Articolo metodologico

Iniezione intraspinale di cellule staminali mesenchimali umane e monitoraggio della loro migrazione nel cervello di ratto

DOI:

10.3791/62120

⸱

3 febbraio 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell & Regenerative Medicine Institute, Samsung Medical Center, 2Stem Cell Institute, ENCell Co. Ltd, 3Department of Neurosurgery, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, 4Animal Research and Molecular Imaging Center, Samsung Biomedical Research Institute, Samsung Medical Center, 5Department of Neurology, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine, 6Neuroscience Center, Samsung Medical Center, 7Samsung Alzheimer Research Center, Samsung Medical Center

In questo articolo

Sommario

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Diverse vie di somministrazione possono essere utilizzate per fornire cellule staminali mesenchimali (MSC) al cervello. Nel presente studio, le MSC sono state consegnate in tutta la neuroassi e nel cervello tramite iniezione intra-spinale. Le MSC sono state iniettate nelle cavità spinali dei ratti e la migrazione delle cellule staminali è stata monitorata e quantificata.

Abstract

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Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state studiate per il trattamento di varie malattie. Nelle malattie neurodegenerative che comportano difetti sia nel cervello che nel midollo spinale, la via di somministrazione è molto importante, perché le MSC devono migrare sia nel cervello che nel midollo spinale. Questo articolo descrive un metodo per la somministrazione di MSC nel canale spinale (iniezione intraspinale) che può colpire il cervello e il midollo spinale in un modello di ratto. Un milione di MSC sono state iniettate nei canali spinali dei ratti a livello delle vertebre lombari 2-3. Dopo la somministrazione, i ratti sono stati soppressi a 0, 6 e 12 ore dopo l'iniezione. L'imaging ottico e la reazione quantitativa a catena della polimerasi in tempo reale (qPCR) sono stati utilizzati per tracciare le MSC iniettate. I risultati del presente studio hanno dimostrato che le MSC somministrate attraverso la cavità spinale potrebbero essere rilevate successivamente sia nel cervello che nel midollo spinale a 12 ore. L'iniezione nella cavità intraspinale ha il vantaggio di non richiedere l'anestesia generale e ha pochi effetti collaterali. Tuttavia, lo svantaggio del basso tasso di migrazione delle MSC al cervello deve essere superato.

Introduzione

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Cellule staminali mesenchimali
In condizioni di malattia, le MSC secernono sostanze terapeutiche specifiche per la malattia attraverso azioni paracrine1 che sono state segnalate per regolare le risposte immunitarie, ripristinare i tessuti danneggiati e rimuovere le sostanze tossiche2. Pertanto, la terapia con MSC è considerata più efficace della terapia a bersaglio singolo nel trattamento di malattie multifattoriali come il morbo di Alzheimer e la sarcopenia 3,4,5,6. Inoltre, a differenza dei prodotti farmaceutici, le MSC hanno un effetto homing, spostandosi nella regione del tessuto danneggiato riconoscendo le citochine o le chemochine infiammatorie nel corpo 7,8. Sfortunatamente, solo un sottogruppo di cellule raggiunge l'area danneggiata e la vitalità delle MSC diminuisce durante la migrazione 9,10,11,12. Pertanto, per massimizzare l'efficacia terapeutica delle MSC, è necessario fornire cellule vitali al sito bersaglio. Pertanto, quando si somministrano MSC, è importante scegliere la via di somministrazione corretta, in base alla natura della malattia bersaglio.

Via di iniezione
Esistono numerose vie attraverso le quali gli agenti terapeutici vengono somministrati ai pazienti. I metodi più comuni sono l'iniezione endovenosa nella circolazione sistemica, la somministrazione orale e l'iniezione sottocutanea o intramuscolare. Nelle malattie neurodegenerative, l'ostacolo principale nella somministrazione di agenti terapeutici al cervello è la barriera emato-encefalica (BBB). La BBB protegge il cervello dagli agenti patogeni esterni per mezzo di giunzioni strette tra i vasi sanguigni e il parenchima cerebrale13,14. Tuttavia, la BBB impedisce paradossalmente anche agli agenti terapeutici di entrare nel parenchima cerebrale. Pertanto, il passaggio attraverso la BBB è l'ostacolo principale nello sviluppo di terapie per le malattie cerebrali 15,16. L'iniezione intracerebrale viene eseguita per superare questo inconveniente iniettando sostanze bersaglio direttamente nel cervello attraverso un'operazione chirurgica 17,18,19. Tuttavia, gli effetti collaterali degli interventi chirurgici dovrebbero essere considerati, soprattutto perché l'ago danneggia le cellule neuronali durante la procedura.

