Imaging dell'intestino con "CHIAREZZA"

Sommario

Descriviamo il protocollo per la colorazione passiva CLARITY (PACT) dell'intestino di topo per consentire la visualizzazione dei tessuti subepiteliali, inclusi neuroni, glia e cellule enteroendocrine (EEC) senza sezionamento tissutale. Il protocollo prevede l'inclusione di idrogel di tessuto fissato con formaldeide e la successiva delipidazione utilizzando un detergente anionico per "pulire" il tessuto.

Abstract

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) si è recentemente evoluto come una preziosa tecnica che coinvolge l'inclusione di acrilammide per delipidare il tessuto (senza sezionamento) e per preservare la struttura tissutale 3D per l'immunocolorazione. La tecnica è molto rilevante nell'imaging dell'ambiente intestinale dinamico in cui diversi tipi di cellule interagiscono durante l'omeostasi e gli stati patologici. Questo metodo ottimizzato per l'intestino del topo è descritto qui, che aiuta a tracciare tipi di cellule come epiteli, enteroendocrini, neuroni, glia e le proiezioni neuronali negli epiteli o nelle cellule enteroendocrine che mediano rispettivamente il rilevamento microbico o il rilevamento della chemioterapia dei nutrienti. Il tessuto intestinale (1-1,5 cm) viene fissato in paraformaldeide al 4% (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 4 °C durante la notte del giorno 1. Il giorno 2, il PFA viene scartato e il tessuto viene lavato tre volte con PBS. Il tessuto è incorporato in idrogel per preservarne l'integrità mediante incubazione in una soluzione di idrogel al 4% (acrilammide) in PBS (diluito da ProtoGel al 30%) per una notte a 4 °C. Il giorno 3, la soluzione di idrogel tissutale viene incubata a 37 °C per 1 ora per consentire la polimerizzazione dell'idrogel. Il tessuto viene quindi lavato tre volte delicatamente con PBS per rimuovere l'idrogel in eccesso. La fase successiva della delipidazione (clearing) prevede l'incubazione tissutale in sodio dodecil solfato (8% SDS in PBS) a 37 °C per 2 giorni (giorni 4 e 5) su un agitatore a temperatura ambiente (RT). Il giorno 6, il tessuto pulito viene accuratamente lavato con PBS per rimuovere la SDS. Il tessuto può essere immunocolorato mediante incubazione in anticorpi primari (diluito in siero d'asino normale allo 0,5% in PBS contenente lo 0,3% di Triton X-100), durante la notte a 4°C e successiva incubazione in appropriati anticorpi secondari Alexa Fluor per 1,5 ore a RT e colorazione nucleare con DAPI (1: 10000). Il tessuto viene trasferito su un vetrino pulito e montato utilizzando VectaShield per l'imaging confocale.

Introduzione

CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging compatible Tissue hYdrogel) si è recentemente evoluto come una preziosa tecnica che coinvolge l'inclusione di acrilammide (idrogel) e la delipidazione tissutale per preservare la struttura tissutale 3D per l'immunocolorazione (senza sezionamento)^1,2. Il tessuto incluso nell'idrogel è otticamente trasparente e permeabile alle macromolecole, con proteine e acidi nucleici che vengono preservati dopo la rimozione dei lipidi mediante detergente. CLARITY è stato riconosciuto come una delle dieci scoperte degne di nota nel 2013 da Science³. Sebbene sia stata sviluppata inizialmente per l'imaging di tessuti cerebrali ricchi di lipidi in cui i lipidi influenzano la diffusione della luce e la qualità dell'imaging, la tecnica è attualmente ampiamente utilizzata per l'imaging di altri tessuti come intestino, fegato, reni e cuore. La tecnica offre la possibilità di colorare e visualizzare un tessuto eliminando la necessità di sezionamento, che altrimenti potrebbe comportare una valutazione distorta delle interazioni cellula-cellula a causa della distribuzione irregolare dei tipi di cellule. La tecnica offre anche l'opportunità di eseguire z-stack confocali e ricreare un'immagine tridimensionale del tessuto, che può aiutare a determinare le densità, la microarchitettura e l'interazione cellula-cellula tra i vari tipi di cellule in modo più realistico rispetto a una sezione di tessuto. Inoltre, la tecnica è stata modificata per consentire l'immunocolorazione di tessuti densi come l'osso, nonché studi di ibridazione in situ. Il tessuto 3D incorporato in idrogel offre una piattaforma attraente per chiarire le interazioni tra cellule epiteliali, enteroendocrine, gliali e neuronali, che sono state recentemente citate come cruciali per la comprensione della fisiopatologia di malattie come il morbo di Parkinson, l'Alzheimer, i disturbi dello spettro autistico ecc.⁴.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal Comitato per l'uso e la cura degli animali della Emory University. Ai topi C57BL/6 (possono essere utilizzati sia maschi che femmine) di età compresa tra 8 e 12 settimane è stato consentito il libero accesso al cibo e all'acqua prima dell'eutanasia.

