Qui, presentiamo un protocollo per stabilire un nuovo modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV), che è fondamentale per migliorare la nostra comprensione dei serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello e offrire un sistema per studiare i disturbi neurocognitivi associati all'HIV e le comorbilità associate (cioè l'abuso di droghe).
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Articolo metodologico
Un modello di ratto di infezione cerebrale EcoHIV
In questo articolo
Sommario
Abstract
È stato ben studiato che il modello di topo infetto EcoHIV è di notevole utilità nello studio delle complicanze neurologiche associate all'HIV. L'istituzione del modello di ratto infetto EcoHIV per studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi sarebbe utile nello studio dei disturbi neurocognitivi associati al neuroHIV e all'HIV-1 (HAND). Nel presente studio, dimostriamo la creazione di successo di un modello di ratto di infezione attiva da HIV utilizzando l'HIV chimerico (EcoHIV). In primo luogo, il costrutto lentivirale di EcoHIV è stato confezionato in celle colturate da 293 FT per 48 ore. Quindi, il mezzo condizionale è stato concentrato e piastrellato. Successivamente, abbiamo eseguito iniezioni stereotassiche bilaterali dell'EcoHIV-EGFP nel tessuto cerebrale del ratto F344/ N. Una settimana dopo l'infezione, sono stati rilevati segnali di fluorescenza EGFP nel tessuto cerebrale infetto, indicando che EcoHIV induce con successo un'infezione attiva da HIV nei ratti. Inoltre, è stata eseguita l'immunostaining per il marcatore cellulare microgliale, Iba1. I risultati indicavano che le microglia erano il tipo di cellula predominante che ospitava EcoHIV. Inoltre, i ratti EcoHIV hanno mostrato alterazioni nell'elaborazione temporale, un potenziale meccanismo neurocomportamentale sottostante della MANO e disfunzione sinaptica otto settimane dopo l'infezione. Collettivamente, il presente studio estende il modello EcoHIV dell'infezione da HIV-1 al ratto offrendo un prezioso sistema biologico per studiare i serbatoi virali dell'HIV-1 nel cervello, nonché la MANO e le comorbilità associate come l'abuso di droghe.
Introduzione
I sistemi biologici hanno migliorato la nostra comprensione dei disturbi neurocognitivi associati all'HIV-1 (HAND) e dei loro meccanismi neurali sottostanti2. La determinazione del sistema biologico più appropriato per un dato studio dipende spesso dalla questione dell'interesse2. La limitazione della gamma di modelli animali ospiti sfida gli studi sullo sviluppo della malattia dell'HIV-1. Per indagare la replicazione virale e la patogenesi dell'HIV-1, Potash etal. Dopo iniezioni di vene della coda nei topi dell'HIV chimerico (EcoHIV), sono state osservate molte caratteristiche simili a quelle degli individui sieropositivi HIV-1 (ad esempio linfociti infetti e macrofagi, mirati per risposte immunitarie antivirali einfiammazione 3,5,6).
Sebbene topi e ratti siano entrambi membri dei Muridae, le differenze fondamentali delle specie possono influenzare la loro idoneità per specifiche domande sperimentali7. Pertanto, l'estensione del modello di infezione EcoHIV ai ratti (comunemente usato negli studi sull'abuso di droghe e sui disturbi neurocognitivi) sarebbe vantaggiosa nello studio del neuroHIV. Ad esempio, le loro dimensioni maggiori rendono più pratico l'impianto giugulare del catetere per le procedure di auto-somministrazionedei farmaci 8. Le tecniche di auto-somministrazione dei farmaci nei ratti sono state utilizzate per valutare la motivazione nell'HIV-19. Inoltre, molti compiti neurocognitivi / comportamentali sono stati inizialmente progettati per i ratti10. Qui, segnalamo l'utilizzo di iniezioni stereotassiche di EcoHIV nei ratti per estendere il modello di infezione EcoHIV e offrire un'opportunità chiave per affrontare nuove domande relative al neuroHIV e alla MANO.
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Protocollo
Tutti i protocolli sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali presso l'Università della Carolina del Sud (numero di garanzia federale: D16-00028). Sei ratti adulti F344/N maschi sono stati alloggiati in un ambiente controllato sotto una luce 12/12: ciclo scuro con accesso ad libitum a cibo e acqua. Tutti gli animali sono stati curati utilizzando le linee guida stabilite dagli Istituti Nazionali di Sanità nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Confezionamento di virus in 293 cellule FT
- Coltura delle 293 celle FT (5×105/mL) in gelatina rivestita 75 cm2 fiasche con DMEM più 10% FBS11. Far crescere le cellule a 37 °C per essere confluenti al 50% alla trasfezione.
