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Articolo metodologico

Indagine sui neuroni sensoriali olfattivi del topo attivati tramite immunocolorazione combinata e ibridazione in situ

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DOI:

10.3791/62150

⸱

11 aprile 2021

 ,  , 
1Department of Genetics, Evolution, Microbiology and Immunology, Institute of Biology, University of Campinas, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Campinas

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo combina l'ibridazione in situ con l'immunofluorescenza per identificare i geni del recettore olfattivo e vomeronasale espressi nei neuroni sensoriali olfattivi dopo l'attivazione da parte di stimoli chimici nel topo.

Abstract

Gli animali si affidano alla comunicazione chimica per trasmettere e percepire informazioni ambientali rilevanti, che vanno dalla valutazione della qualità del cibo al rilevamento di partner di accoppiamento disponibili o minacce. Nei topi, questo compito viene svolto principalmente dal sistema olfattivo e dai suoi sottosistemi sottostanti, compresi i sistemi olfattivi principali e accessori. Entrambi hanno organi periferici popolati da neuroni sensoriali che esprimono recettori accoppiati a proteine G in grado di legare segnali chimici che raggiungono la cavità nasale. Anche se le caratteristiche molecolari di questi recettori sono ben note, si sa poco sui loro ligandi specifici affini. Il metodo qui descritto combina il rilevamento dell'ibridazione in situ dei recettori olfattivi o vomeronasali con l'immunorilevamento della proteina ribosomiale fosforilata S6 (pS6), un marcatore di attivazione neuronale. Questo protocollo è stato ideato per identificare i neuroni attivati dopo un singolo evento di esposizione a stimoli chimici purificati o complessi rilevati dagli organi olfattivi. È importante sottolineare che questa tecnica consente lo studio di neuroni attivati in contesti biologicamente rilevanti. Idealmente, questo metodo dovrebbe essere utilizzato per sondare la biologia molecolare del sistema olfattivo e per studiare i comportamenti olfattivi.

Introduzione

La chemiosegnalazione è la forma di comunicazione più diffusa negli animali. Nei mammiferi, il rilevamento di segnali chimici è mediato principalmente dall'olfatto ed è fondamentale per trovare cibo, localizzare possibili partner di accoppiamento ed evitare potenziali predatori 1,2,3. Il sistema olfattivo del topo è ulteriormente suddiviso in diversi sottosistemi, ognuno con le proprie proprietà anatomiche, fisiologiche e molecolari4. Tra questi, il sistema olfattivo principale (MOS) e il sistema olfattivo accessorio (AOS) sono i più studiati e meglio caratterizzati.

Il MOS è principalmente responsabile del rilevamento di molecole chimiche volatili che raggiungono la cavità nasale. Ciò è realizzato dai neuroni sensoriali olfattivi (OSN), che popolano l'interfaccia sensoriale del sistema, l'epitelio olfattivo principale (MOE). Ogni OSN esprime uno su migliaia di recettori olfattivi (OR) in modo monogenico e monoallelico5. Inoltre, gli OR tendono ad essere ampiamente sintonizzati6 e un singolo odorante può legarsi a più di un OR, generando un codice combinatorio per gli odori7.

A sua volta, l'AOS è il principale responsabile del rilevamento di feromoni e cairomone. Questi ligandi attivano i neuroni sensoriali vomeronasali (VSN) nell'organo vomeronasale (VNO). I VSN nella zona apicale del VNO esprimono i recettori della famiglia dei recettori vomeronasali 1 (V1R)8, mentre i neuroni nella zona basale esprimono la famiglia dei recettori vomeronasali 2 (V2Rs)9. È importante sottolineare che è stato dimostrato che alcuni VSN co-esprimono più di un recettore vomeronasale 10,11,12.

Nonostante tutte le informazioni disponibili sulle caratteristiche molecolari di OR e VR, le conoscenze sui loro ligandi affini sono ancora molto limitate. L'identificazione di specifici neuroni olfattivi responsabili del rilevamento di una molecola o di uno stimolo complesso è un compito importante per coloro che studiano l'olfatto, i comportamenti guidati dall'olfatto e le risposte fisiologiche. Sono state tentate diverse strategie per deorfanizzare i recettori olfattivi, tra cui l'imaging del calcio7, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula13,14, l'espressione del recettore eterologo15 e le strategie basate sui geni precoci immediati (IEG)16. Più recentemente, alcune tecniche sono state impiegate per valutare gli effetti modulatori degli odoranti nei neuroni sensoriali, utilizzando l'imaging in vivo del calcio17,18 e strategie di sequenziamento dell'RNA a singola cellula marcate con proteine fluorescenti19. La maggior parte di queste tecniche richiede una configurazione artificiale o viene eseguita su neuroni dissociati, rendendo impossibile valutare contemporaneamente i comportamenti innescati dagli odori utilizzati.

Il protocollo qui descritto consente l'identificazione dei neuroni sensoriali attivati dopo un singolo evento di esposizione agli odori, combinando ribosonde che rilevano specifici OR o VR con l'immunorilevazione della proteina ribosomiale S6 fosforilata (pS6), un proxy per l'attivazione neuronale. Questo metodo è un modo affidabile per studiare l'identità dei neuroni sensoriali attivati da diversi chemiosegnali in un contesto biologicamente rilevante.

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Protocollo

Le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con l'Animal Protocol #1883-1, approvato dall'Università di Campinas (Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Istituto di Biologia - Comitato per l'Etica nell'Uso degli Animali nella Ricerca), che segue le linee guida stabilite dal Consiglio Nazionale Federale per il Controllo della Sperimentazione Animale (CONCEA).