1. Rimozione dell'intestino (Giorno 1)

1. Eutanasia del topo con il metodo dell'asfissia da anidride carbonica, a una portata di 1,6 ml di gas di anidride carbonica fino a quando non si osserva la cessazione della respirazione per 2 minuti).
2. Posiziona il topo supino su una tavola da dissezione con gli arti appuntati. Sterilizzare l'addome con etanolo al 70%. Usando una pinza, taglia la pelle con le forbici.
3. Solleva delicatamente il fegato e identifica lo stomaco. Quindi, tenendo lo stomaco con una pinza, tagliare l'esofago appena sopra lo stomaco. Tenendo lo stomaco con una pinza, taglia delicatamente i mesenteri e stacca l'intestino dalla cavità addominale fino al retto. Tagliare l'intestino staccato al retto.
4. Trasferire l'intestino staccato in una soluzione di PBS ghiacciata in una capsula di Petri. Ora tagliate delicatamente il mesentere tra i segmenti ileali e raddrizzate l'intestino in modo che partendo dallo stomaco tutti i mesenteri vengano tagliati, fino al colon.
5. Tagliare 1-1,5 cm della regione intestinale desiderata per la colorazione CLARITY in una nuova capsula di Petri contenente PBS ghiacciato.
6. Utilizzando una siringa da 5 ml attaccata a un'estremità smussata di un ago da 20 G, sciacquare il contenuto fecale con PBS ghiacciato.
   NOTA: Qualsiasi regione dell'intestino può essere utilizzata per la colorazione CLARITY utilizzando la stessa tecnica. Il segmento intestinale può essere tagliato lungo il mesentere o utilizzato intatto per le fasi successive.

2. Fissazione del tessuto intestinale (Giorno 1)

1. Fissare il tessuto in una soluzione di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS.
2. Trasferire un pezzo di 1-1,5 cm di segmento intestinale di interesse in una provetta conica da 15 ml riempita con PFA al 4% a 4 °C durante la notte per la fissazione.

3. Inclusione di idrogel (giorno 2)

1. Trasferire il segmento intestinale da una soluzione di PFA al 4% con una pinza in una nuova provetta conica da 15 mL con soluzione di PBS e lavare tre volte (5 min ciascuna, su uno shaker a 150-200 giri/min) per rimuovere eventuali residui di PFA.
2. Preparazione di idrogel al 4%
   1. Utilizzare la soluzione di gel al 30% (ProtoGel) per preparare l'idrogel. Per preparare una soluzione di idrogel al 4%, diluire la soluzione madre al 30% e diluirla in PBS. Per preparare 12 ml di idrogel al 4%, prendere 1,6 ml di soluzione di gel al 30% e aggiungere 10,4 ml di PBS.
3. Trasferire il tessuto fissato dal passaggio 3.1. alla soluzione di idrogel al 4% in PBS in una provetta conica da 15 ml e incubata a 4 °C per una notte.
   NOTA: Si raccomanda vivamente di lavare il tessuto senza PFA utilizzando PBS dopo l'incubazione notturna. Il tessuto conservato più a lungo in PFA non dà buoni risultati con i passaggi successivi e la colorazione. Il tessuto fissato dopo i lavaggi PBS può essere conservato a 4 °C per una settimana.