- Diluire 22,5 μL di reagente di trasfezione (ad esempio Lipofectamina 3000) in 750 μL di mezzo (ad esempio Opti-MEM) in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml e vortice per 3 s.
- Diluire 20 μg di DNA plasmide EcoHIV in 750 μL di mezzo in un tubo di micro-centrifuga da 1,5 ml e mescolare bene.
- Aggiungere il DNA diluito nel tubo del reagente di trasfezione diluito e mescolare delicatamente. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere la miscela a 10 ml di mezzo DMEM prebellico in pallone da 75 cm2. Incubare le cellule per 2 giorni a 37 °C.
- Raccogliere e combinare 24 mL di mezzo condizionale dai due contenitori che includono il lentivirus confezionato.
- Centrifuga tutti i 24 mL di mezzo condizionale a 500 x g per 10 minuti a 4 °C. Trasferire il supernatante chiarificato in un tubo sterile da 50 ml.
- Unire 8 mL di concentratore Lenti-x con 24 mL di supernatante chiarificato (rapporto 1:3). Mescolare con un'inversione delicata. Incubare la miscela a 4 °C per due giorni.
- Miscela di centrifuga a 1.500 x g per 45 minuti a 4 °C. Rimuovere con cura il supernatante.
- Sospendere delicatamente il pellet con 100 μL di PBS da 100 mM.
- Concentrazione di virus titer con un kit ELISA p24.
2. Interventi stereotassici del virus EcoHIV-EGFP
- Anestetizzare i ratti usando il 3% di sevoflurane. Procedere al passaggio 2.2 quando i ratti non rispondono a stimoli e riflessi noxious sono assenti.
- Radere i peli dalla regione cerebrale e sterilizzare la pelle due volte con il 70% di etanolo e uno scrub a base di clorexidina. Fissare il ratto in una posizione soggetta all'apparato stereotassico.
- Fare un'incisione (5-6 cm) attraverso la pelle lungo la linea mediana del cuoio capelluto.
- Contrassegnare due posizioni di foratura a 0,8 mm lateralmente, 1,2 mm da rostrale a bregma. Praticare un foro (diametro 0,4 mm) in ogni posizione del cranio.
- Riempire la soluzione di lentivirus EcoHIV titered (1,04 × 106 TU/mL) in una siringa per iniezione da 10 μL. Fissare la siringa all'apparato stereotassico.
- Spostare verso il basso l'ago vicino alla superficie del foro di perforazione. Misurare e spostare 2,5 mm di profondità.
- Infondere 1 μL di soluzione virale ad una velocità di 0,2 μL/min. Tenere l'ago all'interno dell'area di iniezione per 5 minuti. Spostare lentamente l'ago verso l'alto fino a quando non è al di fuori del cranio del topo.
- Sutura la pelle con un filo di seta 4-0.
- Sterilizzare l'incisione con il 70% di etanolo una volta. Iniettare per via sottocutanea butorfenolo (Dorolex, 0,1 mg/kg di peso corporeo).
- Trasferire il topo in una camera di recupero con una pastiglia riscaldante fino a quando non si sveglia.
3. Visualizzazione delle sezioni cerebrali
NOTA: Attendere da una a otto settimane dopo l'infusione virale ecoHIV.
- Anestetizzare il topo con il 5% di sevoflurane. Continuare al passaggio 3.2 quando i ratti non rispondono a stimoli e riflessi noxious sono assenti.
- Fissare il topo in posizione supina all'interno di una cappa aspirante.
- Incidere la pelle lungo la linea mediana toracica. Tagliare il diaframma e aprire la cavità toracica.
- Inserire un ago da 20 G × da 25 mm nel ventricolo sinistro.
- Aprire immediatamente l'atrio destro con le forbici.
- Perfondere 50 mL di PBS prechilled da 100 mM ad una velocità di 5 mL/min.
- Perfondere 100 mL di paraformaldeide fredda al 4% ad una velocità di 5 mL/min.
- Decapitare il topo, aprire il cuoio capelluto e rimuovere il cervello.
- Postfisso durante la notte con paraformaldeide al 4%.
