato sul telaio stereotassico per proteggere le cornee dall'essiccazione durante l'anestesia.
3. Sterilizzare la superficie sulla parte superiore della testa del topo con il 5% di iodio di povidone alternato tre volte con il 75% di etanolo. Fare un'incisione cutanea (lunga 2,0 cm) al centro della testa, quindi staccare con cura la fascia superiore e il periosteo per esporre completamente il cranio.
   1. Confermare le posizioni delle fontanelle anteriori, delle fontanelle posteriori, della sutura coronale, della sutura sagittale e della sutura a spina di pesce.
4. Utilizzare l'area compresa tra la sutura coronale e la sutura a spina di pesce come area osservazionale del flusso sanguigno. Per evitare che il cranio influenzi l'osservazione durante l'imaging del flusso sanguigno con macchie laser, assottigliare il cranio nell'area di osservazione fino a quando i vasi sanguigni non sono chiaramente visibili. La dimensione del cranio assottigliato dovrebbe essere di circa 1,0 cm × 1,0 cm. Questo passaggio e quanto segue vengono tutti eseguiti al microscopio di sezionamento.
   1. Durante la macinazione del cranio, utilizzare la soluzione salina a temperatura normale per risciacquare ripetutamente il trapano per evitare ustioni ad alta temperatura alla corteccia cerebrale.
5. Utilizzare un trapano ad alta velocità per macinare il cranio all'interno di una finestra ossea da 6,0 mm x 4,0 mm centrata sul bregma per esporre le SSS dell'area bregma.
   1. Utilizzare la normale salina per raffreddare il cranio durante la macinazione. Quando il cranio diventa sottile, utilizzare una pinzetta per rimuovere con cura i restanti pezzi ossei per evitare di strappare le SSS.
6. Scegliere una spina di filettatura adatta, utilizzare il punto bregma SSS come punto di spina, forarla con cura con un ago da 2 ml di siringa e inserire rapidamente la testa del tappo del filo nel punto della spina.
   1. In questo momento, l'angolo tra l'estremità della testa del tappo del filo e l'SSS dovrebbe essere di circa 30-45°; quindi regolare l'angolo tra l'estremità della spina del filetto e l'SSS a 0-10 gradi, quindi inserire lentamente l'SSS al centro fino a quando la testa raggiunge il bordo posteriore della confluenza del seno. Successivamente, tagliare la parte in eccesso della coda.
      NOTA: Un rapido sanguinamento può verificarsi quando l'SSS viene perforato. Se l'estremità della spina del filetto non può essere inserita rapidamente nel punto di spina contemporaneamente, utilizzare una piccola garza o un batuffolo di cotone per premere delicatamente il punto di spina mentre si scivola lentamente verso il basso per esporre attentamente il punto di spina, quindi inserire rapidamente l'estremità del bullone del filo nel SSS. Dopo l' inserita della spina del filo, se c'è sanguinamento nel punto della spina, materiali emostatici come una spugna di gelatina possono essere utilizzati per fermare il sanguinamento.

3. Rilevamento del flusso sanguigno sulla superficie cerebrale dei ratti SD

1. Utilizzare una sorgente di luce laser per illuminare uniformemente l'area osservazionale del flusso sanguigno. La luce riflessa viene raccolta da una telecamera e trasmessa a un computer per l'analisi. Utilizzare le seguenti impostazioni di parametro per il sistema di imaging del flusso sanguigno laser-speckle: lunghezza d'onda: λ = 785 nm; e tempo di esposizione dell'immagine: T = 10 ms.
2. Centrare l'area osservativa del flusso sanguigno del ratto SD nel campo visivo del sistema di imaging del flusso sanguigno con macchie laser e condurre un monitoraggio continuo del flusso sanguigno sulla superficie cerebrale per 2 minuti. Raccogliere ed elaborare i dati del flusso sanguigno prima e dopo l'embolizzazione per ogni ratto SD e ottenere la mappa del flusso sanguigno con macchie laser dell'area osservata.
3. Risciacquare ripetutamente l'area utilizzata con la normale soluzione salina per lavare via detriti ossei e residui. Suturare la pelle (filo 0#) e disinfettare con iodoforo.
4. Mantenere la temperatura corporea fino a quando il ratto si sveglia dopo l'intervento chirurgico e poi alloggiare in un'unica gabbia con cibo e acqua forniti ad libitum. Il gruppo fittizio non può essere collegato.
5. Al termine della raccolta dei dati, eseguire la post-elaborazione.
   1. Selezione completa della regione di interesse (ROI) tramite gli strumenti forniti dal software del sistema di imaging del flusso sanguigno con macchie laser. I valori ottenuti sono il valore medio del flusso sanguigno nel ROI e i valori locali del flusso cerebrale-sanguigno prima e dopo l'embolizzazione. Utilizzare il valore del flusso sanguigno prima dell'embolizzazione come valore di base.
   2. Selezionare quattro ROI e misurare la variazione relativa del flusso sanguigno cerebrale in ogni ROI, espressa come variazione percentuale rispetto al valore di base.