1. Preparazione del materiale

  1. Preparare 1 L di 3% H2O2 (v/v) in 1x PBS. Diluire 100 mL 10× PBS e 100 mL di 30% H2O2 in 500 mL di acqua ultrapura. Completare il volume con acqua ultrapura. Preparare questa soluzione immediatamente prima dell'uso.
  2. Preparare una camera umidificata contenente pezzi di salviette da laboratorio prive di lanugine bagnate con una soluzione di SSC al 5×.
  3. Preparare soluzioni di lavaggio per ibridazione: 5× SSC (a 55 °C), 2× SSC (55 °C), 0,2× SSC (55 °C) e 0,1× SSC (55 °C e temperatura ambiente). Sciogliere i volumi appropriati di soluzione madre di SSC al 20× in acqua ultrapura priva di RNasi. Preparare le soluzioni diluite fresche prima dell'inizio di ogni esperimento.
  4. Preparare una soluzione bloccante per l'immunoistochimica: 1× PBS/1% BSA/0,1% Triton X-100. Per 100 mL, diluire 10 mL di PBS al 10×, 10 mL di BSA al 10% e 3,33 mL di Triton X-100 al 3% in 70 mL di acqua ultrapura. Completare il volume con acqua ultrapura. Preparare le soluzioni diluite fresche prima dell'inizio di ogni esperimento.
  5. Preparare la soluzione PTw: 1× PBS/0,1% Tween-20. Per 100 mL, diluire 1 mL di Tween-20 al 10% e 10 mL di PBS al 10× in 70 mL di acqua ultrapura. Completare il volume con acqua ultrapura. Prepara questa soluzione fresca prima dell'inizio di ogni esperimento.
  6. Preparare una soluzione di trietanolammina 0,1 M priva di RNasi. Per 250 mL, diluire 3,33 mL di trietanolammina reagente in 200 mL di acqua ultrapura priva di RNasi sotto agitazione (utilizzare vetreria priva di RNasi e agitatore magnetico durante la preparazione di questa soluzione). Regolare il pH a 8,0 con HCl. Completare il volume con acqua ultrapura priva di RNasi e conservare al riparo dalla luce fino all'uso. Prepara questa soluzione fresca prima dell'inizio di ogni esperimento.
  7. Preparare senza RNasi 0,1% H2O2 (v/v) in 1× PBS. Per 1 L, diluire 100 mL di PBS al 10× e 3,3 mL di H2O2 al 30% in 500 mL di acqua ultrapura priva di RNasi. Completa il volume con acqua ultrapura priva di RNasi. Preparare questa soluzione immediatamente prima dell'uso.
  8. Preparare soluzioni prive di RNasi dei seguenti: 0,2 M HCl; 1 M Tris-HCl pH 8,0; 10 mg/mL di tRNA di lievito; 10% SDS; 10× PBS; 100× soluzione di Denhardt; 20× SSC; 50% destrano solfato; 6 M HCl
  9. Preparare una soluzione fissativa di paraformaldeide al 4% priva di RNasi. Per 100 mL, sciogliere 4 g di paraformaldeide in 80 mL di 1× PBS. Regolare il pH a 7,4 con 10 M NaOH. Completa il volume con 1× PBS. Questa soluzione deve essere preparata fresca prima dell'inizio di ogni esperimento.
    Cautela: La paraformaldeide è una sostanza pericolosa che può potenzialmente causare danni se inalata. Preparare la soluzione sotto una cappa aspirante e indossare guanti protettivi, maschera e occhiali di sicurezza.
  10. Preparare una soluzione di dissezione priva di RNasi: saccarosio al 30%/0,45 M EDTA pH 8,0/1× PBS. Per 100 mL, sciogliere 30 g di saccarosio in 60 mL di EDTA 0,5 M privo di RNasi pH 8,0. Aggiungere 10 ml di PBS a 10×. Completa il volume con 0,5 M EDTA pH 8,0 privo di RNasi.
  11. Preparare cilindri e becher graduati in vetro o plastica privi di RNasi.
  12. Preparare soluzioni di pre-ibridazione e ibridazione prive di RNasi: 50% formammide deionizzata (v/v)/600 mM NaCl/200 μg/mL tRNA di lievito/0,25% SDS (p/v)/10 mM Tris-HCl pH 8,0/1× soluzione di Denhardt/1 mM EDTA pH 8,0/10% destrano solfato (p/v). Per 10 mL in un cilindro graduato, aggiungere 5 mL di formammide deionizzata, 1,2 mL di NaCl 5 M, 200 μL di tRNA di lievito 10 mg/mL, 250 μL di SDS al 10%, 100 μL di Tris-HCl 1 M pH 8.0, 200 μL di soluzione di Denhardt al 50×, 20 μL di EDTA pH 8.0 da 500 mM e 2 mL di destrano solfato al 50% (M.W. 500.000). Completa il volume con acqua ultrapura priva di RNasi. Prepara questa soluzione fresca prima dell'inizio di ogni esperimento.
    NOTA: Il destrano solfato è molto viscoso. Si consiglia di preparare un ulteriore 20% del volume totale delle soluzioni di ibridazione/pre-ibridazione per tenere conto degli errori di pipettaggio. Il tRNA del lievito può essere omesso dalla soluzione di pre-ibridazione, se lo si desidera.
  13. Preparare i vetrini coprioggetti in pellicola termoplastica da laboratorio. Tagliare pezzi di pellicola termoplastica da laboratorio rettangolari più corti di 1-2 mm rispetto alla lunghezza e alla larghezza di un vetrino da microscopio.
  14. Preparare il tampone TN: 100 mM Tris-HCl/150 mM NaCl. Per 100 mL, diluire 10 mL di Tris-HCl 1 M pH 7,5 e 3 mL di NaCl 5 M in 70 mL di acqua ultrapura. Completare il volume con acqua ultrapura. Prepara questa soluzione fresca prima dell'inizio di ogni esperimento.
  15. Preparare il tampone di blocco TNB: 0,5% di reagente bloccante A (p/v) nel tampone TN. Per 200 mL, sciogliere 1 g di reagente bloccante A in 200 mL di tampone TN (vedere la Tabella dei materiali per la fonte commerciale del reagente bloccante A).
  16. Preparare il buffer TNT: 0,05% Tween-20 nel buffer TN. Per 1 L, diluire 5 mL di Tween-20 al 10% in 950 mL di tampone TN. Completare lentamente il volume con il tampone TN per evitare la formazione di schiuma. Prepara questa soluzione fresca prima dell'inizio di ogni esperimento.
  17. Preparare la soluzione di lavoro di Tyramide-Alexa 488: 1× tampone di amplificazione A/0,0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 488. Per 100 μl, diluire 1 μl di 0,15% di H2O2 e 1 μl di tiramide-Alexa 488 in 98 μl di tampone di amplificazione A (vedere la tabella dei materiali per le fonti commerciali di tirammide-Alexa 488 e tampone di amplificazione A). Preparare questa soluzione immediatamente prima dell'uso.
  18. Preparare la soluzione di lavoro di Tyramide-Alexa 555: 1× tampone di amplificazione A/0,0015% H2O2/1:100 tyramide-Alexa 555. Per 100 μl, diluire 1 μl di 0,15% di H2O2 e 1 μl di tirammide-Alexa 555 in 98 μl di tampone di amplificazione A (vedere la tabella dei materiali per le fonti commerciali di tiramide-Alexa 555 e tampone di amplificazione A). Preparare questa soluzione immediatamente prima dell'uso.
  19. Preparare la soluzione di lavoro della tiramide-biotina: 1× tampone di amplificazione B/0,0015% H2O2/1:50 tirammide-biotina. Per 100 μl, diluire 1 μl di 0,15% di H2O2 e 2 μl di tirammide-biotina in 97 μl di tampone di amplificazione B (vedere la tabella dei materiali per le fonti commerciali di tiroamide-biotina e il tampone di amplificazione B). Preparare questa soluzione immediatamente prima dell'uso.
  20. Cuocere la vetreria a 200 °C per almeno 4 ore. Trattare gli articoli in plastica non monouso (inclusi rack per vetrini, barattoli Coplin e siringhe) con il 3% di H2O2 per 15-30 minuti, seguiti da un lavaggio accurato in acqua priva di RNasi. Trattare gli strumenti metallici in acciaio inossidabile, come strumenti di dissezione, pinze e portacampioni di criostato, con il 3% di H2O2 per 15 minuti, seguito da un lavaggio accurato in acqua priva di RNasi. Pulire le superfici del banco, la piastra riscaldata e asciugare i blocchi con la soluzione detergente RNase.