4. Fase di polimerizzazione e delipidazione (clearing) dell'idrogel (Giorno 3)

1. Estrarre il tubo conico contenente il tessuto in soluzione di idrogel a una temperatura di 4 °C. Trasferire a bagnomaria a 37 °C e incubare per 1 ora. Questa fase consente la polimerizzazione dell'idrogel.
2. Dopo 1 ora, estrarre il tubo conico contenente il tessuto incorporato nell'idrogel del bagnomaria e versare la soluzione di acrilammide. Ora risciacqua delicatamente il fazzoletto con un singolo lavaggio PBS a temperatura ambiente per rimuovere l'idrogel in eccesso.
3. Fase di delipidazione
   1. Delipidato incubando il tessuto in sodio dodecil solfato (8% SDS) in PBS. Trasferire il tessuto incluso nell'idrogel dalla fase 4.2 a una soluzione SDS all'8% in una provetta conica da 50 mL. Assicurarsi che il tessuto sia completamente immerso nella soluzione SDS e che il tubo sia tappato.
   2. Trasferire la provetta da 50 mL tappata contenente il tessuto in SDS su un agitatore a 37 °C (200 giri/min) a temperatura ambiente per 2 giorni (giorni 4 e 5) per consentire la delipidazione.
      NOTA: Assicurarsi che la soluzione SDS sia riempita fino ad almeno 20-25 mL nella provetta conica da 50 mL, per compensare l'eventuale evaporazione che potrebbe verificarsi a 37 °C durante i 2 giorni di incubazione.
4. Nei giorni 4 e 5, incubare il tessuto in SDS a 37 °C (200 giri/min) a temperatura ambiente.

5. Lavaggio del detersivo dal fazzoletto pulito (giorno 6)

1. Prelevare il fazzoletto dalla soluzione SDS. Il tessuto apparirà "chiaro" o trasparente.
2. Trasferire il fazzoletto in una nuova provetta comica da 50 mL con soluzione di PBS e lavare nel corso della giornata su uno shaker (150-200 giri/min) a temperatura ambiente con diversi cambi di PBS, per assicurarsi che tutte le tracce di SDS vengano rimosse. Almeno 10 cambi di soluzione PBS assicureranno che il tessuto sia libero dalla SDS e una buona regola pratica è controllare se il lavaggio finale del PBS non ha tracce di schiuma/schiuma dalla SDS. Questo è un passaggio critico in quanto la SDS può interferire con le successive fasi di colorazione.
   NOTA: Alla fine della giornata, il tessuto pulito dopo diversi lavaggi in PBS è ora pronto per l'immunocolorazione o forse conservato a 4 °C per un massimo di 3 settimane.
3. La conservazione dei tessuti intestinali puliti per più di un mese in una soluzione di PBS influirà sull'integrità dei tessuti e sulla qualità della colorazione. Utilizzare il tessuto intestinale pulito immediatamente o entro 1-2 settimane dalla pulizia per ottenere i migliori risultati.