- Trasferire il cervello a 40 ml di saccarosio al 30% in PBS da 100 mM in tubo da 50 ml fino a quando il cervello galleggia verso il basso (circa 3 giorni).
- Snap congelare il cervello nel metilbutanolo per 2 minuti a - 80 °C.
- Fissare il tessuto cerebrale su una piattaforma metallica all'interno di un criostato a -20 °C.
- Tagliare sezioni coronali spesse 50 μm usando il criostato.
- Trasferire le fette cerebrali su vetrini con un pennello fine.
- Sezioni di montaggio in 0,3 mL di mezzo antifadio e coperchio con copripasci da 22 mm e 50 mm.
- Tenere gli scivoli di vetro al buio a temperatura ambiente fino ad asciugare.
- Immagini i neuroni mirati con un microscopio confocale usando z-stack basato sui confini della regione cerebrale e sulle caratteristiche morfologiche dei neuroni.
NOTA: Le impostazioni del microscopio confocale utilizzate erano: ingrandimento di 60 X (A/1.4, olio) e un intervallo piano Z di 0,15 μm (dimensione del foro stenopeico 30 μm; raggio del foro stenopeico retroprodato di 167 nm) utilizzando una lunghezza d'onda di 488 nm.
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Risultati
Il mezzo condizionato è stato raccolto dal lentivirus delle cellule 293FT infettate da EcoHIV-EGFP. Successivamente, è stato concentrato e titerato, quindi iniettato stereotassicamente nel cervello (regione corticale) dei ratti F344 / N. Sette giorni dopo l'iniezione, i ratti sono stati sacrificati e le immagini sono state prese da fette cerebrali coronali che vanno dal bregma 5,64 mm al bregma -4,68 mm. Nella figura 1A, ci sono significativi segnali EcoHIV-EGFP in tutto il cervello, special...
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Discussione
In questo protocollo, abbiamo stabilito un modello di infezione da HIV indotto da EcoHIV nei ratti. In particolare, abbiamo descritto un'iniezione stereotassica bilaterale di EcoHIV nella corteccia che ha indotto con successo l'infezione attiva da HIV nel cervello del ratto 7 giorni dopo l'iniezione. Inoltre, dimostriamo che l'infezione da EcoHIV nei ratti potrebbe essere un buon sistema biologico per studiare gli aspetti chiave della MANO. Otto settimane dopo l'infezione da EcoHIV, i ratti hanno mostrato significativi d...
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Dichiarazioni
Nessuno degli autori ha conflitti di interesse da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH HD043680, MH106392, DA013137 e NS100624.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Celle 293FT | ThermoFisher Scientific | R70007 | |
| Soluzione antibiotico-antimicotica | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Corning BioCoatGelatin 75cm² Pallone rettangolare per colture cellulari con collo inclinato con tappo ventilato | Life Technologies | 354488 | |
| Corning DMEM con L-glutammina, 4,5 g/L di glucosio e piruvato di sodio | Life Technologies | 10013CV | |
| Vetro di copertura | VWR | 637-137 | |
| trapano | |||
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| Dumont #7 Pinze | World Precision Instruments | 14097 | |
| Eppendorf Microcentrifuga con tappo a scatto Biopur Provette con blocco sicuro | Life Technologies | 22600028 | |
| Ethicon Vicryl Plus Antibatterico, 4-0 Polyglactin 910 Sutura, 27 pollici. FS-2 | Med Vet International | VCP422H | |
| siringa Hamilton | Hamilton | 1701 | |
| Invitrogen Lipofectamine 3000 Reagente di trasfezione | Life Technologies | L3000015 | |
| Pinze per iride | World Precision Instruments | 15914 | |
| Forbici per iride | World Precision Instruments | 500216 | |
| Kit ELISA p24 associato a lentivirus | Cell Biolabs, inc. | VPK-107-5 | |
| Concentratore Lenti-X | Takara | PT4421-2 | |
| Opti-MEM I Siero ridotto Medium | Life Technologies | 11058021 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 158127-500G | |
| Paraformaldeide | Sigma | P6148 | |
| ProLong Gold | Fisher Scientific | P36930 | |
| Sevoflurano | Merritt Veterinary Supply | 347075 | |
| apparecchio stereotassico | Kopf Instruments | Modello 900 | |
| SuperFrost Plus Slides | Fisher Scientific | 12-550-154% | |
| Vannas Forbici | World Precision Instruments | 500086 |
Riferimenti
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