2. Sintesi di riboprobe

NOTA: La seguente procedura per sintetizzare sonde di cRNA marcate con digossigenina da 1 kb per l'ibridazione in situ tramite trascrizione in vitro si basa sui protocolli precedentemente pubblicati 20,21,22,23.

  1. Utilizzare coppie di primer oligonucleotidici appropriate per amplificare un frammento di DNA da 1 kb dal gene di interesse (ad esempio, il gene del recettore olfattivo). Selezionare coppie di primer che amplificano una regione presente nell'mRNA maturo da rilevare (ad esempio, la sequenza codificante del gene). Una selezione di primer per diversi recettori olfattivi è fornita nella Tabella dei materiali. Per i dettagli sulle sonde per rilevare altri recettori olfattivi vomeronasali, consultare le pubblicazioni precedenti16,21.
  2. Eseguire i prodotti PCR su un gel di agarosio allo 0,8% e rimuovere la banda da 1 kb desiderata.
  3. Purificare il frammento di DNA utilizzando un kit di purificazione in gel basato su mini colonna adatto secondo il protocollo del produttore.
  4. Quantificare il frammento di DNA purificato e clonarlo in un vettore di clonazione PCR adatto secondo il protocollo del produttore. Si consiglia di utilizzare vettori di clonazione contenenti promotori della RNA polimerasi T7 e SP6 che fiancheggiano l'amplicone clonato.
  5. Trasforma il plasmide ricombinante in batteri competenti privi di ricombinazione tramite trasformazione chimica o elettroporazione secondo il protocollo del produttore.
  6. Seminare colonie batteriche trasformanti isolate in un terreno ricco e isolare il plasmide tramite una mini-preparazione di DNA secondo il protocollo del produttore.
  7. Eseguire l'analisi della digestione di restrizione con enzimi di restrizione idonei e/o il sequenziamento Sanger per verificare l'identità e l'orientamento del frammento di DNA inserito secondo il protocollo del produttore.
  8. Eseguire la digestione di restrizione per linearizzare 10 μg del plasmide utilizzando un enzima di restrizione appropriato. Per produrre una ribosonda antisenso dopo la trascrizione in vitro , utilizzare un enzima di restrizione che digerisce il DNA plasmidico all'estremità dell'inserto opposto al promotore dell'RNA polimerasi situato a valle della sequenza codificante del gene. Per produrre ribosonde di senso dopo la trascrizione in vitro , utilizzare un enzima di restrizione che digerisce il DNA plasmidico all'estremità dell'inserto opposto al promotore dell'RNA polimerasi situato a monte della sequenza codificante del gene.
  9. Eseguire un'aliquota del prodotto della reazione di linearizzazione plasmidica su un gel di agarosio allo 0,8% per confermare la completezza della digestione. Una volta confermata la linearizzazione completa, purificare il resto della reazione utilizzando un kit di pulizia PCR basato su colonna secondo il protocollo del produttore.
  10. Sintetizzare sonde di cRNA marcate con digossigenina mediante trascrizione in vitro utilizzando 1-2 μg del plasmide linearizzato come stampo, l'enzima appropriato (ad es. RNA polimerasi T7 o SP6) e un kit di marcatura della digossigenina (DIG) adatto.
  11. Rimuovere il modello di DNA dalla reazione digerendo con DNasi I a 37 °C per 30 minuti.
  12. Purificare le sonde di cRNA utilizzando un kit di purificazione dell'RNA basato su mini colonna o un kit di purificazione basato sulla filtrazione su gel. Eluire la sonda risultante in 50 μL di acqua priva di RNasi.
  13. Quantificare la ribosonda risultante, preferibilmente utilizzando metodi fluorimetrici. Di solito, la resa attesa è superiore a 100 ng/μL.
  14. Far funzionare la ribosonda su un sistema di elettroforesi automatizzato o su un gel di agarosio allo 0,8% privo di RNasi per verificare la qualità e la degradazione della sonda.
  15. Conservare la sonda sintetizzata a -80 °C fino al momento del bisogno.

