Questo protocollo di frazionamento consentirà ai ricercatori di isolare proteine citoplasmatiche, nucleari, mitocondriali e di membrana da cellule di mammifero. Le ultime due frazioni subcellulari vengono ulteriormente purificate tramite gradiente di densità isopicnica.
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Articolo metodologico
Frazionamento cellulare di cellule U937 mediante purificazione del gradiente di densità isopicnica
In questo articolo
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Sommario
Abstract
Questo protocollo descrive un metodo per ottenere frazioni proteiche subcellulari da cellule di mammifero utilizzando una combinazione di detergenti, lisi meccanica e centrifugazione a gradiente di densità isopicnica. Il vantaggio principale di questa procedura è che non si basa sul solo uso di detergenti solubilizzanti per ottenere frazioni subcellulari. Ciò consente di separare la membrana plasmatica da altri organelli legati alla membrana della cellula. Questa procedura faciliterà la determinazione della localizzazione delle proteine nelle cellule con un metodo riproducibile, scalabile e selettivo. Questo metodo è stato utilizzato con successo per isolare proteine citosoliche, nucleari, mitocondriali e di membrana plasmatica dalla linea cellulare monocitaria umana, U937. Sebbene ottimizzata per questa linea cellulare, questa procedura può servire come punto di partenza adatto per il frazionamento subcellulare di altre linee cellulari. Le potenziali insidie della procedura e come evitarle sono discusse così come le alterazioni che potrebbero dover essere considerate per altre linee cellulari.
Introduzione
Il frazionamento subcellulare è una procedura in cui le cellule vengono lisate e separate nei loro componenti costitutivi attraverso diversi metodi. Questa tecnica può essere utilizzata dai ricercatori per determinare la localizzazione delle proteine nelle cellule di mammifero o per l'arricchimento di proteine a bassa abbondanza che altrimenti non sarebbero rilevabili. Mentre attualmente esistono metodi per il frazionamento subcellulare, così come i kit commerciali che possono essere acquistati, soffrono di diverse limitazioni che questa procedura tenta di superare. La maggior parte dei metodi di frazionamento cellulare sono esclusivamente a base di detergente
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Protocollo
1. Preparare tamponi e reagenti
- Preparare soluzioni fresche di fosfatasi e inibitori della proteasi.
- Aggiungere 17,4 mg di fenilmetansulfonil fluoruro (PMSF) a 1 mL di etanolo al 100% per preparare una scorta di 100 mM.
NOTA: Indossare dispositivi di protezione quando si maneggia PMSF in quanto è pericoloso se ingerito o inalato e a contatto con la pelle o gli occhi. È corrosivo per gli occhi e la pelle. - Secondo le istruzioni del produttore, preparare un cocktail inibitore della proteasi disponibile in commercio (100x).
- Aggiungere 91,9 mg di ortovanadato di sodio (SOV) a 1 mL di acqua deionizzata per preparare una scorta di 50....
- Aggiungere 17,4 mg di fenilmetansulfonil fluoruro (PMSF) a 1 mL di etanolo al 100% per preparare una scorta di 100 mM.
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Risultati
Un diagramma di flusso schematico di questa procedura (Figura 1) riassume visivamente i passi che sono stati intrapresi per frazionare con successo U9375 cellule cresciute in sospensione. Le frazioni raccolte dalla parte superiore del gradiente di densità isopicnica in volumi uguali (1 ml) mostrano la purificazione delle frazioni mitocondriali e di membrana (Figura 2). L'utilizzo di un anticorpo contro VDAC, una proteina localizzata nella.......
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Discussione
Questo metodo è una versione modificata di un approccio precedentemente pubblicato al frazionamento subcellulare senza l'uso della centrifugazione ad alta velocità11. Questo metodo modificato richiede attrezzature più specializzate per ottenere i migliori risultati, ma è più completo e costantemente riproducibile.
Lo sviluppo del protocollo iniziale è stato necessario a causa dell'incapacità di separare campioni mitocondriali e di membrana per l'analisi della localizzaz.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da NIH R15-HL135675-01 e NIH 2 R15-HL135675-02 a T.J.L.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Benzonasi Nucleasi | Sigma-Aldrich | E1014 | |
| Bullet Blender Omogeneizzatore tissutale | Next Advance | 61-BB50-DX | |
| digitonin | Sigma | D141 | |
| rotatore end-over-end | ThermoFisher | ||
| Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) | Sigma | E9884 | |
| glicole etilenico-bis(β-amminoetil etere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA) | Sigma | E3889 | |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | |
| HEPES | VWR | 97064-360 | |
| Glicole esilenico | Sigma | 68340 | |
| Igepal | Sigma | I7771 | Detergente non ionico e non denaturante |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Mannitolo | Sigma | M9647 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| NaCl Sigma | S9888 | ||
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | |
| Provette Polyclear open-top, 16 x 52 mm | Seton Scientific | 7048 | |
| OptiPrep (Iodixanol) Gradiente di densità Medio | Sigma | D1556-250ML | |
| fenilmetansulfonilfluoruro (PMSF) | Sigma | P7626 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi, centrifuga | VWR | M221-1ML | |
| ThermoFisher | |||
| S50-ST Rotore a secchiello oscillante | Eppendorf | ||
| Dodecil solfato di sodio (SDS) | Sigma | 436143 | |
| Desossicolato di sodio | Sigma | D6750 | |
| ortovanadato di sodio (SOV) | Sonicatore Sigma | 567540 | |
| ThermoFisher | |||
| Sorvall MX120 Plus Micro-Ultracentrifuga | ThermoFisher | ||
| Perline in acciaio inossidabile 3,2 mm | Next Advance | SSB32 | |
| Saccarosio | Sigma | S0389 | |
| Soluzione salina tamponata con tris (TBS) | VWR | 97062-370 | |
| Tween 20 | detergente non ionico in tamponi western blotting | ||
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 |
Riferimenti
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, 440-445 (2015).
- Il Hwang, S., Han, D. K.
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification
Posted by JoVE Editors on 5/31/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Cell Fractionation of U937 Cells by Isopycnic Density Gradient Purification. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
William McCaig1
Timothy LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
to:
William D. McCaig1
Matthew A. Deragon1
Phillip V. Truong1
Angeleigh R. Knapp1
Keven J. Hughes1
Timothy J. LaRocca1
1Department of Basic and Clinical Sciences, Albany College of Pharmacy and Health Sciences