Somministrazione della cavità intraspinale
La somministrazione intratecale, la somministrazione di farmaci nel canale spinale o nello spazio subaracnoideo, eroga farmaci al cervello o alla neuroassi attraverso il liquido cerebrospinale (CSF) ed è una valida alternativa all'iniezione intracerebrale. Le iniezioni intratecali possono essere suddivise in base al sito di iniezione: ventricolo laterale, cisterna magna e cavità spinale. Tutte e tre le vie consentono ai farmaci o alle cellule di disperdersi in tutto il liquido cerebrospinale nel cervello e nel midollo spinale. La somministrazione del farmaco al cervello può essere più efficiente nel caso di iniezioni intracerebroventricolari e intra-cisterna magna perché l'agente viene iniettato vicino al cervello. Tuttavia, l'iniezione nella cavità intraspinale ha il vantaggio di non richiedere l'anestesia generale o la chirurgia per l'inserimento di un serbatoio intraventricolare, essendo generalmente sicura20, e può essere eseguita ripetutamente se necessario.

Lo scopo di questo studio era quello di convalidare la somministrazione della cavità intraspinale come mezzo per fornire MSC sia al cervello che al midollo spinale. In primo luogo, la cavità intraspinale è stata stabilita in un modello di ratto. Successivamente, le MSC sono state marcate con un tracciante lipofilo, DiD (DiIC18(5); 1,1-diottadil-3,3,3,3-tetrametilindodicarbocianina, sale 4-clorobenzensolfonato), per valutare l'efficienza della migrazione delle cellule staminali verso il midollo spinale e il cervello. L'imaging ottico ex vivo è stato eseguito per valutare la dispersione cellulare. Questo semplice protocollo può essere eseguito senza intervento chirurgico e può essere utilizzato non solo per la somministrazione di cellule staminali, ma anche di prodotti farmaceutici, anticorpi, mezzi di contrasto e altre sostanze destinate ad essere somministrate al midollo spinale o al cervello.

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Protocollo

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NOTA: Questo studio è stato approvato dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (Numero di approvazione: 20170125001, Data: 25 gennaio 2017) del Samsung Biomedical Research Institute (SBRI) presso il Samsung Medical Center. In qualità di struttura accreditata dell'Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International, l'SBRI agisce in conformità con le linee guida stabilite dall'Institute of Laboratory Animal Resources.

1. Preparazione di MSC umane derivate dalla gelatina di Wharton

  1. Coltivazione di cellule staminali mesenchimali umane derivate dalla gelatina di Wharton (WJ-MSC)
    1. Scongelare rapidamente una fiala di WJ-MSC umane in un bagno d'acqua a 37 °C. Trasferire le WJ-MSC in una provetta conica da 50 mL e aggiungere terreno di crescita a un volume almeno 10 volte superiore a quello delle cellule (v/v). Pipet su e giù per sospendere le celle.
    2. Centrifugare a 300 × g per 5 min. Scartare con cura il surnatante e risospendere le cellule.
      NOTA: Fare attenzione a non scartare il pellet della cella.
    3. Semina di WJ-MSC in fiasche T175 ad una densità di 5.000-6.000 cellule/cm2. Incubare le WJ-MSC in un incubatore a 37 °C di CO2 . Cambiare il terreno di coltura ogni 72 ore fino a quando le WJ-MSC raggiungono l'80-90% di confluenza.
      NOTA: Generalmente, ci vogliono 3-4 giorni perché le MSC raggiungano l'80-90% di confluenza.
  2. Subcoltivazione di WJ-MSC umane
    1. Scartare il terreno di coltura e lavare le cellule con 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Rimuovere il PBS e aggiungere 5 mL di acido etilendiamminetraacetico (EDTA) 0,25% tripsin-disodio (EDTA) (vedere la Tabella dei materiali). Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore di CO2 per 3 minuti fino a quando le WJ-MSC non si staccano dal pallone di coltura.
    2. Aggiungere 5 ml di terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino per neutralizzare lo 0,25% di tripsina-EDTA. Raccogliere la miscela di cellule e trasferirla in una provetta conica da 50 mL. Lavare il pallone di coltura cellulare con 10 mL di terreno di crescita e raccogliere le cellule in una provetta da 50 mL utilizzando una pipetta sierologica sterile.
    3. Centrifugare la miscela cellulare a 300 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante, risospendere le cellule in 10 mL di terreno di coltura e contare il numero di WJ-MSC.
      ATTENZIONE: Fare attenzione a non scartare il pellet della cella.
    4. Seminare WJ-MSC a una densità di 4.000-6.000 cellule/cm2, a seconda dell'esperimento.
  3. Marcatura di WJ-MSC con colorante DiD e preparazione di WJ-MSC per l'iniezione nella cavità intraspinale
    NOTA: La procedura di etichettatura del colorante DiD è stata eseguita seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Staccare le WJ-MSC quando raggiungono l'80% di confluenza, utilizzando la procedura sopra menzionata. Sospendere le WJ-MSC a una densità di 1 × 106/mL in α di terreno essenziale minimo (MEM) privo di rosso fenolo senza siero.
    2. Aggiungere 5 μL di soluzione di marcatura DiD per 1 mL di sospensione cellulare; Miscelare delicatamente con il pipettaggio.
    3. Incubare per 15 min a 37 °C; Centrifugare la sospensione cellulare a 300 × g per 5 min.
    4. Rimuovere il surnatante e risospendere le WJ-MSC in α MEM prive di rosso fenolo a una densità di 1 × 106/0,2 mL.