3. Esposizione dei topi a stimoli olfattivi

  1. Alloggiare individualmente ogni animale in una gabbia pulita per almeno 24 ore prima dell'esposizione. Rimuovere la griglia alimentare almeno 2 ore prima dell'esposizione. Tutti gli animali utilizzati in questo studio erano topi maschi C57BL/6 di 8-12 settimane (peso medio: 20 g).
  2. Preparare lo stimolo olfattivo appropriato. Diversi stimoli possono essere utilizzati per attivare i neuroni olfattivi nel MOE (epitelio olfattivo principale) o nel VNO (organo vomeronasale). Per un elenco completo degli stimoli olfattivi, consultare le altre pubblicazioni3, 16, 22,23,24. Gli stimoli liquidi, come soluzioni chimiche, urina o soluzione proteica ricombinante, possono essere depositati su una garza medica o un batuffolo di cotone.
  3. Inserire lo stimolo olfattivo nella gabbia e lasciare l'animale indisturbato per 1 ora.
  4. Eutanasia del soggetto topo e sezionare rapidamente il MOE o il VNO utilizzando strumenti di dissezione privi di RNasi.

4. Dissezione e congelamento dei tessuti

  1. Sezionare il MOE o il VNO al microscopio stereoscopico utilizzando la soluzione di dissezione.
    1. Per il VNO, rimuovere le ossa del setto settale spesse, lasciando i gusci di cartilagine più morbidi che circondano l'organo.
  2. Preparare il campione per la criosezione.
    1. Asciugare il campione su un pezzo di carta assorbente e posizionarlo all'interno di uno stampo di plastica istologica contenente terreno di inclusione.
    2. Per VNO, disporre ogni organo verticalmente e tirarlo sul fondo dello stampo di plastica con l'aiuto di una siringa da 1 ml (Figura 1A).
    3. Per MOE, posizionarlo sul fondo dello stampo di plastica con la piastra cribrosa rivolta verso il basso.
    4. Rimuovere l'eccesso di bolle attorno al campione poiché queste possono interferire con il sezionamento.
    5. Congelare i campioni su ghiaccio secco.
    6. Conservare il blocco del campione a -80 °C.
      NOTA: I campioni congelati possono essere conservati per diversi mesi prima del sezionamento.
  3. Eseguire la criosezione.
    1. Accendere il criostato e impostare la temperatura a -23 °C almeno 4 ore prima dell'uso.
    2. Rimuovere il blocco congelato dallo stampo istologico in plastica e tagliarlo con una lama di rasoio.
    3. Lasciare 5 mm intorno al campione, in quanto ciò facilita la manipolazione della sezione (Figura 1B).
    4. Utilizzare un mezzo di inclusione per fissare il blocco al portacampioni del criostato.
    5. Raccogli sezioni da 16 μm su vetrini da microscopio caricati positivamente.
    6. Conservare i vetrini a -80 °C.
      NOTA: I vetrini possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi prima dell'ibridazione in situ .