6. Colorazione immunofluorescente per neuroni, glia e cellule enteroendocrine

1. Trasferire il tessuto pulito in una provetta da 1,5 o 2 mL e incubare in volume di 500 μL dei rispettivi anticorpi primari diluiti in siero d'asino normale allo 0,5% in PBS contenente Triton X-100 allo 0,3% per una notte a 4 °C. Gli anticorpi (Ab) utilizzati: Tuj1 o β-3-tubulina (marcatore neuronale Pan, 1:1000), proteina dell'acido fibrillare gliale (GFAP, 1:500), cromogranina A (1:250).
2. Dopo l'incubazione notturna, sottoporre il tessuto a 3 lavaggi PBS (5 minuti ciascuno utilizzando 1-1,5 ml di PBS) per rimuovere gli anticorpi primari non legati.
3. Trasferire il tessuto in una nuova provetta e successivamente incubare con 500 μl di Alexa Fluor Ab (AF) secondario appropriato per 1,5 ore a temperatura ambiente al buio. Gli Ab secondari utilizzati sono AF 488 per Tuj1 (1: 1000), AF-555 per GFAP (1: 500) e AF 555 (1: 250) per la cromogranina A.
4. Dopo l'incubazione, lavare il tessuto tre volte con PBS come al punto 6.2.
5. Per colorare i nuclei, incubare il tessuto in DAPI (1: 10000 diluizione o 0,2 μL in 2 mL di PBS) per 5 minuti a temperatura ambiente.
6. Infine, trasferire il tessuto colorato su un vetrino di vetro pulito, aggiungere il vetrino coprioggetti sulla parte superiore del tessuto e montare utilizzando 100 μl di VectaShield per l'imaging confocale.
7. Posizionare le diapositive al buio a temperatura ambiente in un supporto per vetrini per 30 minuti per l'asciugatura, dopodiché possono essere visualizzate o conservate a -20 °C. La parete del budello del topo è abbastanza sottile e una volta aperta lungo il mesentere, può essere montata su vetrini direttamente con vetrino. Se si lavora con tessuti più grandi come milza, reni, vetrini da camera (cavità) o distanziatori possono essere utilizzati. Per tessuti più grandi come, per il montaggio può essere utilizzato un vetrino per cavità.
   NOTA: Si noti che se il segmento intestinale non è stato tagliato al passaggio iniziale (fare riferimento alla Nota al punto 1), si consiglia di aprire il tubo intestinale con delle micro forbici che faciliteranno i passaggi di montaggio.

7. Imaging confocale

NOTA: Il tessuto pulito, colorato e montato può essere sottoposto a imaging immediatamente o può essere conservato in scatole di vetrini a -20°C.

1. Immagine con un microscopio confocale (ad esempio, Olympus FV1000).
2. Prendi gli z-stack su uno spessore di 50 μm del tessuto intestinale per visualizzare le regioni dal lume intestinale verso lo strato siesale.
3. Memorizza le immagini dello stack z come file immagine, file di film .avi o converti in immagini 3D con l'aiuto del software⁵.

Risultati

Le immagini del tessuto intestinale di topo ripulito da CLARITY sono rappresentate nella Figura 1. Il completamento con successo del protocollo produce immagini nitide e di alta qualità in cui tutti i dettagli cellulari possono essere visualizzati chiaramente. La colorazione DAPI per i nuclei è un ottimo indice per valutare la qualità del protocollo CLARITY e la successiva immunocolorazione in quanto può rappresentare l'integrità del tessuto. Inoltre, la forma cellulare fornisce anche un ind...

Discussione

Il metodo CLARITY è molto utile per colorare l'intestino del topo per visualizzare vari tipi di cellule, tra cui epiteli, neuroni e cellule gliali in 3D, in particolare la rete di proiezioni neuronali che si estendono attraverso la parete intestinale fino al lume⁵ e la loro innervazione alle cellule gliali e CEE. Il metodo qui presentato è stato modificato in base allo studio originale di Yang et al. 2014¹.

Le fa...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4% paraformaldeide (PFA)  in PBS	ThermoFischer Scientific	J19943	Utilizzato per la fissazione tissutale
4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato (DAPI)	ThermoFischer Scientific	D1306	1/10.000 diluizione
Alexa Fluor-488	ThermoFischer Scientific	A-11034	1/1000 diluizione
Alexa Fluor-555	ThermoFischer Scientific	A-21428	Diluizione 1/500
Anti-GFAP (Glial Fibrillary Acid Protein)	Abcam	ab7260	Diluizione 1/500
Anti-beta III Tubulina (o Tuj1)	Abcam	ab18207	1/1000 diluizione
Cromogranina A	Abcam	ab15160	Diluizione 1/250
ProtoGel  30%	National Diagnostics	EC-890	Tossico, pericoloso, maneggiare con cura- fare una soluzione al 4% in PBS per l'uso
Sodio dodecil solfato	ThermoFischer Scientific	28364	8% in PBS
Vectashield mezzo di montaggio	Vector Laboratories	H-1000