2. Iniezione intraspinale di WJ-MSC

  1. Preparazione per l'iniezione nella cavità intraspinale
    1. Anestetizzare ratti Sprague-Dawley di 6 settimane con isoflurano al 5%; Quindi, mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% durante la procedura chirurgica.
      NOTA: Ottimizzare le condizioni anestesiologiche prima di iniziare l'esperimento.
    2. Radere l'area chirurgica utilizzando un rasoio elettrico per piccoli animali.
      NOTA: Il rasoio elettrico può essere sostituito con un rasoio manuale e un gel da barba.
    3. Disinfettare l'area chirurgica con iodio povidone. Creare un'incisione di 3 cm nella pelle con una lama chirurgica. Resecare la pelle e il tessuto muscolare rimanenti utilizzando una lama chirurgica e delle forbici. Rivela i processi spinosi a livello lombare 2-3 (L2-3).
  2. Iniezione di WJ-MSC marcate con DiD attraverso la cavità intraspinale
    1. Metti il ratto in posizione prona. Fletti la colonna vertebrale del ratto in modo appropriato per allargare la distanza tra i processi spinosi adiacenti, utilizzando quantità sufficienti di carta o altri materiali che possono aiutare a mantenere la posizione appropriata.
    2. Riempire una siringa da 1 ml con 0,2 ml di WJ-MSC marcate con DiD. Posizionare una combinazione siringa-ago da 23 G verticalmente tra i processi spinosi di L2 e L3 e inserire l'ago fino a toccare il corpo vertebrale.
    3. Quando l'ago tocca il corpo vertebrale, ritrarlo di circa 0,5 cm, posizionando la punta dell'ago nel canale spinale. Inclinare la siringa e posizionare la punta dell'ago in modo che punti verso la direzione rostrale. Iniettare WJ-MSC nella cavità spinale per un periodo di 1 minuto.
      NOTA: La velocità di iniezione deve essere ottimizzata in anticipo.
    4. Dopo l'iniezione, rimuovere completamente la siringa dal canale spinale. Suturare l'incisione, quindi disinfettare il sito chirurgico utilizzando iodio povidone.
  3. Trattamento post-procedura
    1. Stabilizzare e trattenere il ratto per impedirne qualsiasi movimento, posizionandolo a testa in giù con un angolo di 45° per 15 minuti, mentre è ancora sotto anestesia. Dopo 15 minuti, interrompere l'anestesia e attendere che il topo si svegli.