5. Protocollo di ibridazione in situ passo-passo

  1. Asciugare le diapositive per 10 minuti utilizzando un asciugacapelli. Utilizzare il getto caldo per scongelare i vetrini, quindi passare al getto a temperatura ambiente fino a quando il mezzo di inclusione non diventa opaco.
  2. Aggiungere 500 μl per vetrino di soluzione fissativa di paraformaldeide al 4% priva di RNasi e incubare a 23-26 °C per 15 minuti per fissare le sezioni istologiche.
  3. Lavare i vetrini due volte in PBS 1× privo di RNasi per 5 minuti ciascuno.
  4. Aggiungere 500 μl per vetrino di HCl 0,2 M privo di RNasi e incubare a 23-26 °C per 10 minuti.
  5. Lavare i vetrini due volte in PBS 1× privo di RNasi per 5 minuti ciascuno.
  6. Aggiungere 500 μl per vetrino di PBS 0,1% H2O2/1× privo di RNasi e incubare per 30 minuti a 23-26 °C. Eseguire questo passaggio al buio per evitare la degradazione del perossido di idrogeno indotta dalla luce.
  7. Lavare due volte i vetrini in 1× PBS senza RNasi per 5 minuti ciascuno.
  8. Eseguire l'acetilazione trasferendo i vetrini in un barattolo contenente 250 mL di trietanolammina 0,1 M senza RNasi pH 8,0 e una barra di agitazione magnetica, in una cappa aspirante. Aggiungere 625 μl di anidride acetica agitando costantemente. Ridurre la velocità di agitazione, aggiungere altri 625 μl goccia per goccia sui vetrini, quindi spegnere l'agitazione e incubare per 10 minuti.
  9. Lavare due volte i vetrini in 1× PBS senza RNasi per 5 minuti ciascuno.
  10. Lavare una volta i vetrini in 1× PBS senza RNasi a 60 °C per 5 minuti.
  11. Eseguire la pre-ibridazione rimuovendo i vetrini da 1× PBS uno alla volta e asciugandoli con carta velina da laboratorio priva di lanugine. Versare 400 μL di soluzione di pre-ibridazione su ciascun vetrino e posizionarlo all'interno di una camera umidificata preriscaldata a 60 °C in un bagno d'acqua o in un forno riscaldato. Incubare a 60 °C per 1 ora.
  12. Riscaldare una quantità sufficiente di soluzione di ibridazione a 60 °C, aliquotare 200 μl per vetrino in provette per microfughe e riscaldarle fino a 85 °C per 10 minuti.
  13. Aggiungere la sonda o le sonde di cRNA appropriate alle provette della soluzione di ibridazione (1 μg/mL ciascuna) e denaturare a 85 °C per 5 minuti.
  14. Per l'ibridazione, prelevare un vetrino alla volta dalla camera umidificata, asciugarlo e posizionarlo su una piastra riscaldata a 60 °C. Aggiungere 200 μl di soluzione di ibridazione contenente riboprobe e coprire il vetrino con un vetrino coprioggetti. Incubare per 12-16 ore in camera umidificata a 60 °C.
    NOTA: Non lasciare che i vetrini si raffreddino dopo la pre-ibridazione. La temperatura di ibridazione deve essere determinata empiricamente per ogni sonda. Si consiglia di utilizzare sessanta gradi Celsius come punto di partenza, poiché generalmente funziona bene per sonde da 1 kb.
  15. Riscaldare le soluzioni di lavaggio SSC a 55 °C in barattoli separati e metterle a bagnomaria alla temperatura appropriata.
  16. Al termine dell'ibridazione, rimuovere il vetrino coprioggetti da ciascun vetrino utilizzando un bagno contenente una soluzione di SSC al 5× a 55 °C. Tenere ogni vetrino orizzontalmente all'interno della soluzione calda SSC. Quando il vetrino coprioggetti si è staccato, inclinare il vetrino e lasciare che il vetrino cada sul fondo.
  17. Lavare con 2× SSC a 55 °C per 30 minuti in un barattolo scorrevole.
  18. Lavare con 0,2× SSC a 55 °C per 20 minuti in un barattolo per vetrini.
  19. Lavare con SSC 0,1× a 55 °C per 20 minuti in un barattolo scorrevole.
  20. Trasferire a 0,1× SSC a 23-26 °C e incubare per 3 minuti in un barattolo per vetrini.
  21. Lavare in PTw per 10 minuti in un barattolo per vetrini.
  22. Lavare due volte in TN Buffer, per 5 minuti ciascuno, in un barattolo per vetrini.
  23. Pipet 600 μL di tampone di blocco TNB su ciascun vetrino e incubare per 3 ore a 23-26 °C.
  24. Pipet 500 μl di soluzione di anticorpi primari (anticorpo anti-DIG coniugato con perossidasi diluito 1:400 in soluzione di TNB) su ciascun vetrino. Sovrapporre con cura un pezzo di pellicola termoplastica da laboratorio su ciascun vetrino e incubare per 12-16 ore a 4 °C.
  25. Lavare i vetrini 6 volte con TNT Buffer per 5 minuti ciascuno, mescolando delicatamente in un barattolo per vetrini.
  26. Pipet 100 μL di soluzione di lavoro tiroamide-biotina su ciascun vetrino. Coprire con vetrini coprioggetti in pellicola termoplastica da laboratorio e incubare per 12 minuti a 23-26 °C.
    NOTA: Eseguire questa fase di incubazione in modo scaglionato, con 2 o 3 vetrini per lotto, per consentire un buon controllo dei tempi di incubazione. Potrebbe essere necessario ottimizzare la durata dell'incubazione della tiramide, a seconda della sensibilità e della concentrazione della sonda cRNA.
  27. Lavare i vetrini 6 volte con TNT Buffer per 5 minuti ciascuno, mescolando delicatamente in un barattolo per vetrini.
  28. Pipett 200 μL di soluzione contenente streptavidina coniugata con perossidasi (SA-HRP, diluita 1:100 in tampone TNB) su ciascun vetrino e coprire con un vetrino coprioggetti in film termoplastico da laboratorio. Incubare a 23-26 °C per 1 ora.
  29. Lavare i vetrini 6 volte con TNT Buffer per 5 minuti ciascuno, mescolando delicatamente in un barattolo per vetrini.
  30. Pipett 100 μL di soluzione di lavoro tyramide-Alexa 488 su ciascun vetrino, coprire con vetrino coprioggetto in pellicola termoplastica da laboratorio e incubare a 23-26 °C per 12 minuti al buio.
  31. Lavare i vetrini 6 volte con TNT Buffer per 5 minuti ciascuno, mescolando delicatamente in un barattolo per vetrini.
  32. Incubare in PBS al 3% H2O2/1× in un barattolo per vetrini per 1 h, per inattivare le perossidasi dei passaggi precedenti.
  33. Lavare i vetrini 6 volte con TNT Buffer per 5 minuti ciascuno, mescolando delicatamente in un barattolo per vetrini.

6. Immunocolorazione pS6

  1. Pipett 500 μL di soluzione di paraformaldeide al 4%/1× PBS su ciascun vetrino e incubare a 23-26 °C per 15 minuti per fissare le sezioni.
  2. Pipetare 500 μl di 1× PBS/0,1% Triton X-100 su ciascun vetrino e incubare per 5 minuti per permeabilizzare le sezioni.
  3. Lavare due volte con 1× PBS in un barattolo per vetrini.
  4. Pipet 2-3 gocce per sezione della soluzione di blocco dell'amplificazione del segnale di tiramide disponibile in commercio B (Tabella dei materiali) e incubare a 23-26 °C per 1 ora.
  5. Versare 400 μL di soluzione bloccante l'immunoistochimica su ciascun vetrino e incubare a 23-26 °C per 30 minuti per bloccare le sezioni.
  6. Pipet 200 μL di soluzione di anticorpi primari di coniglio anti-pS6 (diluita 1:200 in soluzione bloccante immunoistochimica; concentrazione finale: 1 μg/mL) su ciascun vetrino, coprire con pellicola termoplastica da laboratorio e incubare a 4 °C per 12-16 ore.
  7. Lavare 3 volte con 1× PBS/0,1% Triton X-100, per 5 minuti ciascuna in un barattolo per vetrini.
  8. Pipettare 2-3 gocce per vetrino di soluzione di anticorpi secondari anti-coniglio coniugati con perossidasi disponibile in commercio (Tabella dei materiali) e incubare a 23-26 °C per 1,5 ore.
  9. Lavare 3 volte con 1× PBS/0,1% Triton X-100, per 5 minuti ciascuna in un barattolo per vetrini.
  10. Tamponare i vetrini a secco e pipettare da 100 a 200 μl di soluzione di lavoro tyramide-Alexa 555 su ciascun vetrino, sovrapporlo con un pezzo di vetrino coprioggetto in film termoplastico da laboratorio e incubare per 7 minuti al buio.
  11. Lavare due volte con 1× PBS per 5 minuti ciascuno in un barattolo per vetrini.
  12. Pipettare 500 μL di colorante nucleare diluito (in 1× PBS) su ciascun vetrino e incubare a 23-26 °C per 30 min.
  13. Lavare due volte con 1× PBS a 23-26 °C per 5 minuti ciascuno in un barattolo a vetrini.
  14. Monta le guide con un mezzo di montaggio anti-sbiadimento e lascia indurire il supporto di montaggio per 24 ore al buio.
  15. Conservare i vetrini alla temperatura appropriata fino all'imaging, per evitare lo sbiadimento della fluorescenza.