4. Individuazione della posizione del filo su piccoli animali RISONANZA

1. Utilizzare i seguenti parametri T2-weighted imaging (T₂WI) per il sistema di imaging MRI: tempo di eco (TE) = 33 ms, tempo di ripetizione (TR) = 3000 ms, numero di eccitazione (NEX) = 4, Fette = 28, spessore fetta = 0,8 mm, dimensione matrice = 256*256 mm², angolo di capovolgimento = 80°, campo visivo (FOV) = 30*30 mm², tempo di scansione = 6 min 24 s; i parametri dell'angiografia a risonanza magnetica (MRA) sono stati impostati come segue: TE = 4,4 ms, TR = 12 ms, NEX = 4, fette = 80, spessore fetta = 0,4 mm, dimensione matrice = 256* 256 mm², angolo di capovolgimento = 80°, FOV = 30*30 mm², tempo di scansione = 16 min 23 sec 40 ms.
2. Fissare l'animale sulla tabella di scansione mri, calibrare la posizione del cervello posizionando la scansione ed eseguire la scansione della sequenza WI e MRA T₂dopo aver confermato la posizione.
3. Utilizzare l'anestesia continua tramite la macchina per l'anestesia animale durante il rilevamento. Quindi, eutanasiare i ratti SD mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital eccessivo.
4. Acquisizione e post-elaborazione dell'immagine: dopo aver raccolto i dati dell'immagine, al fine di osservare più chiaramente lo stato della spina del filo nelle SSS, utilizzare lo pseudo metodo di miglioramento del colore per visualizzare l'immagine WI T₂del cervello del topo.

Per stabilire il modello SSS-trombosi del ratto SD tramite il metodo di sutura, la sutura deve essere preparata in anticipo(figura 1A)e devono essere preparate le attrezzature necessarie per l'esperimento(figura 1B). A causa della delicatezza dell'operazione, la preparazione del modello deve essere completata al microscopio di sezionamento. I passaggi principali sono riportati nella figura 2. Per facilitare la descrizione dei dettagli specifici dell'osservazione del flusso sanguigno del modello, la figura 3B contrassegna l'area osservazionale del flusso sanguigno, la finestra ossea e il punto di spina e mostra anche lo stato della spina del filo inserita nell'SSS (Figura 3C). Una volta completata la preparazione del modello, l'imaging del flusso sanguigno con macchie laser viene utilizzato per rilevare il flusso sanguigno sulla superficie cerebrale dei ratti SD (Figura 4A, B). La figura 4C mostra che il flusso sanguigno nelle vene SSS e ponte (CV) è diminuito significativamente rispetto a quelli dell'arteria cerebrale media (MCA) e dei capillari (POP). Successivamente, la risonanza prima di piccole dimensioni viene utilizzata per rilevare lo stato della spina del filetto nell'SSS dalla posizione orizzontale (Figura 5A), dalla posizione sagittale (Figura 5B) e dalla posizione coronale (Figura 5C). Le immagini mostrano che la spina del thread è in posizione, il che conferma l'embolizzazione del SSS.

Figura 1. Immagine dell'embolia del filo e delle condizioni sperimentali. (A) Immagine dell'embolia del filo autoprodutta (a: testa filo-embolia, b: corpo filo-embolia). Barra di scala =5 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2. I passaggi principali del modello SD-rat SSS-trombosi. (A) Bloccare le dita degli arti posteriori del ratto SD con pinze per verificare l'anestesia riuscita. (B) Fissare il ratto SD su un dispositivo stereotassico e sterilizzare la superficie sulla parte superiore della testa. (C)Tagliare la pelle. (D) Staccare la fascia superiore e il periostio ed esporre completamente il cranio. (E) Trivellare e lucidare l'area di osservazione e il cranio della finestra ossea fino a quando i vasi sanguigni non sono chiaramente visibili. (F) Rimuovere con cura i frammenti ossei alla finestra ossea con le forceps per evitare di strappare l'SSS. (G) Selezionare una spina di filettatura adatta. (H) Utilizzare un ago per siringhe per perforare il punto della spina e inserire rapidamente il tappo del filo. (I) Regolare l'angolo tra la spina del filetto e l'SSS. (J) Inserire lentamente la sutura. (K) fino a quando la punta raggiunge il bordo posteriore della confluenza del seno. (L) Sutura del cuoio capelluto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Osservazione e funzionamento dei ratti SD. (A) Sono stati esposti punti di riferimento anatomici del cranio superiore dei ratti SD per facilitare la posizione delle SSS (a: bregma, b: bregma posteriore). (B) L'area rossa arrotondata-rettangolare è l'area di osservazione del flusso sanguigno e l'area blu arrotondata-rettangolare è la finestra ossea. L'area circolare rossa è il punto di spina e la freccia punta al seno sagittale superiore. (C) Stato della spina inserita nell'SSS dal punto di spina (freccia blu). La freccia bianca punta al corpo della spina, mentre la freccia rossa punta alla testa del filo. Barra di scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Confronto del flusso sanguigno prima e dopo l'inserimento del filo-embolia. Imaging del flusso sanguigno con macchie laser del flusso sanguigno cerebrale dei ratti SD (A) prima e (B) dopo l'embolizzazione. La colonna blu-rosso a destra rappresenta la gamma di valori del flusso sanguigno da piccoli a grandi. In (A), il ROI selezionato è contrassegnato (a: SSS, b: BV, c: MCA, d: CAP). (C) Viene mostrato un grafico a barre del flusso sanguigno cerebrale relativo (CBF). L'analisi univiva della varianza ha rivelato una significativa diminuzione del flusso sanguigno nelle SSS e BV (# P <0.001 vs MCA e CAP; * P <0.001 vs MCA e CAP). Barra di scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Risultati della verifica della risonanza 10. La risonanza prima di piccole dimensioni mostra lo stato della spina del filo (mostrato dalla freccia nera) nelle SSS da posizioni orizzontali (A), sagittal (B) e coronali (C). Barra di scala = 2 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Svantaggi dei modelli animali CVST.

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.