3. Valutazione dell'iniezione nella cavità intraspinale

  1. Eutanasia dei ratti e isolamento del cervello e del midollo spinale a 0, 6 e 12 ore dopo l'iniezione
    1. Anestetizzare gli animali da esperimento con isoflurano al 5%; mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% durante la perfusione PBS.
    2. Praticare un'incisione sotto il diaframma usando le forbici chirurgiche. Apri l'incisione con una pinza e taglia la gabbia toracica rostralmente per esporre il cuore.
    3. Fai un piccolo foro nell'atrio destro e inserisci un ago a farfalla nel ventricolo sinistro. Perfondere 100 ml di PBS freddo nel ventricolo sinistro per 4-5 minuti, fino a quando il fegato non viene ripulito dal sangue.
    4. Dopo la perfusione, praticare una lunga incisione sul retro dalla testa alla coda utilizzando una lama chirurgica lungo il piano longitudinale. Isolare il cervello rimanente e l'intera colonna vertebrale usando forbici chirurgiche, pinze e un tagliaossa. Rimuovi le costole rimanenti, le ossa collegate e la carne.
  2. Imaging ottico fluorescente DiD ex vivo
    1. Posizionare i tessuti isolati nella camera del dispositivo di imaging ottico.
    2. Impostare i parametri come segue: emissione, 700 nm; eccitazione, 605 nm; e tempo di esposizione, 2 secondi, come fotoni al secondo per centimetro quadrato per steradiante (p/s/cm2/sr). Cattura le immagini ottiche.
      NOTA: Tutte le immagini devono essere acquisite con le stesse impostazioni di illuminazione (tensione della lampada, filtri, f/stop, campo visivo e binning).
    3. Disegna tre regioni rettangolari di interesse (ROI) di dimensioni equivalenti per il midollo spinale e una ROI circolare per il cervello utilizzando lo strumento di disegno. Misurare le intensità fluorescenti dei ROI.
  3. Estrazione di DNA genomico (gDNA) dal midollo spinale e dal tessuto cerebrale
    1. Rimuovere con cura il cranio e la colonna vertebrale utilizzando una pinza chirurgica, forbici e un rongeur.
    2. Raccogli il cervello e il midollo spinale dal cranio e dalla colonna vertebrale. Taglia il midollo spinale in tre pezzi (cervicale, toracico e lombare).
      NOTA: I tessuti prelevati devono essere conservati a -80 °C se non vengono analizzati immediatamente.
    3. Macinare i tessuti utilizzando un mortaio pre-raffreddato, un pestello e azoto liquido. Estrarre il gDNA utilizzando prodotti commerciali, seguendo le istruzioni del produttore.
  4. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qPCR)
    1. Quantificare la quantità di gDNA in ciascun campione utilizzando uno spettrofotometro.
    2. Eseguire la qPCR utilizzando 10 ng di gDNA per campione e primer umani di Arthrobacter luteus (ALU) 12,21.
    3. Calcolare il numero esatto di WJ-MSC nei campioni utilizzando il metodo ΔΔCT 22.

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Risultati

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Per valutare l'efficacia dell'iniezione intraspinale di MSC, nel presente studio sono state utilizzate MSC marcate con DiD. Prima di iniettare le MSC nella cavità spinale, l'efficacia della marcatura è stata valutata in vitro utilizzando l'imaging ottico e la microscopia a fluorescenza (Figura 1). Dopo aver colorato le MSC con il reagente di marcatura DiD utilizzando la procedura descritta nella sezione 3.1 del protocollo, sono state scattate immagini ottiche delle piastre di coltura su cui ...

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Discussione

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La via di somministrazione ottimale per il trattamento con le MSC deve essere scelta in base alla malattia bersaglio, alle condizioni del paziente e al tipo di farmaco da somministrare. Nelle terapie cellulari, compresa la terapia con MSC, deve essere presa in considerazione l'iniezione diretta di cellule staminali nel cervello o per via intratecale attraverso il liquido cerebrospinale, poiché le cellule non possono passare attraverso la BBB19. L'iniezione nella c...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato da sovvenzioni del Programma di ricerca di base attraverso la National Research Foundation of South Korea (NRF), finanziato dal Ministero dell'Istruzione (NRF-2017R1D1A1B03035940), e da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numeri di sovvenzione: HI14C3484 e HI18C0560). Ringraziamo Editage (www.editage.co.kr) per l'editing in lingua inglese.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25% Tripsina-EDTAGibco-invitrogeno25200114Coltura cellulare Siero
fetale bovinobiowestS1520Integratore di terreno
di coltura gentamicinaGibco-invitrogen15710-072Integratore di terreno di coltura
Gentra Puregene Kit di tessutiQIAGEN158689isolamento del gDNA
MEM, senza glutammina, senza rossofenoloGibco51200038Formulazione WJ-MSC per iniezione
Mezzo essenziale minimo alfaGibco-invitrogeno12571063Terreno di coltura WJ-MSC
Potenza SYBR Green PCR Master MixApplied Biosystems4368577reagente PCR quantitativo in tempo
reale QuantStudio 6 Flex Sistema PCR in tempo realeThermo fisher4485694PCR quantitativa in tempo reale
tripano bluGibco15250061Injection
Vybrant DiD Soluzione di marcatura cellulareinvitrogenV22887Soluzione di marcatura delle cellule staminali
Xenogen IVIS Sistema di spettroPerkin Elmer124262Dispositivo di imaging ottico

Riferimenti

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