7. Imaging al microscopio

  1. Vetrini di immagini utilizzando un microscopio a epifluorescenza o confocale dotato di filtri appropriati per i fluorofori utilizzati.

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Risultati

L'attuale protocollo mira ad ottenere immagini microscopiche in cui il gene di interesse dello sperimentatore e il marcatore di attività neuronale pS6 sono marcati in fluorescenza. Il metodo descritto prevede l'amplificazione del segnale Tyramide, che produce un'etichettatura chiara e forte con poco o nessun sfondo. L'immunocolorazione di pS6 appare come segnale fluorescente citoplasmatico che di solito riempie l'intero corpo cellulare neuronale, mentre il segnale di ibridazione in situ per i neuroni del recetto...

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Discussione

Il protocollo qui descritto identifica in modo affidabile i neuroni sensoriali attivati da segnali chimici nel sistema olfattivo attraverso una combinazione di rilevamento in situ di recettori OR o VR con l'immunorilevamento di pS6, un marcatore indiretto dell'attività neuronale. Lo sperimentatore deve prestare particolare attenzione per mantenere l'integrità istologica ed eseguire tutti i passaggi prima dell'ibridazione in condizioni prive di RNasi. In caso contrario, potrebbe ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti di alcun tipo.

Ringraziamenti

Ringraziamo GAG Pereira e JA Yunes per le risorse, APF Ferreira e WO Bragança per l'assistenza amministrativa e tecnica e il personale della Life Sciences Core Facility (LaCTAD-UNICAMP) per l'aiuto con la microscopia confocale. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione per la Ricerca di San Paolo (FAPESP; sovvenzioni 2009/00473-0 e 2015/50371-0 a F.P.), da PRP/UNICAMP (sovvenzioni 2969/16, 725/15, 348/14 e 315/12 a F.P.), da borse di studio FAPESP a V.M.A.C. (2014/25594-3, 2012/21786-0, 2012/01689-0), T.S.N. (2012/04026-1) e dalla borsa di studio Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) a T.S.N.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9625n/a
20x diluente di amplificazione (tampone di reazione da  Kit Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923 o B40922indicato come tampone di amplificazione A nelle soluzioni funzionanti per l'amplificazione del segnale tyramide-Alexa 488 o tyramide-Alexa 555
20x SSCMerck (Calbiochem)8310-OPn/a
30% albumina sierica bovina (BSA)Merck (Sigma-Aldrich)A9576n/a
30% perossido di idrogeno (H2O2)Merck (Sigma-Aldrich)H1009n/a
Anidride aceticaMerck (Sigma-Aldrich)320102n/a
AgarosioMerck (Sigma-Aldrich)A9539n/a
Diluente di amplificazione (dal kit di biotina TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAindicato come tampone di amplificazione B in soluzione di lavoro per l'amplificazione del segnale tiromide-biotina
Anticorpo policlonale di coniglio anti-pS6 (Ser 244/247)Thermo Fisher ScientificCat# 44-923G, RRID:AB_2533798n/a
Tampone di blocco 1x (dal kit Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923 o  B40922come soluzione bloccante B nella fase di sviluppo del segnale della tiramide
Reagente bloccante (dal kit TSA Biotin)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAindicato come reagente bloccante A nella formulazione per tampone TNB
DAPI colorazione nucleareThermo Fisher ScientificD1306n/a
Soluzione di Denhardt (50x)Merck (Sigma-Aldrich)D9905n/a
Formamide deoinizzataMerck (Sigma-Aldrich)F9037n/a
Soluzione di destrano solfato (50%)Merck (Chemicon)S4030n/a
Acido etilene-diammina-tetraacetico (EDTA)Merck (Sigma-Aldrich)E9884n/a
Hoechst 33342 colorazione nucleareThermo Fisher ScientificH1399n/a
Acido cloridrico (HCl)Merck ( Sigma-Aldrich)320331n/a
Stimoli olfattivin/aPapes et al. (2010), Carvalho et al. (2015), Nakahara er al. (2016), Carvalho et al. (2020)n/a
ParaformaldeideMerck (Sigma-Aldrich)P6148n/a
Anticorpo anti-digossigenina coniugato con perossidasi (Fab fragments)Merck (Roche)11207733910;   RRID:AB_514500indicato come anticorpo anti-DIG coniugato con perossidasi
, anticorpo secondario anti-coniglio coniugato con perossidasi (reagente anti-coniglio di capra coniugato con poliHRP da  Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kit)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Streptavidina coniugata con perossidasi (dal kit di biotina TSA)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Montante antisbiadimento ProLong GoldThermo Fisher ScientificP36934indicato come mezzo di montaggio anti-sbiadimento
Acqua ultrapura priva di RNasiThermo Fisher Scientific10977015n/a
Cloruro di sodio (NaCl)Merck (Sigma-Aldrich)S9888n/a
Dodecil solfato di sodio (SDS)Merck (Sigma-Aldrich)436143n/a
Idrossido di sodio (NaOH)Merck (Sigma-Aldrich)S8045n/a Saccarosio
Merck (Sigma-Aldrich)S0389n/a
TrietanolamminaMerck (Sigma-Aldrich)T58300n/a
Triton X-100Merck (Sigma-Aldrich)X100n/a
Trizma cloridrato (Tris-Cl)Merck (Sigma-Aldrich)T5941n/a Tween-20
Merck (Sigma-Aldrich)822184n/a
Tyramide-Alexa 488 coniugato (dal kit Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40922n/a
Coniugato Tyramide-Alexa 555 (dal kit Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost)Thermo Fisher ScientificB40923n/a
Coniugato Tiramide-Biotina (dal kit TSA Biotin)Akoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Lievito tRNAMerck (Roche)10109495001n/a
Critical Commercial Assays and Animals
Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40922n/a
Alexa Fluor 555 Tyramide SuperBoost kitThermo Fisher ScientificB40923n/a
DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7)Merck (Roche)11175025910n/a
High Sensitivity RNA ScreenTape Analysis reagenti (tampone, ladder e nastro)Agilent5067-5580, 5067-5581 e 5067-5579indicato come sistema di elettroforesi automatizzato
Topo: C57BL/6J ceppo consanguineoJackson LaboratoriesCodice prodotto:  000664;   RRID:IMSR_JAX:000664)n/a
ProbeQuant G-50 Micro colonneCytiva Biosciences28903408indicato come kit di purificazione basato sulla filtrazione su gel
QIAquick kit di estrazione del gelQiagen28506indicato come kit di purificazione del gel basato su mini colonna
RNeasy MinElute kit di purificazioneQiagen74204indicato come kit di purificazione dell'RNA basato su mini colonna
TSA Kit di biotinaAkoya Biosciences (Perkin Elmer)SAT700001EAn/a
Oligonucleotidi
5' – AAACTTCATCCTTACAGAATGG
CAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr692
5' – ACTGGCTTTGGGACAGTGTGAC – 3'Tecnologie DNA integraten/a
5'- GGTAATATCTCCATTATCCTAGTT
TCCC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr124
5' – TTGACCCAAAACTCCTTTGTTAG
TG – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – ATGGGAGCTCTAAATCAAAAA
GAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr1509
5' – TAGAAAACCGATACCACCTTGTC
G – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – TACATCCTGACTCAGCTGGGGA
ACG – 3'		Tecnologie DNA integraten/aOlfr1512
5' – GGGCACATAGTACACAGTAACA
ATAGTC – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – GAGGAAGCTCACTTTTGGTTTG
G – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr78
5' – CAGCTTCAATGTCCTTGTCACA
G – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – TGGGTTGGAGGCTTATCATACC
TG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr691
5' – AAGAACAACACAGAGTCTTGAT
GTC – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – AGAAGTAACTAACACCACTCAT
GGC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr638
5' – TTAGTGCACCTTTCTTTGCAAC – 3'Tecnologie DNA integraten/a
5' – TAACAGCTCTTCCCATCCCCTG
TTC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aOlfr569
5' – TAGGGTTGAGCATGGGAGGAAC
AAGC – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – CACTGGATCAACTCTAGCAGCA
CTG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r1
5' – CTGCCCTTCTTGACATCTGCTGCTG
AG – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – ATCGGATCCACTGCTTTAGCATT
TCTTACAGGACAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r2
5' – ATCCTCGAGTCATGCCTCTCCAT
AAGCAAGGAATTCCAC – 3'Integrated		DNA Technologiesn/a
5' – TAGGAAGCTATTTGCCTTGTTTC
CAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r13
5' – AGGAGATTTTACCAACCAGATTC
CAG – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – CTCTAAGAACAGCAGTAAAATGG
ATCT – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r89
5' – ATGGGAATGACCAACTTAGGTGC
A – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – ATCCCATGGCTGAGAACATGTGC
TTCTGGAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r118
5' – ATCCTCGAGTCAGTCTGCATAAG
CCAGATATGTCAC – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – ATCGGATCCGCTGATTTTATTTCT
CCCAGATGCTTTTGG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r116
5' – ATCCTCGAGTCATGGTTCTTCAT
AGCTGAGAAATACAAC – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – TGGGTGTCTTCTTTCTCCTCAA
GA – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r28
5' – GGTGACCCATATTCTGTATAA
CTGT – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – GATGTTCATTTTCATGAGAGTCT
TCC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r41
5' – CATTTGTGGATGACATCACAATT
TGG – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – TTTATGGCAAATTTCACTGATCCC
G – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r46
5' – AGTGGGTCTTTCTTAGAAAGGAG
TG – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – ACATGAACCAGAATTTGAAGCAG
GC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r69
5' – GCCAAGAAAGCTACAGTGAAAC
C – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – AGGTGAAGAAATGGTATTCTTCC
AG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r58
ACTGTGGCCTTGAATGCAATAACT – 3'Tecnologie DNA integraten/a
5' – TTCCTAAAGAACACCCTACTGA
AGCATCG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r90
5' – CATATTCCACAGAAGAGAAGT
TGGAC – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – TTGAGGTGAGAGTCAACAGT
TTAGAC – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r107
5' – CCCTTGTTGCACAAAATGAT
GATGTGA – 3'		Tecnologie DNA integraten/a
5' – ATCCCATGGAGTCAGAGTAT
CTACTACACCATGATGG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/aVmn2r83
5' – ATCCTCGAGTCAATCATTAT
AGTCCAGAAAGGTGACAG – 3'		Integrated DNA Technologiesn/a
DNA ricombinante
pGEM-T-Easy vectorPromegaA1360consigliato PCR cloning vector
Other materials
1mL siringheFisher Scientific14-829-10Fn/a
Provette coniche (15 mL e 50 mL)Fisher Scientific14-432-22, 14-959-49Bn/a
Barattoli CoplinFisher Scientific12-567-099, 07-200-81n/a
CriostatoLeica BiosystemsCMS 1850n/a
Strumenti di dissezione e pinzeRobozRS-6802, RS-8124, RS-7110, RS-5111n/a
Bagno a seccon/an/an/a
Elettroforesi attrezzatureFisher Scientific09-528-110Bn/a
Pennelli a punta fineWinsor & Newton10269097n/a
Microscopio a fluorescenza o confocaleLeica MicrosystemsTCS SP5IIn/a
Piastra riscaldataFisher ScientificHP88850200n/a
Camera umidificata (se utilizzata a temperature più elevate, dovrà essere sigillata all'interno di un contenitore di plastica Tupperware)Thermo Fisher Scientific22-045-034n/a
Kimwipes da laboratorio senza lanugineKimberly-Clark34120indicato come carta velina da laboratorio priva di lanugine
MicrocentrifugaEppendorf5401000013n/a
Gabbie per topiInnoViveM-BTM, MVX1n/a
Termociclatore PCRThermo Fisher Scientific4375786n/a
Pipetta p1000, p200 e p20 puntali monousoFisher Scientific02-707-408, 02-707-411, 02-707-438n/a
Stampo per inclusione istologica in plasticaThermo Fisher Scientific22-19n/a
Qubit 4 FluorimetroThermo Fisher ScientificQ33238indicato come metodo fluorimetrico altamente sensibile
Lame di rasoio o bisturiFisher Scientific12-640n/a
RNA tapestation o BioAnalyzerAgilent4200 TapeStation System o 2100 Bioanalizzatore Strumenton/a
Cilindri e becher graduati in vetro o plastica privi di RNasiFisher Scientific10-462-833, 02-555-25B, 02-555-25Dn/a
StereomicroscopioLeica MicrosystemsM80n/a
Vetrini per microscopio SuperFrost PlusThermo Fisher Scientific12-550-15denominati vetrini per microscopio caricati positivamente
ParafilmBemis CompanyPM999indicato come film termoplastico da laboratorio
Bagno d'acquaThermo Fisher ScientificTSCIR19n/a
indicato

Riferimenti

  1. Stowers, L., Holy, T. E., Meister, M., Dulac, C., Koentges, G. Loss of sex discrimination and male-male aggression in mice deficient for TRP2. Science. 295 (5559), 1493-1500 (2002).
  2. Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
  3. Papes, F., Logan, D. W., Stowers, L. The vomeronasal organ mediates interspecies defensive behaviors through detection of protein pheromone homologs. Cell. 141 (4), 692-703 (2010).
  4. Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annual review of physiology. 71, 115-140 (2009).
  5. Chess, A., et al. Allelic inactivation regulates olfactory receptor gene expression. Cell. 78, 823-834 (1994).
  6. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature Reviews Neuroscience. 5, 263-278 (2004).
  7. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
  8. Dulac, C., Axel, R. A novel family of genes encoding putative pheromone receptors in mammals. Cell. 83 (2), 195-206 (1995).
  9. Herrada, G., Dulac, C. A novel family of putative pheromone receptors in mammals with a topographically organized and sexually dimorphic distribution. Cell. 90 (4), 763-773 (1997).
  10. Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-Expression of Putative Pheromone Receptors in the Sensory Neurons of the Vomeronasal Organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
  11. Silvotti, L., Moiani, A., Gatti, R., Tirindelli, R. Combinatorial co-expression of pheromone receptors, V2Rs. Journal of Neurochemistry. 103 (5), 1753-1763 (2007).
  12. Ishii, T., Mombaerts, P. Expression of nonclassical class I major histocompatibility genes defines a tripartite organization of the mouse vomeronasal system. Journal of Neuroscience. 28 (10), 2332-2341 (2008).
  13. Saraiva, L. R., et al. Hierarchical deconstruction of mouse olfactory sensory neurons: From whole mucosa to single-cell RNA-seq. Scientific Reports. 5, (2015).
  14. Hanchate, N. K., et al. Single-cell transcriptomics reveals receptor transformations during olfactory neurogenesis. Science. 350, 1251-1255 (2015).
  15. Matsunami, H. Functional expression of mammalian odorant receptors. Chemical Senses. 30, Suppl 1 95-96 (2005).
  16. Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
  17. Xu, L., Li, W., Voleti, V., Zou, D. J., Hillman, E. M. C., Firestein, S. Widespread receptor-driven modulation in peripheral olfactory coding. Science. 368 (6487), (2020).
  18. Pfister, P., et al. Article Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding Odorant Receptor Inhibition Is Fundamental to Odor Encoding. Current Biology. , 1-14 (2020).
  19. de March, C. A., Titlow, W. B., Sengoku, T., Breheny, P., Matsunami, H., McClintock, T. S. Modulation of the combinatorial code of odorant receptor response patterns in odorant mixtures. Molecular and Cellular Neuroscience. 104, 103469(2020).
  20. Nakahara, T. S., Carvalho, V. M. A., Souza, M. A. A., Trintinalia, G. Z., Papes, F. Detection of Activated Mouse Neurons with Temporal Resolution via Dual c-Fos Staining. STAR Protocols. 1 (3), 100153(2020).
  21. Nakahara, T. S., et al. Detection of pup odors by non-canonical adult vomeronasal neurons expressing an odorant receptor gene is influenced by sex and parenting status. BMC biology. 14 (1), 12(2016).
  22. Carvalho, V. M. A., et al. Lack of spatial segregation in the representation of pheromones and kairomones in the mouse medial amygdala. Frontiers in Neuroscience. 9, 1-19 (2015).
  23. Carvalho, V. M. A., et al. Representation of Olfactory Information in Organized Active Neural Ensembles in the Hypothalamus. Cell Reports. 32 (8), 108061(2020).
  24. Papes, F., Nakahara, T. S., Camargo, A. P. Behavioral assays in the study of olfaction: a practical guide. Methods in Molecular Biology, v1820: Olfactory receptors. , 289-388 (2018).
  25. Jiang, Y., Gong, N. N., Hu, X. S., Ni, M. J., Pasi, R., Matsunami, H. Molecular profiling of activated olfactory neurons identifies odorant receptors responding to odors in vivo. Nature Neuroscience. 18, 1446-1454 (2015).
  26. Von Der Weid, B., et al. Large-scale transcriptional profiling of chemosensory neurons identifies receptor-ligand pairs in vivo. Neuroscience. 18 (10), (2015).

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